Az alacsony rosttartalmú étrend okozta székrekedés enyhítése a probiotikus Bifidobacterium bifidum G9-1 segítségével a bél mikrobiota dysbiosisának korrekcióján alapul

Yutaka MAKIZAKI

1 K + F Központ, Biofermin Pharmaceutical Co., Ltd., Kobe, Hyogo, Japán

Ayako MAEDA

1 K + F Központ, Biofermin Pharmaceutical Co., Ltd., Kobe, Hyogo, Japán

Yosuke OIKAWA

1 K + F Központ, Biofermin Pharmaceutical Co., Ltd., Kobe, Hyogo, Japán

Saya TAMURA

1 K + F Központ, Biofermin Pharmaceutical Co., Ltd., Kobe, Hyogo, Japán

Yoshiki TANAKA

1 K + F Központ, Biofermin Pharmaceutical Co., Ltd., Kobe, Hyogo, Japán

Shunji NAKAJIMA

1 K + F Központ, Biofermin Pharmaceutical Co., Ltd., Kobe, Hyogo, Japán

Hideki YAMAMURA

1 K + F Központ, Biofermin Pharmaceutical Co., Ltd., Kobe, Hyogo, Japán

Absztrakt

A székrekedés, az emésztőrendszer funkcionális rendellenessége gyakori gyermekeknél és felnőtteknél, és ronthatja a beteg életminőségét. Mivel sok beteg nincs megelégedve a meglévő terápiák hatékonyságával, ebben a vizsgálatban a Bifidobacterium bifidum G9-1 (BBG9-1) probiotikum hatékonyságát vizsgáltuk alacsony rosttartalmú étrend okozta székrekedésben. Patkányokban székrekedés kiváltása alacsony rosttartalmú étrend táplálásával a patkányokat 14 nap alatt alacsony rosttartalmú étrendet etették BBG9-1-el keverve, hogy meghatározzák a BBG9-1 hatásosságát a székrekedés enyhítésére. A BBG9-1 jelentősen enyhítette az alacsony rosttartalmú étrend által kiváltott diszbiózist és javította a széklet számát, a széklet tömegét és a széklet víztartalmát. Ezenkívül javította a szerves sav koncentrációját a vakbél tartalmában. Ezek az eredmények arra utaltak, hogy az alacsony rosttartalmú étrend okozta székrekedésben a BBG9-1 enyhítheti a dysbiosist és a székrekedést, és javíthatja a bélkörnyezetet, támogatva annak lehetséges alkalmazását a székrekedés kezelésében.

BEVEZETÉS

A mai napig számos tanulmány javasolta a bélflóra bevonását a különböző hasi tünetek kialakulásába, és a dysbiosist megerősítették székrekedésben szenvedő betegeknél [8, 9]. Székrekedés tünetei figyelhetők meg székrekedéses betegekből származó székletflórával átültetett egereknél, és beszámoltak arról, hogy a bélflóra is szerepet játszik a székrekedés kialakulásában [10]. A probiotikumok olyan élő mikroorganizmusok, amelyek megfelelő mennyiségben beadva egészségügyi előnyökkel járnak a gazda számára [11]. Valójában beszámoltak arról, hogy a probiotikumok javítják a bélflórát a különböző betegségekben szenvedő betegeknél [12], és enyhítik a székrekedés tüneteit [13]. A probiotikumok részletes hatásait a székrekedés dysbiosisára azonban nem írták le.

A probiotikum, a Bifidobacterium bifidum G9-1 (BBG9-1) hasznosnak bizonyult a székrekedés enyhítésére alacsony rosttartalmú étrenddel etetett patkányokban [14], és több évtizede bélgyógyszerként használják. Annak ellenére, hogy a BBG9-1 hatását a bélflóra hatására megvizsgálták, az elemzést tenyésztési módszerekkel hajtották végre, és részletes információkat, például a következő generációs szekvenálással végzett elemzést nem sikerült beszerezni.

Ezért ebben a tanulmányban arra törekedtünk, hogy tisztázzuk a BBG9-1 hatékonyságát az NTC-ben és annak hatását a bélflóra felé egy következő generációs szekvenálással olyan székrekedési modell alkalmazásával, amely tükrözi az elégtelen élelmi rost okozta székrekedést.

ANYAGOK ÉS METÓDUSOK

Baktériumok

Szárított BBG9-1-et (életképes sejtszám: 1,94x1011 CFU/g) használtunk ebben a kísérletben. Száraz bakteriális port a Biofermin Pharmaceutical cégtől (Kobe, Japán) szereztünk be.

Állatok

Hat hetes hím Sprague Dawley patkányokat vásároltunk a Japan SLC-től (Hamamatsu, Japán), és 1 hétig akklimatizáltuk őket a kísérletben történő felhasználás előtt. Az állatokat külön-külön, rozsdamentes acélból készült, 5 egységes ketrecekben (CL-02036, Sz 755 × M 210 x Ma 170 mm; CLEA Japan, Inc., Tokió, Japán) helyeztük el specifikus kórokozóktól mentes körülmények között szobahőmérsékleten (22 ± 3 ° C). C) és páratartalma 55% ± 15%, 12 órás világos/sötét ciklus mellett (07: 00-19: 00). Ezenkívül a CE-2 porított étrendet (CLEA Japan) szokásos étrendként ad libitum adták, a csapvíz pedig szabadon elérhető volt egy vízellátó palackból. Valamennyi vizsgálatot a Biofermin Pharmaceutical állatkísérleti irányelvei szerint végeztük, miután a Biofermin Pharmaceutical állatkísérleti bizottsága jóváhagyta (jóváhagyási szám: 132-005).

A székrekedés kiváltása és értékelése

A székrekedést a normál takarmányon alapuló, alacsony rosttartalmú étrend (CE-2; 1. táblázat) 3 napos táplálásával indukálták. A székrekedés kiváltása után a kontrollcsoportot 10% dextrinporral és alacsony rosttartalmú étrend-takarmánnyal kevert étrenddel, a BBG9-1 csoportot pedig 10% -os BBG9-1 száraz baktériumporral és alacsony rosttartalmú diétás takarmánnyal táplálták. A normál csoportot CE-2 takarmánnyal etették a tesztidőszak alatt. A székrekedést a széklet paramétereinek (széklet száma, súlya és víztartalma) mérésével értékelték. A BBG9-1 beadásának 14. napján a vakbélt izoflurán altatásban eltávolították, és a vakbél tartalmát folyékony nitrogénnel gyorsan lefagyasztották, és elemzésig -80 ° C-on tárolták.

Asztal 1.

ÖsszetevőkVersenyek (%) CE-2 (normál étrend) Alacsony rosttartalmú étrend

Nedvesség	8.89	9.00
Nyers fehérje	24.88	24.90
Nyers zsír	5.03	3.90
Nyersrost	4.63	0,90
Nyers hamu	6.79	6.00
Nitrogénmentes kivonat	49,78	55.30

A széklet számának és tömegének mérése

A napi ürülék számát és súlyát a 3. és a 14. nap között mértük az összes ürülékkel, amelyek minden egyes 24 órás periódusban ürültek ki, minden nap 10:00 órával.

A széklet víztartalmának mérése

A széklet víztartalmát a hasüreg enyhe összenyomásával ürített friss ürülék összegyűjtésével határoztuk meg. A széklet tömegének mérése után a mintákat 24 órán át 90 ° C-on szárítottuk, és a nedvességtartalmat kiszárítottuk a szárítás előtti és utáni tömegváltozás alapján.

A vakbéltartalom pH-jának mérése

9 × ioncserélt vízben szuszpendált vakbéltartalom pH-ját pH-mérővel mértük (D-54, Horiba, Kiotó, Japán).

Szerves savkoncentrációk mérése a vakbéltartalomban

A szerves savak koncentrációját a vakbéltartalomban Nagano és munkatársai módszerével mértük. [15].

A vakbéltartalom mikrobiológiai elemzése

A mikrobiota tanulmányozásához átfogó 16S rRNS-szekvencia-elemzést végeztek. A cecalis tartalomból a DNS-t gyöngy-fenol módszerrel extraháltuk. A 16S rRNS gén V3 – V4 régiójának szekvenciaelemzését a MiSeq platform alkalmazásával, Fadrosh és mtsai. [16]. Ezután a MiSeq-től kapott szekvenciaolvasási adatok elemzését végeztük a QIIME pipeline segítségével [17]. A leolvasásokat fastq-join segítségével egyesítettük, és a minőségi szűrést (QV ≥ 25) az USEARCH v 6.1 alkalmazásával hajtottuk végre. A szűrésen és a kiméra olvasási ellenőrzésen átesett olvasási adatokat felhasználták a flóra elemzéséhez. Véletlenszerűen kivettünk 5000 olvasmányt mintánként, és létrehoztunk egy operatív taxonómiai egységet (OTU), amelynek 97% -os homológiája volt a küszöbérték, az USEAECH segítségével. Homológiakeresést végeztünk az OTU reprezentatív szekvenciáján az UCLUST segítségével, és azonosítást végeztünk az egyes olvasások sorrendjéig.

Az egyes minták bélmikroflóra-összetételének (Bray-Curtis távolság) kiszámítását az R statisztikai elemző szoftver vegdist funkciójával (vegán csomag) hajtottuk végre. A kapott érték alapján elvi koordinátanalízist (PCoA) a dsv.pco függvény.

Statisztikai analízis

A kapott kísérleti eredményeket átlag ± standard hibákként fejeztük ki. Minden csoportban elvégeztünk egy tesztet a normalitásra, és Bartlett-teszt segítségével teszteltük a varianciát, ha normális eloszlást figyeltünk meg. Egyenlő variancia esetén az adatokat Tukey-Kramer tesztekkel teszteltük. Ha a varianciák egyenlőtlenül oszlottak el, vagy ha nem figyeltek meg normális eloszlást, az adatokat Steel-Dwass tesztekkel teszteltük. A 0,05-nél kisebb p értékű eredményeket szignifikánsnak tekintettük.

EREDMÉNYEK

A BBG9-1 hatása a széklet paramétereire

A kontroll csoportban az ürülék száma és súlya az 1. naptól számítva szignifikánsan csökkent a normál csoportéhoz képest. A BBG9-1 csoportban a széklet számának szignifikáns növekedése volt a 11–14. Napon (1a. Ábra) és a széklet tömegének szignifikáns növekedése a 14. napon (1b. Ábra) összehasonlítva a kontrollcsoportéval. Ezenkívül a BBG9-1 csoportban a széklet víztartalma minden nap szignifikánsan nőtt a kontroll csoportéhoz képest (1c. Ábra).