Angelica sinensis Elnyomja a testtömeg-növekedést és megváltoztatja a FTO Gén magas zsírtartalmú étrenddel indukált elhízott egerekben

1 haszonállat-genetikai erőforrások feltárása és innovációja a Szecsuán tartomány Állattudományi és Technológiai Főiskolája, Szecsuán Mezőgazdasági Egyetem, Csengdu 611130, Kína

Absztrakt

A gyökere Angelica sinensis (RAS) egy hagyományos kínai orvoslás, amelyet különféle betegségek megelőzésére és kezelésére használnak. Ebben a tanulmányban értékeltük a RAS-kiegészítés testtömegre gyakorolt hatását és a FTO gén expresszió és metilációs állapot magas zsírtartalmú étrendben (HFD) indukálta az elhízott egér modellt. Az elhízott nőstény egereket az étrendben alkalmazott RAS adagolás szerint csoportokba osztották az alábbiak szerint: normál étrend, HFD étrend (HC), HFD alacsony dózisú RAS (DL), HFD közepes dózisú RAS (DM) és HFD magas dózisú dózis RAS (DH). 4 hétig tartó RAS-kiegészítés után testtömeg-elnyomás és FTO expresszió a DH egerekben szignifikánsan magasabb volt, mint a HC egerekben, míg az FTO expressziót detektáltunk DM és DL egerek között vagy utódaikban. A biszulfitszekvenáló PCR (BSP) kimutatta, hogy a CpG-sziget a FTO a promotert 95,44% -ig hipermetilálták a HC-csoportban, 91,67% -ot a DH-csoportban és 90,00% -ot a normál étrendben. A szövettani vizsgálat kimutatta, hogy a DH csoport adipocitái kisebbek voltak, mint a HC csoportban, ami jelzi a RAS potenciális szerepét az elhízásban. Ez a tanulmány azt mutatta, hogy a RAS enyhítheti a HFD által kiváltott elhízást, és hogy a molekuláris mechanizmus összefüggésbe hozható a FTO gén.

1. Bemutatkozás

Az elhízás globális egészségügyi prioritás, és az étrend okozta elhízással szembeni ellenállást számos állatmodellben tanulmányozták. A cukorban gazdag és legfeljebb 45% zsírt tartalmazó étrendet széles körben alkalmazták az elhízás kiváltására egerekben [1–3]. A tudósok azt találták, hogy néhány kínai gyógynövény, mint a berberin, a curcuma longa és Sibiraea angustata hatékonyan javíthatja az elhízást azáltal, hogy gátolja a zsírsav szintézisét, növekedését és felhalmozódását az adipocitákban [4–6]. Megvizsgálták a kínai gyógynövények funkcióit in vivo a magas zsírtartalmú étrend (HFD) által kiváltott elhízás egérmodelljeiben [7].

A gyökere Angelica sinensis (Danggui kínai nevű kínai), egy jól ismert növényi gyógyszert, történelmileg nyugtatóként vagy tonizáló szerként használtak [8, 9]. Funkcionális táplálékként a RAS gyulladás, cukorbetegség és kardiovaszkuláris rendellenességek enyhítésére is használható. Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy a Angelica sinensis a poliszacharidnak (ASP), az RAS aktív kémiai komponenseinek, vérképző hatása volt állat- és sejtmodellekben [10]. Két savas poliszacharid (APS-3b és APS-3c) jelentősen gátolta az S180 daganatok növekedését és növelte az S180 daganatos egerek élettartamát [11]. Ezenkívül az ASP antioxidáns hatása stimulálhatja a nitrogén-monoxid endotheliális termelését és ellenállhat az ischaemia/reperfúziós (I/R) sérüléseknek [12].

A kapcsolódó zsírtömeg és elhízás (FTO) a gén relatív hatást gyakorol az elhízásra [13]. FTO emberben a 16. kromoszómán helyezkedik el, és egy kettős szálú b-hélix hajtású fehérjét kódol, amely homológ a nonhém és a 2-oxoglutarát-oxigenáz szupercsalád tagjaival (amelyek elsősorban a zsírsav anyagcseréjét befolyásolják) [14]. Továbbá embereken és rágcsálókon végzett vizsgálatok azt sugallták FTO részt vesz a táplálékfelvétel szabályozásában és a lipid anyagcserében [15]. A szövettani vizsgálatok kimutatták, hogy a FTO Az mRNS és a hipotalamuszban lévő fehérje kritikus jelentőségű volt az egerek takarmányfelvételének szabályozásában [16]. A funkció elvesztése FTO egerekben posztnatális növekedési retardációhoz, valamint a zsírszövet és a sovány testtömeg jelentős csökkenéséhez vezetett [17]. A kifejezés kifejezése FTO, azonban a test és a zsír tömegének dózisfüggő növekedéséhez vezetett [18]. Ezenkívül Merkestein és munkatársai azt találták FTO befolyásolja az adipogenezist azáltal, hogy szabályozza az elhízott egerek mitotikus klonális terjeszkedésének folyamatát [19].

Jelen tanulmányban felmértük a RAS kiegészítés testtömegre gyakorolt hatását HFD egerekben. Továbbá, a mRNS expressziója és a promoter metilációs státusa FTO gént meghatároztuk a RAS hatásainak összehasonlítására a kontroll és a kezelt csoportok között. Ez a tanulmány megalapozza a RAS elhízási rezisztencia funkcióinak megértését.

2. Anyagok és módszerek

2.1. Etikai nyilatkozat

Az ebben a vizsgálatban részt vevő animákat a kísérleti állatokkal kapcsolatos ügyek igazgatására vonatkozó szabályzatnak megfelelően feláldozták, és az engedélyszámmal jóváhagyta a Kínai Szecsuán Mezőgazdasági Egyetem, Szecsuán Agrártudományi Egyetem, az Állattudományi és Technológiai Főiskola intézményi állatgondozási és felhasználási bizottsága. DKY-B20110807.

2.2. Állatok és diéták

Öt hetes nőstény KM egereket a kínai Szecsuán tartományban, a Chengdu Dossy Laboratory Animal Co., Ltd-től szereztünk be. Az egereket normál körülmények között, 1 hétig szabad táplálékhoz és vízhez jutva tenyésztették, hogy a kísérleti körülményekhez igazodjanak. Ezután az egereket véletlenszerűen a normál étrend csoportjába soroltuk (GC,

) vagy a HFD csoport (HC,

) RAS kiegészítés nélkül. 5 hét után az elhízott egereket véletlenszerűen négy csoportba osztották. Az összes csoportot folyamatosan HFD-vel etették. Az első csoport (

) a magas zsírtartalmú kontrollcsoportot (HC) jelölték ki RAS-kiegészítés nélkül. A második csoport () RAS-kiegészítést kapott 2,00 g/ttkg testtömeg mellett, és alacsony dózisú csoportnak (DL) nevezték ki. A harmadik csoport () 5,00 g/kg · testtömeg-kg RAS-kiegészítést kapott, és közepes dózisú csoportnak (DM), az utolsó csoportnak (10) pedig nagy dózisú csoportnak (DH) adták RAS-kiegészítést 10,00 g/kg-nál. · BW. A nőstény utódokat úgy kaptuk meg, hogy az egyes csoportokhoz azonos körülmények között táplált hím KM-kel pároztuk. Az étrend-képletet az 1. táblázat mutatja. A RAS-t szárítottuk és őröltük, majd hozzáadtuk az elegyhez, amelyet összegyúrtunk és 5 ml-es injektorok segítségével henger alakúvá alakítottunk. Végül az elegyet egy éjszakán át 60 ° C-on szárítottuk, majd szobahőmérsékletre történő lehűtést követően hermetikus tasakban tároltuk. A testtömeget hetente mértük. A zsírszöveteket minden csoportban 4 egérből gyűjtöttük RAS-kiegészítés után 35, 60 és 95 napig.

2.3. Teljes RNS kivonás és reverz transzkripció

Az egereket méhnyak diszlokációval leöltük, a zsírszöveteket összegyűjtöttük, folyékony nitrogénben gyorsan lefagyasztottuk, majd -80 ° C-on tároltuk. A teljes RNS-t TRIzol reagenssel (Invitrogen, CA, USA) extraháltuk. Az izolált RNS tisztaságát agarózgél-elektroforézissel határoztuk meg, és a koncentrációt az ND-2000 Nanodrop (Thermo Scientific, MA, USA) segítségével számszerűsítettük. A cDNS-t a Prime Script RT reagenskészlet (Takara, Dalian, Kína) segítségével szintetizálták a gyártó ajánlásai szerint.

2.4. A kvantitatív valós idejű PCR FTO Gén

Kvantitatív valós idejű PCR-t (qPCR) végeztünk a relatív mRNS expressziós szintek kvantifikálásához FTO a GC, HC, DL, DM és DH csoportból származó egerek zsírszövetében, valamint a DH utódokban. A qPCR-hez használt alapozó párokat (2. táblázat) az egér szerint terveztük meg FTO gén (NM_011936). A qPCR-t három példányban hajtottuk végre SYBR® Premix Ex Taq ™ II kit (Takara, Dalian, Kína) felhasználásával. Minden qPCR reakció (teljes térfogat 10 μL) 0,8-ot tartalmazott μL cDNS, 5 μL SYBR Green II, 0,8 μL primer párok és 3.4 μL ddH20. A qPCR eljárások a következők voltak: 95 ° C 3 percig, 40 ciklus 95 ° C 10 másodpercig, 30 másodperc optimális hőmérsékleten, 72 ° C 10 másodpercig, és egy végső meghosszabbítás 5 percig, majd a hőmérséklet növekedése 0,5 ° C/s érték 65 ° C és 95 ° C között olvadási görbe létrehozásához. A qPCR termékek specifitását olvadási görbe elemzéssel igazoltuk. A relatív kifejezése FTO Az mRNS-t a geometriai átlagának felhasználásával határoztuk meg GAPDH,

-aktin, és 18s rRNS valami által

2.5. DNS előállítás és metiláció elemzés BSP módszerrel

Genom DNS-t extraháltunk a GC, HC és DH csoportból származó egerek zsírszövetéből 35 napos RAS-kiegészítés után, TIANamp Genomic DNA Kit alkalmazásával (Tiangen, Peking, Kína). Minden csoportból véletlenszerűen három állatot választottak ki. A DNS-t az ND-2000 Nanodrop segítségével számszerűsítettük, majd nátrium-biszulfittal kezeltük az EZ DNS Methylation Gold Kit (Zymo Research, CA, USA) segítségével. A gyártó utasításait követve a DNS-adagolást szigorúan arra korlátozták, hogy biztosítsák a teljes citozint az uracil-konverzióig.

A metilezett CpG-k a FTO A promótert (AC105989 azonosítószám) az online program (http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi) becsülte meg. A primerpárokat a Primer Premier 5-gyel módosítottuk (2. táblázat). A PCR-t egy C1000 PCR rendszeren, Thermocycler-en (Bio-Rad, Richmond, Kalifornia) futtattuk 30 térfogatban. μL beleértve 1 μL-biszulfit-konvertált DNS vagy 0,5 μL PCR termékek, 15 μL Zymo Taq ™ PreMix vagy 1 μL primer párok. A PCR-reakciók a következők voltak: 95 ° C 5 percig, 40 ciklus 30 másodpercig 95 ° C-on, 30 másodperc 65,2 ° C-on (második forduló: 57,5 ° C) és 30 másodperc 72 ° C-on, és egy utolsó meghosszabbítás 7 percig 72 ° C-on. A második PCR-termékeket DNS-gél extrakciós készlettel (TsingKe, Chengdu, Kína) tisztítottuk, majd pMD 19-T vektorba (Takara, Dalian, Kína) ligáltuk. Legalább tíz pozitív rekombinánst szekvenáltunk egy ABI 3730XL DNS-analizátorral (Applied Biosystems, USA). A metilezett CpG-ket a kvantifikációs eszközzel (QUMA, http://quma.cdb.riken.jp/) elemeztük.

2.6. Szövettani és morfometriai elemzés

A hasi zsírszöveteket reszekcióval és 4% paraformaldehiddel rögzítettük mosás után. Ezután etanolban dehidratáltuk és dimetil-benzolban áztattuk, majd paraffinba ágyazottuk. A szövetblokkokat 4 mikron vastagságban metszettük, majd haematoxilin és eozin (H&E) reagenssel festettük. A fotomikrográfiákat Image-Pro Plus szoftverrel (Media Cybernetics) készítettük és elemeztük.

2.7. Statisztikai elemzések

Az összes statisztikai elemzést az SPSS 20.0 (SPSS, Chicago, IL, USA) alkalmazásával végeztük, és az adatokat átlag ± SD értékként tüntettük fel. A csoportok közötti jelentőséget egyirányú ANOVA teszt és Student's segítségével becsültük meg

3. Eredmények

3.1. A RAS-kiegészítés hatása a testtömegre a HFD táplált egerekben

A normál étrend-csoporttal (GC) összehasonlítva a HC-egerek 5 hétig HFD-vel etetve markáns elhízást mutattak (1. ábra (a)). A HFD kezelés során az étvágy, az aktivitás és a szőrzet fénye minden állatnál normális volt. 5 hét elteltével a HC csoportba tartozó egereket öt alcsoportra osztottuk, HC, DL, DM és DH, és további 4 hétig különböző dózisú RAS-pótlással etettük. Összehasonlítva a GC, HC, DL és DM csoportba tartozó egerekkel, a DH csoport egerei mutatták a legkisebb súlygyarapodást (1. ábra (b) és 3. táblázat). Később 10,00 g/kg · BW RAS-t használtunk a DH utódok folyamatos táplálásához. A RAS-kiegészítés azonban nem mutatott nyilvánvaló hatást a testtömegre a HC és DH csoport utódai között (az adatokat nem közöljük).

3.2. A RAS - kiegészítés hatása a FTO mRNS expresszió

A RAS-kiegészítés hatásainak felmérése FTO mRNS expresszióval qPCR-t végeztünk a kvantifikáláshoz FTO expresszió a GC, HC, DL, DM és DH csoportokban egerekből gyűjtött zsírszövetekben a 35. és 60. napon. Ezenkívül meghatároztuk FTO expresszió HC és DH egerekben a 95. napon, valamint utódaikban a 35. napon. A qPCR eredmények azt mutatták, hogy a FTO a RAS-kiegészített csoportokban (DL, DM és DH) szignifikánsan magasabb volt, mint a HC-csoportban, 35 d és 60 d után is (2. a) és 2. b) ábra). 90 nap elteltével nem észleltünk szignifikáns különbséget a HC és DH csoport között (2. ábra (c)). Sőt, nem volt jelentős különbség a FTO expresszió az egerek utódai között a HC és DH csoportban (2. ábra (d)).

jelentős különbséget jelez ().

3.3. A RAS - kiegészítés hatása a metilációra a FTO Szervező

Az elemzett CpG helyek felépítése és elhelyezkedése (GenBank Acc. Szám AC105989: 31474–31968) a FTO gént a 3. ábra mutatja. A GC, HC és DH csoport DNS metilációs mintáit biszulfit szekvenálással értékeltük. Az elemzett régió magában foglal egy meghatározott CpG-szigetet, amely 666 bp-tal helyezkedik el a start kodon előtt. A FTO a gént hipermetiláltuk GC egerekben (90,00%), míg a HFD-vel táplált egerek magasabb metilációs szintet mutattak a HC csoportban (95,44%). A várakozásoknak megfelelően a RAS kiegészítése csökkentette a metilációs szintet, amely a DH egerekben elérte a 91,67% -ot.

3.4. A RAS-kiegészítés hatása az adipocita morfológiájára

A H&E szövettani vizsgálat kimutatta, hogy az adipociták poligonális morfológiájúak, tipikus periférián elhelyezkedő magokkal és különálló sejthatárokkal (4. ábra (a)). Miután 35 napig HFD-t tápláltunk RAS-kiegészítéssel, a DH-csoportban lévő adipociták térfogata kisebb volt, mint a HC-csoportban, és néhány rostos szövetet mutatott a sejtek közötti anyagban és nagyobb számú adipocitát (4. ábra (a)). A RAS-t 60 napig tápláló DH egerekben lévő zsírsejtek ismét kisebbek voltak, és a sejtek elrendezése nyilvánvalóan rendellenes volt a HC egerekhez képest. A szövettani és kvantitatív elemzések azt mutatták, hogy a RAS-t 35 napig tápláló HC és DH egerekben az adipocyták átlagos átmérője

μm és μm, illetve az adipocita területe

μm 2 és μm 2, ill. (4. ábra (b)). A RH-t 60 napig tápláló DH egerekben az adipociták átlagos átmérője és területe megegyezett μm és μm 2, ill. Összességében az adipociták átlagos átmérője és területe a HC egerekben szignifikánsan nagyobb volt, mint a DH egerekben ().

4. Megbeszélés

Ebben a jelentésben először mutatjuk be a RAS-kiegészítés kedvező hatásait a testtömegre, a génexpresszióra és a FTO gén HFD elhízással rendelkező egerekben. Mint sok korábbi tanulmány, az elhízás egér modelljét HFD indukálta; Míg a képletek különböznek a tanulmányok között, a szokásos összetevők között szerepelt a cukor és a zsírzsír [1, 2]. Az elhízási egerek modelljét HFD-vel hozták létre, és a standard eltérést mind a GC, mind a HC csoportokban akkreditálták. A RAS beadása után a testtömeg csoporton belüli következetlenségei egyéni hibának köszönhetők [8, 21]. Jelen vizsgálatban a testtömeg-növekedés a DH csoportban volt a legkisebb, amely 10,00 g/kg · BW RAS-kiegészítést kapott (3. táblázat). Eközben az alacsony vagy közepes dózisú (DL és DM csoportok) táplált egereknél a testtömeg-növekedés nem különbözött a HC-egerektől, ami azt jelzi, hogy a RAS-kiegészítés magasabb dózisa (10,00 g/kg · BW) előnyösebb lehet a szuppresszióban testtömeg elhízott egyéneknél.

Megállapítottuk, hogy a FTO Az RNS-sel kiegészített egerekben (DL, DM és DH csoportokban) az mRNS szignifikánsan megnövekedett, a HC egerek testtömeg-növekedése pedig szignifikánsan nagyobb volt, mint a DL, DM és DH egereké. Ez arra utal, hogy a RAS befolyásolhatja a BW növekedést a génexpresszió megváltoztatása révén. Amint azt a qPCR is mutatja, szignifikáns különbség volt FTO expresszió a RAS-tal kiegészített csoportok, valamint a GC és HC csoportok között 35 nap alatt, ami korrelációt sugall FTO kifejezés és testtömeg-növekedés. HC egerekben azonban, FTO expressziója a legkisebb, az elhízás pedig a legnagyobb. Korábbi tanulmányok arról számoltak be, hogy FTO egerekben a zsírszövet és a sovány testtömeg jelentős csökkenését eredményezte [17], és ez FTO befolyásolta az adipogenezist az adipogenezis korai eseményeinek szabályozásával a mitotikus klonális expanzió folyamata során [19]. FTO Az mRNS jobban expresszálódott a RAS-nal kezelt csoportokban, mint a kontroll csoport, különösen a DH csoport. 60 nap után a legmagasabb FTO expressziós szint a RAS-kezelt csoportokban volt. Sőt, 95 nap elteltével nem tapasztaltak szignifikáns különbséget a GC és a HC csoportok, illetve utódaik között. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a RAS-kiegészítés hatása a FTO kifejezés nem örökölhető.

FTO egy nukleinsav-demetiláz, amely eltávolítja a metilcsoportokat mind a DNS-ből, mind az RNS-ből [16, 22]. Korábbi vizsgálatok kimutatták, hogy a DNS metilációja nemcsak az elhízott egerek petesejtjeiben, hanem utódaikban is megváltozik [23]. A DNS-metiláció módosítása kapcsolatot teremt a környezet és a génexpresszió között, ezért a CpG-k metilációs szintjét vizsgáltuk a FTO promóter régió. 15 CpG dinukleotid van jelen a 2 Kb-ban a 3 FTO. A BSP eredmények azt mutatták, hogy a CpG helyek a FTO a promoter mindhárom csoportban erősen metilezett volt (GC, HC és DH). Bár a metilációs szintek nem különböztek szignifikánsan, eredményeink azt mutatták, hogy a promoter metilációja és expressziója FTO gén mRNS negatívan korrelált. Így lehetséges egy metilcsoport általi szabályozás, amely blokkolja az ehhez a régióhoz kötődő transzkripciós faktort (AC105989: 31 474–31 968 bp).

Korábbi tanulmány kimutatta a poliszacharidot Angelica sinensis elhízással kapcsolatos glükóz- és lipid-anyagcsere-rendellenességek enyhítésében, esetleg az inzulin és a szérum gyulladásos faktorokkal való kölcsönhatások következtében [8]. A molekuláris mechanizmusok azonban továbbra sem tisztázottak. Jelen tanulmányban a zsírszövetek mértéke különbözött a HC és DH egerek között. Azt javasoltuk, hogy ezt a testtömeg-különbséget az adipocita morfológiája okozhatja. Továbbá szövettani vizsgálatot végeztünk, hogy megnézzük az adipocita alakjának és méretének változását a HC és DH egerek között. Amint a 4. ábra mutatja, a HC-csoportban lévő adipociták érettebbek voltak, és nagyobb lipidcseppek jellemezték őket, míg a DH-ban levőknél több és kisebb lipidcsepp volt. A DH-csoportba tartozó egerek 60 napig táplálták a RAS-t, sokkal kisebb adipocitákat és több sejtközi anyagot mutattak, mint a 35 napig.

5. Következtetés

Ez a tanulmány azt vizsgálta, hogy a RAS képes-e elnyomni a testsúlyt elhízott HFD egerekben. A RAS kiegészítése a testtömeg elnyomásával járt, megnövekedett FTO mRNS expresszió és a metiláció csökkentése. Jelen tanulmány új betekintést nyújt a RAS biológiai szerepébe. További részletes elemzéseket kell végezni annak érdekében, hogy megértsük a RAS mechanizmusát a testsúly elnyomásában.

Összeférhetetlenség

Minden szerző kijelentette, hogy nincsenek összeférhetetlenségük.

Köszönetnyilvánítás

Ezt a tanulmányt a Szecsuáni Mezőgazdasági Egyetem (201410626007), a Kínai Nemzeti Természettudományi Alapítvány (31301945) és a kínai háziállat-csíraforrások infrastruktúrájának ösztöndíjai támogatták.