Az agyban végrehajtott uroguanilin-fellépés csökkenti az elhízott egerek súlygyarapodását különböző efferens autonóm utak révén

Absztrakt

A bél-agy tengely nagy jelentőséggel bír az energia homeosztázis szabályozásában. Az uroguanilin (UGN), a belekben felszabaduló peptid, amelyet tápláltsági állapot és anorektikus hatások szabályoznak, mint a guanilil-cikláz 2C receptor endogén liganduma új rendszert tárt fel az energiaegyensúly szabályozásában. Megmutattuk, hogy az UGN krónikus központi infúziója csökkenti a súlygyarapodást és az adipozitást az étrend okozta elhízott egerekben. Ezek a hatások függetlenek voltak a táplálékfelvételtől, és specifikus efferens autonóm utakat érintettek. Egyrészt az agy UGN a szimpatikus idegrendszer stimulálásával a barna zsírszövet termogenezisét, valamint a barnulást és a lipid mobilizációt indukálja a fehér zsírszövetben. Másrészt az agy UGN a vagus idegen keresztül növeli a széklet kimenetét. Ezek a megállapítások relevánsak, mivel azt sugallják, hogy az UGN szimpatikus idegrendszeren keresztüli jótékony metabolikus hatása nem jár nemkívánatos gyomor-bélrendszeri káros hatásokkal, például hasmenéssel. Jelen munka mechanisztikus betekintést nyújt abba, hogy az UGN hogyan befolyásolja az energia homeosztázisát, és azt sugallja, hogy az agyban az UGN hatása megvalósítható farmakológiai célpontot jelent az elhízás kezelésében.

Bevezetés

Az étkezés elfogyasztása után a tápanyagok jelenléte a gyomor-bél traktusban komplex idegi és hormonális reakciókat indít el, amelyek jeleket küldenek az agynak a táplálkozási állapot folyamatos változásáról. Az agy kommunikációjára használt különféle stratégiák közül a bél szekretál peptideket, amelyek afferens idegrostok vagy a keringés útján jutnak el a központi idegrendszerhez (CNS) (1,2). Új bélhormonokat fedeznek fel folyamatosan, és a ghrelin kivételével, amely az egyetlen peptid hormon, amely elősegíti a súlygyarapodást és az adipozitást, mindegyikük negatív energiaegyensúlyhoz kapcsolódik, és így potenciális célpont az elhízás kezelésében (3, 4).

Az egyik legutóbb felfedezett bélhormon az uroguanilin (UGN), egy 16 aminosavból álló peptid, amely főleg a nyombél epithelsejtjeiből szekretálódik. Az UGN prohormonként (pro-UGN) szintetizálódik, amely egy még ismeretlen enzim által történő hasítás után aktív UGN-vé alakul (3,5). Mind a pro-UGN, mind az UGN aktiválja a guanilát-cikláz 2C-receptort (GUCY2C), amelyet hasmenéses baktériumok hőstabil enterotoxinok (ST) is megcéloznak (6). A GUCY2C aktiválása a ciklikus guanozin-monofoszfát megemelkedett intracelluláris szintjéhez vezet (7), amely gerinctelen fajoknál bebizonyosodott, hogy megváltoztatja az élelmiszer-viselkedést és az energia-egyensúly szabályozását (8,9). Az éheztetett és leptinhiányos egerekben csökkent a keringő UGN szint, de az etetés vagy exogén leptin infúzió után helyreállt (10), ami arra utal, hogy az UGN-t táplálkozási állapot szabályozza leptin-függő módon.

Egy korábbi tanulmány (11) azt javasolta, hogy a GUCY2C aktiválása az emlősök energiamérlegének szabályozásában is releváns legyen. Egerekben a pro-UGN a tápanyagok bevitele után azonnal felszabadul a bélből, és a hipotalamuszon belül aktív UGN-vé alakul, ezáltal aktiválva a GUCY2C-t és csökkentve az élelmiszer-bevitelt (11). Ezekkel az eredményekkel összhangban a GUCY2C farmakológiai stimulálása gátolta az elhízott egerek etetését, és a GUCY2C hiányában szenvedő egerek hiperfágikusak és hajlamosabbak a metabolikus szindróma kialakulására (11).

Az UGN iránti kezdeti lelkesedés ellenére ezeket az új és ígéretes eredményeket a közelmúltban egy másik jelentés (12) vitatta, jelezve, hogy az UGN vagy az ST-k központi beadása nem változtatja meg a táplálékbevitelt vagy a testsúlyt sovány patkányokban, és hogy a GUCY2C kiütési egerek nem a testtömeg vagy a glükóz metabolizmusának eltérései a vad típusú (WT) egerekhez képest. Valójában ez a jelentés (12) csak a testtömeg, az adipozitás és a glükóz intolerancia mérsékelt növekedését állapította meg, amikor az UGN-hiányos egereket magas zsírtartalmú étrenddel (HFD) táplálták.

Mivel az UGN pontos szerepe az energia homeosztázis szabályozásában ellentmondásos, és az UGN farmakológiai hatékonysága az elhízásban továbbra sem ismert, jelen munka célja a következő volt:

1) annak megvizsgálása, hogy az UGN krónikus expozíciója hatékony-e az elhízás farmakológiai kezelésének az energia homeosztázis fontos paraméterein - például táplálékbevitelen, energiafogyasztáson vagy tápanyagmegosztáson keresztül - végzett tevékenysége révén;

2) az UGN metabolikus működésében szerepet játszó molekuláris alapok boncolgatása.

Kutatási tervezés és módszerek

Állatok és diéták

Kezelések és műtétek

Az egereket ketamin (8 mg/testtömeg-kg) és xilazin (3 mg/testtömeg-kg) intraperitoneális injekcióval altattuk. Az intracerebroventrikuláris kanüleket sztereotaxikusan ültettük be az egerekbe, amint azt korábban leírtuk (16). Az állatok intracerebroventrikulárisan kapták vivőanyagot (sóoldat), α – melanocita-stimuláló hormont (MSH; 3 µg/egér; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) vagy UGN-t (10 vagy 25 μg/egér; Bachem, Bubendorf, Svájc). ). Az UGN krónikus központi hatásainak értékeléséhez katétert csatlakoztattunk az agy infúziós kanüljétől egy ozmotikus mikropumpa áramlás-moderátorhoz (25 µg/egér/nap). Tompa boncolás segítségével létrehoztunk egy szubkután zsebet a hátsó felületen, ahová beillesztettük az ozmotikus mikropumpát (1007D ALZET Osmotic Pumps modell; Durect, Cupertino, CA). Ezeknek a pumpáknak az áramlási sebessége 0,5 µL/h volt a kezelés 7 napja alatt. A műtét után az egereket varrták és melegen tartották, amíg teljesen felépültek. A perifériás kezelésekhez az egerek intraperitoneálisan adták be az UGN-t (25 µg/egér).

A műtéti vagotómiát (VGX) a korábban leírtak szerint hajtottuk végre (17,18). Ketamin-xilazin altatásban az egereket a hátukra helyezték, és középvonalas hasi bemetszést végeztek. A májat ezután gondosan jobbra mozgatták, így a nyelőcső láthatóvá vált. A vagus ideg háti és ventrális ágait feltárták és levágták a nyelőcsőről. Az ideg minden ágát sebészeti varratokkal két lehető legdisztálisabban összekötöttük a vérzés megelőzése érdekében, majd a varratok között cauterizáltuk. A hasi izmokat és a bőrt ezután műtéti selyemmel varrták össze. Ál-műtéteket is végeztek, amelyek során az ideg minden törzsét kitették, de nem kötötték össze vagy nem cauterizálták. A VGX hatékonyságát 3 héttel a műtét után értékelték postmortem gyomormegfigyeléssel, a VGX után a gyomor méretének nyilvánvaló növekedésével (motoros diszfunkció miatt) a terápia sikerének jeleként (az adatokat nem közöljük). Csak az eredményesen terápiás egereket vonták be az elemzésbe. Az ozmotikus minipumpákat és az intracerebroventrikuláris kanüleket két héttel a VGX után ültettük be.

A β3-AR farmakológiai inaktiválását az SR59230A specifikus antagonista (Tocris Bioscience) szubkután beadásával hajtották végre 3 mg/kg dózisban (19).

Testösszetétel és indirekt kalorimetria

A testösszetételt (zsírtömeg) magmágneses rezonancia képalkotó rendszerrel értékeltük (Teljes testösszetétel-analizátor; EchoMRI, Houston, TX). A méréseket a műtét előtt és a kezelés utolsó napján hajtották végre. Az intracerebroventrikuláris kezelés során 7 napos időtartam alatt az egereknek kalorimetriás rendszer segítségével (LabMaster; TSE Systems) elemezték az energiafogyasztást, a légzési hányadost (RQ) és a mozgásszervi aktivitást (16).

Fehérjekivonás és Western Blot

Hisztomorfológia

A BAT és a WAT hisztomorfológiai szerkezetének tanulmányozásához hematoxilin-eozin festést végeztünk szövetszelvényekben. Röviden: a BAT és WAT mintákat 24 órán át 10% -os formalin pufferban rögzítettük, majd dehidratáltuk és paraffinba ágyazottuk egy szokásos eljárással. 3 μm-es metszeteket készítettünk mikrotommal, és a festést standard Hematoxylin/Eosin Alcoholic (Bio-Optica) eljárással hajtottuk végre a gyártó utasításainak betartásával (20). A metszeteket Provis AX70 mikroszkóppal (Olympus, Tokió, Japán) figyeltük meg és fényképeztük le. A BAT-ra vonatkozó digitális képeket az ImageJ szoftverrel (Nemzeti Egészségügyi Intézetek) számszerűsítettük.

Immunhisztokémia

Az UCP1 kimutatását BAT-ban és WAT-ban anti-UCP1 alkalmazásával (1: 500; Abcam, Cambridge, Egyesült Királyság) végeztük, a korábban leírtak szerint (19). A képeket XC50 digitális fényképezőgéppel (Olympus) fényképezték.

Valós idejű PCR

Az RNS-t a zsírszövetből izoláltuk TRIzol Reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA) alkalmazásával, a gyártó utasításainak megfelelően (18). A kivont teljes RNS-t DNS-kezeléssel tisztítottuk, DNS-mentes készlet alkalmazásával templátként (Ambion; Thermo Fisher Scientific, Grand Island, NY), hogy az első szálú cDNS-eket nagy kapacitású cDNS reverz transzkripciós készlet alkalmazásával állítsuk elő (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornia). A kvantitatív valós idejű PCR-t egy StepOnePlus Instrument (Applied Biosystems) alkalmazásával, specifikus TaqMan kvantitatív RT-PCR primerekkel és próbákkal végeztük. Az oligonukleotid-specifikus primereket az 1. kiegészítő táblázat sorolja fel. Az adatok elemzéséhez hipoxantin-foszforibozil-transzferázt alkalmaztak endogén kontrollként, és az expressziós szinteket a mintacsoportban a kontrollcsoport átlagához viszonyítva fejeztük ki.