Az antitest hatékonyságának és a sejtek által közvetített immunitás összehasonlítása az inhalációs és a beültetett influenza vírus okozta fertőzéssel szemben

Absztrakt

Háttér

Az influenza elleni immunitás értékeléséhez az egérrel való fertőzéses vizsgálatokat tipikusan egy vírusszuszpenzió intranazális csepegtetésével hajtják végre altatott állatoknál. Ez természetellenes környezetet eredményez az alsó légutakban a fertőzés során, és ezért aggodalomra ad okot, hogy az ebben a modellben azonosított immunmechanizmusok nem tükrözhetik azokat, amelyek védenek az alsó légúti traktusba aeroszolként szállított fertőző vírusrészecskék ellen.

Módszer

A beültetett és belélegzett vírusok elleni védelem különbségeinek értékeléséhez az egereket olyan antigénekkel immunizálták, amelyekről ismert, hogy antitesteket vagy sejt-közvetített válaszokat indukálnak, majd 100 LD50 A/PR/8/34 (PR8) -val megfertőzve aeroszol formájában (belélegezve). vagy folyékony szuszpenzió (csepegtetve).

Eredmények

A hemagglutinint expresszáló rekombináns adenovírussal (Ad) immunizált egerek mindkét provokációs modellben védettek voltak a fogyás és a halál ellen, azonban az influenza A (NPA) vagy M2 nukleoproteinnel expresszáló Ad-t expresszáló immunizálás nagyobb védelmet eredményezett az inhalációs aeroszolizált vírus ellen, mint a folyékony szuszpenzióba csepegtetett vírus . Az Ad-M2-et, de az Ad-NPA-val nem immunizált egereket, védettük az alacsonyabb csepegtetési dózis ellen.

Következtetések

Ezek az eredmények a védettség különbségeit mutatják be, amelyek a provokációs módszertől függenek, és arra utalnak, hogy a sejtek által közvetített immunitás pontosabban kimutatható az egér inhalációs vizsgálataiban. Ezen túlmenően az adatok azt sugallják, hogy az immunmechanizmusok, amelyeket folyékony intranazális kihívást alkalmazó egérmodellekben általában hiányosnak vagy gyengének jellemeznek, nagyobb immunitást kínálhatnak az influenza fertőzéssel szemben, mint azt korábban gondolták.

Háttér

Az éves influenzajárványok körülbelül 40 000 halálesetet eredményeznek az Egyesült Államokban és legalább egymillió halálesetet okoznak világszerte [1, 2]. Az oltás védelmet nyújt a betegség ellen, amikor az inaktivált hasított oltásokban lévő antigéneket antigénesen illesztik a keringő influenza vírusokhoz, tükrözve az antitestek aktivitását, amelyek semlegesítik a vírus fertőzőképességét és korlátozzák a vírus terjedését. A hemagglutinin (HA) és a neuraminidáz (NA) gátló antitestek egyaránt független korrelátumai az immunitásnak [3]. A sejtek által közvetített immunitás azonban hozzájárul a vírus kiürüléséhez, az IFN-y-t szekretáló T-sejtek száma korrelál az élő, legyengített influenza elleni vakcina hatékonyságával gyermekeknél [4].

Korai egérvizsgálatok azt mutatják, hogy az egerek belélegzéséhez kevesebb fertőző egységre van szükség, mint a csepegtetéshez [21], és hogy az alsó légúti traktusba történő közvetlen lerakódáshoz az aeroszolos cseppeket

Eredmények és vita

Immunizálás influenza fehérjéket expresszáló élő vírussal és rekombináns adenovírussal (Ad)

A BALB/c egereket intranazálisan a PR8 (H1N1) vagy egy heterológ reasszortáns H3N2 X-31 vírus subletális dózisának tettük ki, vagy intramuszkulárisan oltottuk be az influenza A vírusok HA, M2 és NP expresszáló rekombináns adenovírussal (Ad-NPA) ), vagy az influenza B vírusok NP-je (Ad-NPB). Az utóbbi vakcinacsoport, valamint a naiv egerek negatív kontrollként szolgáltak, mivel ezeket az egereket nem szabad megvédeni a PR8-mal történő fertőzés ellen. Három héttel az oltás után az egereket elvéreztettük és megmértük a hemagglutinációs gátlás (HAI) antitest-titerét. Az Ad-HA-val immunizált egereknek, de az Ad-M2-nek vagy az Ad-NP-nek nem volt HAI-titerük körülbelül 1: 100, ami azt mutatja, hogy ez az oltási stratégia hatékony antitest-válasz kiváltásában. Az Ad-M2 és az Ad-NP azon képességét, hogy M2-specifikus antitesteket és NP-specifikus CD8 + T sejteket indukáljon, mások ugyanezen rekombináns adenovírus készítmények alkalmazásával állapították meg [5, 6, 28]. A PR8-mal reaktív HAI antitestek az egerek szérumában is jelen voltak, amelyek a PR8 szubletális dózisának voltak kitéve (HAI-titerek kb. 1: 600), de nem követték az X-31 (H3N2) expozíciót. Mint arról mások beszámoltak, az NP-specifikus CD8 + T-sejtek az élő influenza A vírusfertőzés után aktiválódnak, és jelentős számban toborozódnak a tüdőbe egy másik altípusú vírussal való fertőzés után [29].

Az oltott egerek tüdejében a vírusreplikáció hasonló a belégzés és a beadott PR8-fertőzés után 4 nappal

Öt héttel a vírusnak való kitettség vagy oltás után minden vakcinacsoportban azonos számú egeret (n = 10) tettek ki PR8-nak inhalált aeroszolként vagy cseppentett folyékony szuszpenzióként. Az aeroszolos fertőzést a Methods and Materials leírása szerint hajtottuk végre, kizárólag orrú expozíciós rendszert használva, az egerek szedálása nélkül. Ezzel szemben a csepegtetést egy vírusszuszpenzió cseppjeivel tettük az érzéstelenített egerek orrára. Ugyanezt a halálos dózist (100 LD50) alkalmaztuk; mivel a BALB/c egerek 10-szer kisebb mennyiségű PR8 belélegzésével pusztulnak el az intranazális csepegtetéshez képest [26], az inhalációs provokációban használt vírus mennyisége körülbelül tízszer kisebb volt, mint az instillációs provokációban.

Minden csoportban öt egeret feláldoztunk 4 nappal a fertőzés után, és a tüdőt eltávolítottuk a vírus titrálásához; a betegség és a mortalitás klinikai tüneteit a fennmaradó állatokban figyelték meg. Ezek az eredmények hasonló mennyiségű vírust mutatnak a fertőzött egerek tüdejében, függetlenül a fertőzés módjától (1. ábra). Ekkor vírust nem detektáltak a korábban PR8-nak kitett vagy rAd-HA-val oltott egerek tüdejében. A heterológ X-31 vírusnak korábban kitett egereknél jelentősen csökkent a tüdővírus-titer, ami bizonyítékot szolgáltat arra, hogy a korábbi élő vírusfertőzés által kiváltott heteroszubtipus immunitás hasonló védelmet nyújt az inhalált és a beültetett vírusokkal szemben. Az Ad-M2-vel és az Ad-NPA-val végzett immunizálás azonban nem csökkentette a 4. napi vírustitereket sem inhaláció, sem csepegtetés után.

A vírustiterek összehasonlítása a vakcinázott egerek tüdejében a beültetés és az inhaláció után PR8. A vírustiterek geometriai átlagát (TCID50/ml) mutatjuk be azoknak az egereknek, akiket instillációval (szürke sávok) és inhalációval (fehér sávok) váltottak ki. A fertőzés utáni 4. napon összegyűjtött és 1 ml szérummentes táptalajban homogenizált vírustitereket meghatároztunk a tüdő számára (csoportonként 5 egér). A hibasávok a szórást jelzik, és a szaggatott vonal jelenti a meghatározás kvantitatív értékét ennél az assaynél.

Teljes immunitás mind a belélegzett, mind a beültetett influenza ellen olyan egerekben, amelyek korábban élő homológ vagy heterológ vírusnak voltak kitéve, vagy Ad-HA-val oltottak be

Azoknak az egereknek, akik korábban fertőző PR8-nak voltak kitéve, vagy amelyeket rAd-HA-val immunizáltak, 4 nappal a homológ vírus inhalációja vagy 100 LD50-e beültetése után sem volt vírus a tüdőben (1. ábra). Ezeket az egereket nemcsak a fertőzés ellen védték meg, hanem teljes mértékben védettek a fogyás (2. ábra) és a halál (3. ábra) ellen is. Ez a védelem korrelál a HA-t gátló antitestek jelenlétével, amelyekről ismert, hogy semlegesítik a vírus fertőzőképességét.

Az rAd-M2-vel és az rAd-NP-vel immunizált egerek a vírus belélegzése esetén védettek a súlyvesztéstől, de a vírus csepegtetése esetén nem. Az egyes csoportok esetében a kiindulási tömeg átlagos százalékát mutatjuk be azoknál az egereknél, amelyeket (A) csepegtetés és (B) belégzés. Az egerek mindegyik csoportjában (n = 5) külön-külön lemértük a fertőzés utáni napon. Minden grafikon a csoport átlagos súlyváltozását mutatja az alapvonal testtömegéhez viszonyítva, hibasávokkal jelezve a csoport szórását.

Habár a vírus replikációját mértük a tüdőben, az előzőleg heterológ élő X-31 vírusnak kitett egerek teljesen védettek voltak a fogyás (2. ábra) és a halál (3. ábra) ellen mind az inhalációs, mind a cseppentett vírusfertőzés után. Ezeknek az egereknek nem voltak olyan antitestek, amelyek gátolják a PR8 provokációs vírus HA vagy NA aktivitását (nem látható). Mint a heterológ védelem számos tanulmányában beszámoltak róla, ezt a védelmet általában influenza-specifikus CD4 + és CD8 + T sejtek közvetítik, amelyek elpusztítják a fertőzött sejteket [5, 29], bár a konzervált antigén epitópok, például az M2e ellenanyagok is hozzájárulhatnak a heteroszubtipiás immunitáshoz [9, 30, 31].

Rekombináns Ad-M2 vagy Ad-NPA-val oltott egerek immunitása az inhalációs, de be nem csepegtetett influenza ellen

Az Ad-M2, Ad-NPA és Ad-NPB-vel immunizált egerek súlya ugyanolyan volt, mint a naiv egereknek, miután a folyadékot tartalmazó PR8-mal szuszpendáltuk (2. ábra). Ezek az egércsoportok mind a fertőzés utáni 8. napon haltak meg (3. ábra). Érdekes módon ez egy nappal később történt, mint a fertőzött naiv egerek elpusztulása, ami az Ad-M2, Ad-NPA és Ad-NPB immunizációk némi előnyére utal. Ezzel szemben az Ad-M2 és Ad-NPA-immunizált egerek aeroszolos provokációja után a fogyás 3 nappal az aeroszolos provokáció után lelassult, bár súlyuk lényegesen kisebb maradt, mint az Ad-HA csoport (p 4. ábra

(A) vírustiterek, (B) fogyás és (C) 10LD halálozása 50 cseppentett PR8. Az egerek csoportjait (n = 10) immunizáltuk, mint korábban, és PR8 cseppentésével fertőztük őket. Négy nappal a fertőzés után minden csoportból 5 egeret eutanizáltunk, hogy lehetővé tegyük a vírus tüdőben történő titrálását, a fennmaradó egerek tömegét és túlélését a 12. napig követtük. (A) a vírustiterek geometriai átlagát mutatja, a szórással együtt; a szaggatott vonal jelenti ennek a vizsgálatnak a mennyiségi meghatározásának határát. (B) a tömeg százalékos csökkenését mutatja az alapvonal testtömegéhez viszonyítva, a hibasávok pedig a szórást mutatják. A csoportok kulcsa a diagram jobb oldalán látható. (C) az egerek százalékos túlélését mutatja az egyes csoportokban. E csoportok kulcsa a diagram jobb oldalán látható. Az Ad-HA-val és az Ad-M2-vel oltott egerek túlélése szignifikánsan nagyobb volt (Mantel-Cox teszt, p = 0,0016), mint az Ad-NPA-val vagy Ad-NPB-vel immunizált egerek. Az utóbbi 2 csoport nem különbözött egymástól vagy naiv egerektől.

A nagyon kicsi vírustartalmú aeroszolrészecskék belégzésével történő kihívásnak alacsonyabb az LD50 dózisa [26], és ezért a védelem különbségének egyszerű magyarázata az volt, hogy a vírust inhaláló egerek alsó légzőrendszerébe kisebb számú virion jut be, mint a csepegtetett vírus. Kipróbáltuk ezt az elképzelést úgy, hogy egereket tízszer kevesebb cseppentett vírussal oltottunk be. Eredményeink azt mutatták, hogy ez nem így volt - az Ad-NPA-val immunizált egereket nem védték meg az azonos mennyiségű belélegzett és beültetett vírusrészecskékkel való fertőzéssel szemben.

Míg a kemokin-gradiens különbsége potenciális okot ad a sejtek által közvetített védelemre az inhalációs, de nem beültetett vírusok ellen, más magyarázatokat is figyelembe kell venni. Például a sejttípusú fertőzött vagy aktivált veleszületett mechanizmusok közötti különbségek az inhalációs vírus hatékonyabb eltávolítását eredményezhetik, mint az influenza-specifikus CD8 + T sejtek. A jövőbeni kísérleteknek ezért meg kell vizsgálniuk a fertőzött egerek tüdejének hisztopatológiáját, hogy meghatározzák a tüdőbe toborzott gyulladásos sejtek számát és típusait, valamint összehasonlítsák a fertőzés mértékét, a fertőzött sejttípusokat és a sejtkárosodást, mivel a vírusos vagy immunos patológia szintén hozzájárulhat a a cseppentett és belélegzett vírusok elleni védelem különbségei. A vizsgálatot megalapozó egyéb tényezők közé tartozik az izoflurán potenciális hatása a beültetett vírusfertőződésre és a reagáló sejtek működésére [34], valamint a csepegtetett és belélegzett vírus által a felső légutakban kiváltott immunválasz lehetséges eltérései. További kísérletekre egyértelműen szükség van az Ad-NPA által kiváltott és belélegzett vírusok elleni védelem különbségének okainak azonosításához.

Eredményeink azt mutatják, hogy az egereket az X31 heterosubtipi vírus előzetes kitettsége teljes mértékben védte a halálos PR8-fertőzéssel szemben. Míg az antitestek hozzájárulnak a keresztvédelemhez [30], a sejtek által közvetített immunitás jelentős szerepet játszik az immunitásban, nagyszámú memória NP-specifikus CD8 + T-sejtet toborozva a tüdőbe [35]. Eredményeink, amelyek az Ad-NP-vel immunizált egerek hatékonynak bizonyuló védettségét mutatják beültetett vírus ellen a modellünkben egyetlen oltóanyag-dózis alkalmazásával, azt sugallják, hogy az NP-specifikus immunválasz és a cseppentett vírus elleni védelem is javítható további dózisok beadásával vagy adjuvánssal kombinálva.

Összefoglalva, összehasonlítottuk az inhalált és csepegtetett vírus elleni védelmet egerekben, akik korábban homológ és heteroszubtipikus vírusnak voltak kitéve, vagy korábban HA, M2 vagy NP expresszáló rekombináns adenovírusokkal immunizáltak. Eredményeink hasonló védelmet mutatnak az inhalált és csepegtetett fertőzéssel szemben azoknál az egereknél, amelyeket korábban megfertőztek vagy beoltottak Ad-HA-val, de az Ad-M2-vel vagy Ad-NPA-val immunizált egerek esetében nem. Ez utóbbi csoportokban szignifikáns védelem volt a belélegzés ellen, de nem oltották be a PR8-ot. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az immunmechanizmusok gyakran gyengéknek minősülnek, mint például az NK vagy a CD8 + T-sejtek által közvetített gyilkosok, jelentősebb szerepet játszhatnak a betegségekkel és a halállal szembeni védelemben, mint azt korábban azt javasolták, amelyekben az egereket folyékony vírusszuszpenzió csepegtetésével hajtották végre. . Adataink azt sugallják, hogy az aeroszolos expozíciót alkalmazó állatmodellek megfelelő megközelítést jelenthetnek azoknak az influenza vakcináknak a potenciális hatékonyságának értékelésére, amelyek esetében a sejtek által közvetített válaszok az immunitás összefüggései.

Módszerek és anyagok

Vírus és vakcina készítmények

Egerek és tanulmányterv

A nőstény BALB/c egereket a The Jackson Laboratories-től (Bar Harbor, ME) szereztük be, és a Biologikai Értékelő és Kutató Központban (CBER) helyezték el, ahol immunizálták őket. Azokat az egereket, akiknek csak orr-belélegzés történt, körülbelül 1 héttel a vizsgálat megkezdése előtt szállították a Southern Research Institute-ba (SR, Birmingham, AL). A ketrec mérete és az állatok gondozása megfelelt az Egyesült Államok Mezőgazdasági Minisztériumának az állatjóléti törvényen keresztül a laboratóriumi állatok gondozására és használatára vonatkozó útmutatójában előírt irányelveknek.

Az egereket a CBER-nél csepegtetéssel, az SR-nél pedig csak orr-belélegzéssel provokáltuk. Valamennyi kísérletet a CBER, illetve az SR intézményes állatgondozási és felhasználási bizottságai által jóváhagyott 2006-22 és 10-217 protokollok szerint hajtották végre. Az egerek körülbelül 15 hetesek voltak, testtömegük 19 és 26 gramm volt a vírus inhalációs vagy csepegtetési időpontjában.

Az inhalációs kihívás rendszere

Az inhalációs kihívások elvégzése előtt a rendszert PR8 vírus alkalmazásával jellemeztük [26]. A jellemzés magában foglalta az aeroszolkoncentrációk céltartományának elérését és fenntartását, amelyet az impinger minták plakkvizsgálati elemzésével határoztak meg, valamint az APS analízissel meghatározott provokációs aeroszol részecskeméret-eloszlásának bemutatását.

Vírus kihívás

A vírus belélegzése: Az inhalációs provokációt megelőző három egymást követő napon az egereket kiképeztük a csak orrú inhalációs visszatartó csövekbe. A provokáció napján egy Collison 3-Jet porlasztót vírus törzsszuszpenzióval töltöttünk meg, és csatlakoztattuk a bioaerosol szállító vezetékhez. A 100 LD50 leadásához szükséges vírus hígítását korábban meghatározták [26]. A porlasztó előtti szuszpenziós mintát összegyűjtöttük annak igazolására, hogy a megfelelő vírushígítást elkészítettük. Az egereket csak orr-visszatartó csövekbe helyeztük, és az inhalációs provokációs plénumhoz csatlakoztattuk a Positive Flow-By ™ orrkúpok segítségével (In-Tox Products, LLC; Albuquerque, NM). Az egerek csoportjait porlasztott vírusnak tettük ki 30 percig. Az expozíciós periódus kezdete (T = 0) akkor kezdődött, amikor a porlasztót aktiválták és 30 psi-re állították. Az inhalációs dózist (kb. 870 PFU) kiszámítottuk az aeroszolkoncentráció, az egér perces lélegeztetése (0,062 L/perc [37]) és az expozíció időtartamának szorzataként.

Vírus cseppentése: Az egércsoportokat 3% izofluránnak kitéve, 3% O2 jelenlétében altattuk, majd 30 μl P8-mal hígított PR8-mal (kb. 5,160 PFU) oltottuk be, a szuszpenzió cseppjeivel mindkét narancsba.

Az összes egeret naponta kétszer figyeltük meg a karantén és a vizsgálati periódus alatt a morbiditás és a mortalitás jeleire. A testtömegeket naponta rögzítettük. Azokat az állatokat, akik kezdő súlyuk ≥25% -át elvesztették, eutanizálták. Ezek az egerek halandóak voltak, görnyedt testtartással, inaktivitással és a kezelésre nem reagáltak. A túlélési görbéket ábrázoltuk, figyelembe véve mind az elpusztított, mind pedig az elhullottnak talált állatokat.

statisztikai elemzések

A testtömeg adatok statisztikai elemzését a Provantis automatizált adatgyűjtő rendszer (Instem; Staffordshire, Egyesült Királyság) segítségével végeztük. A csoportok közötti súlykülönbségeket kétirányú ismételt ANOVA-mérésekkel (Microsoft Excel 2003, Redmond, WA), a túlélésbeli különbségeket pedig log-rank Mantel-Cox teszttel, GraphPad PRISM 5 szoftver segítségével határoztuk meg. Az aerobiológiai adatok átlagát, szórását és szórási együtthatóját kiszámoltuk az Excel vagy a SigmaPlot (Systat Software, Inc., San Jose, Kalifornia) alkalmazásával, ahol ez megfelelő volt.

Vírustitrálás

Az 50% -os szövetkultúra fertőző dózist (TCID50) MDCK sejteken (ATCC CCL-34 vonal) titrálással határoztuk meg, egy korábban leírt standard eljárást követve [36]. Röviden, az egyes tüdőhomogenátumok sorozatos tízszeres hígításait oltottuk be 96-lyukú lemez négyszöri üregébe, amely egyrétegű MDCK sejteket tartalmazott. 1 óra elteltével CO2 inkubátorban, 37 ° C-on, azonos térfogatú szérummentes táptalajt adunk hozzá, amely 3% BSA-t és TPCK-val kezelt tripszint (5 μg/ml) tartalmaz. 3 napos inkubálás után a megmaradt sejteket kristály ibolyával festettük gluteraldehidben. A TCID50 titert a hígítás inverzeként határoztuk meg, amely a lyukak 50% -ában citopátiás hatást mutatott.