Az AMP-aktivált protein-kináz metforminnal történő aktiválása megszünteti az angiotenzin II által indukált endoplazmatikus retikulum stresszt és magas vérnyomást egerekben in vivo

Molekuláris és Transzlációs Orvostudományi Központ, Georgia State University, Atlanta, GA, USA

Kardiológiai osztály, Belgyógyászati osztály, Tongji Kórház, Tongji Orvosi Főiskola, Huazhong Tudományos és Technológiai Egyetem, Wuhan, Kína

Molekuláris és Transzlációs Orvostudományi Központ, Georgia State University, Atlanta, GA, USA

Levelezés Ping Song, Molecular and Translational Medicine Központ, Georgia State University, 157 Decatur Street SE, Atlanta, GA 30303, USA. E-mail: [email protected] További cikkek keresése a szerzőtől

Molekuláris és Transzlációs Orvostudományi Központ, Georgia State University, Atlanta, GA, USA

Kardiológiai osztály, Belgyógyászati osztály, Tongji Kórház, Tongji Orvosi Főiskola, Huazhong Tudományos és Technológiai Egyetem, Wuhan, Kína

Molekuláris és Transzlációs Orvostudományi Központ, Georgia State University, Atlanta, GA, USA

Absztrakt

Háttér és cél

A metformin, a 2-es típusú cukorbetegség egyik leggyakrabban felírt gyógyszere, állítólag BP-csökkentő hatást fejt ki cukorbetegeknél. A metformin BP-re gyakorolt hatásait és mögöttes mechanizmusait azonban nem diabéteszes körülmények között még meg kell határozni. Jelen vizsgálat célja a metformin angiotenzin II (Ang II) infúzióval indukált magas vérnyomásra gyakorolt hatásainak meghatározása volt. in vivo.

Kísérleti megközelítés

A metformin BP-re gyakorolt hatásait vad típusú (WT) C57BL/6J egerekben és AMP-aktivált protein-kináz α2 (AMPKα2) hiányában szenvedő egerekben vizsgálták Ang II infúzióval vagy anélkül. A metformin hatását az Ang II által indukált endoplazmatikus retikulum (ER) stresszre is feltártuk tenyésztett humán vaszkuláris simaizomsejtekben (hVSMC).

Főbb eredmények

A metformin szignifikánsan csökkentette a BP-t az Ang II-vel infúzióban lévő WT egerekben, de az AMPKα2-hiányos egerekben nem. Tenyésztett hVSMC-kben az Ang II kezelés az AMPK inaktiválását, valamint az ezt követő splicizált X-box kötő fehérje-1 indukcióját, az eukarióta transzlációs iniciációs faktor 2α foszforilezését és a glükóz-szabályozott fehérje 78 kDa expresszióját eredményezte, ami három jól jellemezte az ER stressz biomarkereit. Ezenkívül a metforminnal végzett AMPK-aktiváció ablálja az Ang II-indukálta ER stresszt a hVSMC-kben. Mechanikusan a metforminnal aktivált AMPKα2 a foszfolamban-foszforiláció növelésével elnyomta az ER stresszt.

Következtetés és következmények

A metformin enyhíti az egerekben az Ang II által kiváltott magas vérnyomást az AMPKα2 aktiválásával, amely közvetíti a foszfolamban foszforilációt és gátolja az Ang II által kiváltott ER stresszt a vaszkuláris simaizomsejtekben.

Rövidítések

Bevezetés

Az AMP-aktivált protein-kináz (AMPK) az emlős szövetekben a sejtek anyagcseréjének és a redoxi egyensúlyának központi szabályozója (Song és Zou, 2012). Az érrendszeri AMPK komplex három alegységből áll, az α, β és γ alegységekből (Song és Zou, 2012). Az AMPKα2 hiány aberráns ER stresszt okoz az endothel sejtekben, ami endotheliális diszfunkciót és felgyorsult aterogenezist eredményez a nyugati diétával táplált apolipoprotein E knockout egerekben (Dong et al., 2010a). Az AMPK aktiválása gátolja az LDL által kiváltott ER stresszt az endotheliumban in vitro és egereknél in vivo (Dong et al., 2010b). Ezenkívül az AMPKα2 deléció aberrált ER stresszhez vezet a VSMC-kben és az azt követő magas BP (Liang et al., 2013), megerősítve azt az elképzelést, hogy az AMPKα2 és fiziológiásan elnyomja az ER stresszt elengedhetetlen a normális vaszkuláris tónus fenntartásához.

Tőlünk és másoktól származó publikált munka azt jelzi, hogy a metformin terápiás hatásait az AMPK aktiválásával fejti ki (Zheng et al., 2013; Cho et al., 2015). A metformin elnyomja a palmitát által kiváltott ER stresszt a patkány inzulinoma sejtekben (Simon-Szabo et al., 2014), és a magas zsírtartalmú étrend okozta elhízott egereknél is helyreállítja az endothelium működését az ER stressz tompításával (Cheang et al., 2014). Az AMPK gátlás túlzott ER stresszt eredményez a spontán hipertóniás patkányok carotisjában (Liu et al., 2015), míg az 5-aminoimidazol-4-karboxamid ribonukleotid (AICAR) paeonol vagy berberin általi AMPK-aktiváció elnyomja az ER stresszt az egér aortákban és a patkány nyaki artériákban (Liang et al., 2013; Liu et al., 2015; Choy et al., 2016). Az Ang II infúzió okozta magas vérnyomás jelenlegi megértése alapján arra kerestük a választ, hogy szükséges-e az AMPK által elnyomott ER stressz a metformin BP-csökkentő hatásaihoz. Itt arról számolunk be, hogy az Ang II által indukált aberrált ER stressz a VSMC-kben hozzájárul a BP emelkedéséhez, és hogy a metformin az AMPKα2 aktiváció által kiváltott ER stressz elnyomásán keresztül hat a VSMC-kben az alacsonyabb Ang II által indukált magas BP-re egerekben.

Mód

Állatok

Minden állatgondozási és kísérleti eljárást a Georgia Állami Egyetem Intézményi Állatgondozási és Felhasználási Bizottsága hagyott jóvá. Állatkísérleteket az ARRIVE irányelveknek (Kilkenny et al., 2010; McGrath és Lilley, 2015). Azokat az egereket, amelyekben hiányzik az AMPKα1 (AMPKα1 -/-) vagy az AMPKα2 (AMPKα2 -/-) hiány, Jorgensen leírása szerint et al., (2004). A vad típusú (WT) C57BL/6J, AMPKα1 -/- és AMPKα2 -/- egereket (10-12 hetesek) + altattuk, majd Ang II-t vagy hordozót tartalmazó ozmotikus minipumpákkal ültettük be őket az egerek hátán lévő bőr alá., amint azt korábban leírtuk (Wu et al., 2015). Az egereket folyamatosan infundáltuk Ang II-vel (0,8 μg · g -1 -1 nap -1, 14 nap) vagy hordozóval (fiziológiás sóoldat). Ugyanezen a napon az egerek felét metforminnal kezelték (300 mg/kg -1 testsúly/nap ivóvízben) vagy AICAR-nal (500 mg/kg -1 testtömeg, napi egy ip injekció 14 napig, sóoldat) mint jármű). A BP-t mind a carotis katéteres módszerrel, mind a korábban leírt radiotelemetriai módszerrel mértük (Liang et al., 2013). Az egereket szabályozott hőmérsékletű ketrecekben helyezték el 12 órás világos-sötét ciklus alatt, szabad hozzáférést biztosítottak a vízhez és rendszeres rágcsáló-étrendhez.

Sejtkultúra

Humán VSMC-ket (hVSMC) (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) M231 táptalajon (Cascade Biologics, Portland, OR, USA) tenyésztettünk 10% FBS-sel, penicillinnel (100 Eg · ml –1) és sztreptomicinnel (100 μg) kiegészítve. · Ml −1). Az összes sejtet 37 ° C-on, 5% CO2 és 95% levegő nedvesített atmoszférában inkubáltuk. A sejteket 70–80% -os összefolyásig növesztettük, mielőtt a különböző szerekkel kezeltük volna.

Western blot elemzés

A sejt lizátumokat Western blot analízisnek vetettük alá, a korábban leírtak szerint (Song et al., 2009). A fehérjetartalmat a BCA protein assay reagenssel határoztuk meg (Pierce Chemical Co., Rockford, IL, USA). A fehérjéket (20 μg) SDS-PAGE-vel elválasztottuk, majd membránra helyeztük. A membránt inkubáltuk primer antitest 1: 1000 hígításával, majd tormaperoxidázzal konjugált szekunder antitest 1: 5000 hígításával. A fehérjetsávokat fokozott kemilumineszcenciával (ECL) tették láthatóvá (Pierce Chemical Co.).

Immunhisztokémia

Az egér aortáját és a mesenterialis artériát boncoltuk, 4% paraformaldehidben rögzítettük 24 órán át, és paraffinba ágyazottuk. A metszeteket paraffinmentesítettük, rehidratáltuk és mikrohullámú citrát pufferben végeztük az antigén visszanyerését. A metszeteket egymást követően inkubáltuk endogén peroxidáz és lúgos foszfatáz blokk pufferben (Dako, Glostrup, Dánia), fehérje blokk pufferben és primer antitestekben, amelyeket egy éjszakán át inkubáltunk 4 ° C-on. Mosási pufferben végzett öblítés után a metszeteket jelölt polimer-torma-peroxidáz egér- vagy nyúlellenes antitestekkel és 3,3'-diaminobenzidin (DAB) kromogénnel inkubáltuk, a korábban leírtak szerint (Ding et al., 2016). Utolsó mosás után a szakaszokat haematoxilinnel ellenfestettük.

Adatok és statisztikai elemzés

A tanulmány adatai és statisztikai elemzései megfelelnek a farmakológiai kísérleti tervezésre és elemzésre vonatkozó ajánlásoknak (Curtis et al., 2015). Az adatokat átlagértékekként adtuk meg ± SD. Az eloszlás normalitását a GraphPad Prism 5 elemző szoftverrel (La Jolla, Kalifornia, USA) értékeltük, és minden adatot normális eloszlásúnak találtunk. A csoportok közötti különbségeket szignifikáns különbségek szempontjából értékeltük a Student segítségével t-Teszt párosítatlan adatokra vagy egyirányú ANOVA a Bonferronival post hoc teszt. Az összes többi eredményt kétfarkú Student segítségével elemeztük t-Teszt két csoport összehasonlítására. Értékei P

Anyagok

Az összes AMPKα, AMPKα1, AMPKα2, foszfo-AMPKα (T172; 40H9, 2535), foszfo-eukarióta transzlációs iniciációs faktor 2α (eIF2α) és foszfo-foszfolamban (S16/T17; 8496) ellen antitesteket a Cell Signaling Technology-tól (Danvers, MA, USA). Az illesztett X-box-kötő protein-1 (XBP1) elleni antitesteket a Biolegend-től (San Diego, Kalifornia, USA) szereztük be. A Lys-Asp-Glu-Leu (KDEL) elleni antitesteket az Enzo Life Sciences-től (Farmingdale, NY) szereztük be. A foszfolamban (PLB) elleni antitesteket a Santa Cruz Biotechnology, Inc.-től (Santa Cruz, Kalifornia) szereztük be. Az ozmotikus minipumpákat az Alzet-től (Palo Alto, Kalifornia, USA) szereztük be. A tauroursodeoxycholic acid (TUDCA) és a C vegyület Calbiochem-től (San Diego, CA, USA) származik. Az AICAR-t a Toronto Research Chemicals, Inc.-től (Toronto, Kanada) vásároltuk. Minden más vegyi anyagot, hacsak másképp nem írjuk elő, a Sigma-Aldrich-től (St. Louis, MO).

Célok és ligandumok nomenklatúrája

Az ebben a cikkben szereplő kulcsfontosságú fehérje-célpontok és ligandumok a http://www.guidetopharmacology.org, az IUPHAR/BPS PHARMACOLOGY Guide (Southan et al., 2016), és végleg archiválják a FARMAKOLÓGIA Tömör útmutatójában (2015/16.) (Alexander et al., 2015a, b).

Eredmények

A metformin csökkenti az Ang II által kiváltott magas vérnyomást a C57BL/6J egerekben

Az Ang II által kiváltott magas vérnyomás modellje megismétli az emberi esszenciális magas vérnyomás legfontosabb jellemzőit (Te Riet et al., 2015). Először értékeltük az Ang II infúzió (0,8 μg · g −1 · nap −1 14 napig) hatását a szisztolés (sBP) és a diasztolés BP (dBP) hatására egerekben. A korábbi jelentésekkel összhangban (Liang et al., 2013), az Ang II infúzió jelentős növekedést okozott mind az sBP-ben, mind a dBP-ben felnőtt C57BL/6J vad típusú (WT) egerekben a vivőanyag (sóoldat) infúzióhoz képest (1A – C. Ábra). Érdekes, hogy a metforminnal végzett kezelés nem változtatta meg a BP-t a járművel infúziós egerekben, de csökkentette az sBP-t és a dBP-t az Ang II-vel infúziós egerekben.

Az Ang II ER stresszt indukál egerekben és hVSMC-kben

A metformin kiküszöböli az Ang II által kiváltott ER stresszt a hVSMC-kben

Az AMPK inaktiválása ER stresszt indukál a hVSMC-kben

Legközelebb teszteltük az AMPK inaktiváció hatását az ER stresszre. A C vegyület, széles körben használt AMPK inhibitor (Jin et al., 2009), egyértelműen megemelte az ER stressz biomarkerek szintjét, és tovább fokozta az Ang II által közvetített ER stresszt a hVSMC-kben (4A, B ábra). Az AMPKα1-specifikus siRNS által végzett hVSMC-k leütése az ER-stressz mérsékelt növekedéséhez vezetett. Az AMPKα2-specifikus siRNS által végzett AMPKα2 leütés azonban jelentősen indukálta az ER stresszt, amit a p-eIF2α, a fehérje-diszulfid-izomeráz és az XBP1-ek fokozott expressziója mutat, összehasonlítva a kódolt siRNS-sel végzett kezelést követő szintekkel (4C ábra). Továbbá az ERP stressz az AMPKα2 -/- egerekből izolált VSMC-kben nagyobb volt, mint az AMPKα1 -/- vagy a WT egerekből izolált VSMC-kben (4D ábra). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az AMPKα2 a kritikus AMPKα izoform, amely szabályozza az ER stresszt a VSMC-kben, és hogy az AMPKα2 fontosabb szerepet játszik az AMPKα1-nél az Ang II által kiváltott magas vérnyomás szabályozásában egerekben.

Az Ang II által indukált ER stressz metforminnal történő gátlása az AMPKα2 függvénye

Ezt követően azt vizsgáltuk, hogy a metformin védőmechanizmusa függ-e az AMPKα2-től. Amint a 4E. Ábra mutatja, az AMPKα2 siRNS, de nem összekevert siRNS, ER stresszt eredményezett a hVSMC-kben, összhangban az AMPKα2 -/- mVSMC (Liang) megfigyeléseivel et al., 2013). Ezenkívül a metformin enyhítette az Ang II által indukált ER stresszt a kódolt siRNS-transzfektált hVSMC-kben, de az AMPKα2-ben nem.

A PLB foszforilációra van szükség az Ang II által kiváltott ER stressz metformin gátlásához

Az intracelluláris Ca 2+ emelkedése az ER stressz aberráns aktiválásában szerepet játszó közös mechanizmus, és az intracelluláris Ca 2+ változásait a szarkoplazmatikus/ER Ca 2+ ‐ATPáz (SERCA) aktivitása szabályozza (Dong et al., 2010a). A nem foszforilezett PLB kölcsönhatásba lép a SERCA-val és gátolja annak aktivitását (Chen et al., 2007); azonban a PLB foszforilezésével a SERCA normálisan működik és fenntartja az ER Ca 2+ szintjét (Koss és Kranias, 1996). Ezért a következő lépésben megvizsgáltuk a PLB jelentőségét az Ang II által közvetített ER stressz metformin általi gátlásában. Az Ang II dózisfüggően csökkentette a PLB foszforilációját, de nem befolyásolta a teljes PLB fehérje szintet (5A. Ábra), míg a metformin helyreállította az Ang II kezeléssel tompított PLB foszforilációt (5B. Ábra). Ezenkívül az AMPKα2 elnémítás blokkolta az Ang II által megszakított PLB foszforiláció metformin által kiváltott gátlását (5C. Ábra). Ezenkívül a metformin elnyomta az Ang II-indukálta ER stresszt a kontrollban, összekevert siRNS-transzfektált hVSMC-ket, de nem a PLB siRNS-transzfektált hVSMC-ket (5D. Ábra), jelezve, hogy a PLB szükséges az Ang II-függő ER stressz metformin általi visszaszorításához.

Az AMPKα2 szükséges az Ang II által kiváltott magas vérnyomás metformin enyhítéséhez egerekben

A korábbi jelentésekkel összhangban (Wang et al., 2011; Liang et al., 2013), az sBP, dBP és az átlagos BP (mBP) az AMPKα2 -/- egerekben magasabb volt, mint a WT egerekben bazális körülmények között (6A – C. Ábra). A metforminnal végzett kezelés önmagában nem változtatta meg a BP-t sem WT, sem AMPKα2 -/- egerekben normál körülmények között (6A – C. Ábra). Az Ang II infúzió szignifikánsan növelte a BP-t (sBP, dBP és mBP) mind a WT, mind az AMPKα2 -/- egerekben a vivőanyag-kezeléshez képest (6A – C. Ábra). Fontos, hogy a metforminnal végzett kezelés enyhítette az Ang II által indukált sBP, dBP és mBP növekedést WT egerekben, de az AMPK α2 -/- egerekben nem (6A – C ábra), jelezve, hogy az AMPKα2 valóban elengedhetetlen az Ang II által indukált magas metformin enyhítéséhez. BP. Érdekes módon az AICAR, egy nem szelektív AMPK aktivátor (Zhang et al., 2009a), szignifikánsan csökkentette az Ang II által indukált magas sBP-t mind a WT, mind az AMPKα2 -/- egerekben, bár az AICAR normál körülmények között nem változtatta meg az sBP-t mind a WT, mind az AMPKα2 -/- egereknél (6D. Ábra).

Vita

Ebben a tanulmányban bebizonyítottuk, hogy a VSMC-kben az Ang II által indukált aberrált ER stressz hozzájárul a BP emelkedéséhez, és hogy a metformin csökkenti ezt az Ang II által kiváltott magas BP-t az AMPKα2 aktiváció által kiváltott ER stressz elnyomásával egerekben a VSMC-kben. Mechanikusan a metformin által közvetített AMPK aktiváció elősegíti a PLB foszforilációját, amely végső soron helyreállítja a SERCA aktivációja által közvetített sejtes kalcium homeosztázist, gátolja az ER stresszt és enyhíti az egerekben az Ang II által kiváltott magas vérnyomást (6E. Ábra).

A PLB a SERCA fő fiziológiai inhibitora (Koss és Kranias, 1996), és a PL 16-os foszforilációja a Ser 16-on vagy a Thr 17-nél fokozza a SERCA működését az ER kalciumszint fenntartása érdekében, csökkentve a PLB által közvetített gátlás hatékonyságát (Traister et al., 2014). Nemrégiben arról számoltak be, hogy a metformin fokozza a kardiomiociták autofágia útján történő PLB-degradációját, védő funkciót betöltve a szívekben (Teng et al., 2015). Ezenkívül az A769662 által végzett AMPK-aktiváció növeli a PLB foszforilációját a Thr 17-nél összevont femorális artériákban (Schneider et al., 2015). Ezekkel a korábbi adatokkal egyetértésben bebizonyítottuk, hogy a hVSMC-k kezelése Ang II-vel csökkentette a foszforilezett PLB szintjét. A VSMC-kben található AMPKα2 izoformára van szükség ahhoz, hogy a metformin blokkolja a PLB foszforilációjának Ang II gátlását. Az, hogy az AMPKα2 közvetlenül vagy közvetetten foszforilálja-e a PLB-t, további vizsgálatokra szorul.

Meg kell még határozni, hogy más mechanizmusok vesznek-e részt a metformin emberben a BP csökkentésére gyakorolt hatásában. Például a metformin megakadályozza a magas vérnyomást spontán hipertóniás patkányokban azáltal, hogy csökkenti az aszimmetrikus dimetilarginin (Tsai et al., 2014). A metformin csökkenti az egér podocytáiban a NAD (P) H oxidáz aktivitását, ami az oxidatív stressz csökkenéséhez vezet (Piwkowska et al., 2010). A metformin helyreállítja a glükózszint változásai által gátolt endoteliális funkciót az AMPK-függő eNOS újrakapcsolódása és a N47-phox, a NADPH-oxidáz alegységének (An et al., 2016). Az oxidatív stressz ilyen csökkentése és az endoteliális funkció helyreállítása hozzájárul a sztreptozotocin által kiváltott diabéteszes patkányokban a BP csökkenéséhez (Majithiya és Balaraman, 2006). Ezenkívül a metformin csökkenti az egerekben az Ang II-emelkedett BP-t, ami a vizelet vizeletürítésének indukciójával fordulhat elő (Deji et al., 2012). Alternatív megoldásként a metformin ezeket a hatásokat a prosztatarák sejtjeiben ER stressz indukálásával fejtheti ki (Yang et al., 2015a). Ezért e mechanizmusok további vizsgálata indokolt eredményeink fényében.

Összefoglalva, eredményeink azt mutatják, hogy az aberrált ER stressz kísérte az Ang II-mediált, magas BP kialakulását. A metformin gátolta az Ang II által kiváltott ER stresszt egy AMPKα2 – PLB – SERCA útvonalon keresztül, és ez az út új terápiás célpontot nyújthat a magas vérnyomás kezelésében.

Köszönetnyilvánítás

Ezt a tanulmányt a Nemzeti Egészségügyi Intézetek támogatásai támogatták (HL079584, HL080499, HL089220, HL110488, HL128014, HL132500, AG047776 és CA213022). Ezt a munkát részben a Georgia Kutatási Szövetség támogatta. Dr. Zou a Georgia Research Alliance kiemelkedő tudós a molekuláris orvostudományban.