Az elhízással kapcsolatos gének expressziós szintjei összefüggésben vannak a veseátültetett betegek súlyának változásával

Társulási osztály Akut és krónikus ellátás, Ápolási Főiskola, Tennessee Egyetem Egészségügyi Tudományos Központ, Memphis, Tennessee, Amerikai Egyesült Államok, Országos Ápolási Kutató Intézet, Országos Egészségügyi Intézetek, Bethesda, Maryland, Amerikai Egyesült Államok

Akut és krónikus gondozási osztály, Ápolási Főiskola, Tennessee Egyetem Egészségügyi Tudományos Központ, Memphis, Tennessee, Amerikai Egyesült Államok

Tennessee Egyetem Egészségügyi Tudományi Központ Biostatisztikai és Epidemiológiai Tanszéke, Memphis, Tennessee, Amerikai Egyesült Államok

Memphisi Egyetem Biológiai Tanszéke, Memphis, Tennessee, Amerikai Egyesült Államok

Memphisi Egyetem, Biológia Tanszék, Memphis, Tennessee, Amerikai Egyesült Államok

Affiliations Methodist University Hospital Transplant Institute, Memphis, Tennessee, Amerikai Egyesült Államok, Transzplantációs Osztály, Sebészeti Osztály, Tennessee Egyetem Egészségügyi Tudományos Központ, Memphis, Tennessee, Amerikai Egyesült Államok

Akut és krónikus gondozási osztály, Ápolási Főiskola, Tennessee Egyetem Egészségügyi Tudományos Központ, Memphis, Tennessee, Amerikai Egyesült Államok

Memphisi Egyetem Biológiai Tanszéke, Memphis, Tennessee, Amerikai Egyesült Államok

Ann Cashion,
Ansley Stanfill,
Fridtjof Thomas,
Lijing Xu,
Thomas Sutter,
James Eason,
Mang Ensell,
Ramin Homayouni

Ábrák

Absztrakt

Háttér

A tanulmány célja a szubkután zsírszövetben lévő génexpressziós profilok összefüggésének vizsgálata volt a veseátültetett betegek súlyváltozásával, és betekintést nyert a súlygyarapodás mögöttes mechanizmusaiba.

Módszertan/fő megállapítások

Másodlagos adatelemzést végeztek egy nagyobb prospektív longitudinális vizsgálat meglévő klinikai és génexpressziós adatainak egy alcsoportján (n = 26), amelyek a transzplantált betegek súlygyarapodásához hozzájáruló tényezőket vizsgálták. Az elvégzett mérések között szerepelt a zsírszövet génexpressziós profilja a transzplantáció idején, a kiindulási és a hat hónapos súly, valamint a demográfiai adatok. Többváltozós lineáris regressziós elemzés alapján, faji és nemi alapon, 1553 gén expressziós szintje szignifikánsan (a kiindulási érték 5% -a) volt a transzplantációt követő 6 hónapban a kaukázusi alanyokhoz képest (27%, n = 3). A 26 alany közül heten diagnosztizáltak 2-es típusú cukorbetegséget a transzplantáció előtt, egy személynél új transzplantált cukorbetegséget diagnosztizáltak a transzplantáció után; így 31% -nak (n = 8) volt cukorbetegsége a 6. hónapban.

A génexpresszió profilálása

A gén expresszió szintjét 26 veseátültetett beteg zsírszövetében vizsgáltuk Affymetrix Human Gene 1.0 ST tömbök alkalmazásával. A faj és nem alapján kontrollált regressziós modell segítségével 1936 próbacélpontot találtunk, amelyek 1553 egyedi génnek felelnek meg, amelyek szintje szignifikánsan korrelál a súlyváltozással a transzplantáció után 6 hónappal (2. és 3. táblázat, 1. ábra és S1. Táblázat). . Fontos megjegyezni, hogy ebben a kohorszban a génexpresszió jelentős változékonyságot mutatott. Ezt mind az hierarchikus klaszterezés, mind az alapkomponens-elemzés megmutatta az 1936-os szondákon (2. és 3. ábra). Például számos nem súlygyarapodó egyén (például # 16 és # 33) a súlygyarapodókhoz hasonló expressziós profilokat mutatott. Ezzel szemben több súlygyarapodó egyén (például # 26 és # 61) olyan expressziós profilokat mutatott, amelyek hasonlóak voltak a nem növekedőkhöz hierarchikus klaszterezés alapján (2. ábra). A kifejezés változékonysága nem volt összefüggésben a nemmel vagy a fajjal.

12 és 21 elhízással kapcsolatos gén, amelyek pozitívan (A) és negatívan (B) korrelálnak a relatív súlyváltozással. Mindegyik vonal az átlagos normalizált expressziós értéket (függőleges tengely) mutatja egy adott gén esetében 26 veseátültetett befogadónál, súlycsökkenés/gyarapodás (vízszintes tengely) szerint rendezve a transzplantáció után 6 hónappal.

A gének (sorok) expressziós értékeinek hőtérkép-ábrázolása a befogadók (oszlopok) között, ahol az alacsony expressziót zöld, a magas expressziót piros jelöli. Az egyes gének expresszióját az összes mintában normalizáltuk. A befogadókat súlygyarapodókba (G, őszibarack szín) vagy nem gyarapodókba (G, kék szín) soroltuk, ha a nettó súlyváltozásuk 5% -nál nagyobb vagy kevesebb volt, a transzplantáció után 6 hónappal.

A variabilitás kb. 64% -át, 17% -át és 10% -át tulajdonítottuk az 1., 2. és 3. alapkomponensnek. Jelmagyarázat: a súlyváltozás nagyszerű> 5% a transzplantáció után 6 hónappal, piros; Súlyváltozás 2. táblázat. Azok a gének expressziós p-értékei, amelyek expressziós szintje pozitívan korrelált a súlygyarapodással.

Hogy betekintést nyerjünk a súlygyarapodás alapjául szolgáló potenciális mechanizmus (ok) ba, funkcionálisan elemeztük a differenciálisan expresszált géneket két különböző bioinformatikai megközelítés alkalmazásával. Először a WebGestalt nevű, nyilvánosan elérhető eszközkészlet segítségével határoztuk meg, hogy mely GO vagy KEGG funkcionális osztályozások gazdagodtak génkészletünkben (4. és 5. táblázat). A súlyváltozással korrelált 1553 gén közül a GO elemzés 38 gént talált, amelyek a mitokondriális belső membránra vonatkoztak (p. 4. táblázat. Funkcionális kategóriák a gén ontológiában, amelyek jelentősen gazdagodtak a súlygyarapodáshoz kapcsolódó génekben.

Ezután az Ingenuity Pathway Analysis eszköz (Ingenuity systems, www.ingenuity.com) segítségével megvizsgáltuk a molekuláris interakciós hálózatokat a 41 legnépszerűbb gén számára, amelyek kifejezetten vagy implicit módon társultak az „elhízás” kulcsszóhoz a GeneIndexer-ben. A legmagasabb rangú hálózat a 41 elhízással kapcsolatos gén közül 22-et tartalmazott (4. ábra). Megjegyzendő, hogy ez a hálózat közvetlen kölcsönhatásokat mutat a CPE, APOM, SERPINA12, CRP, NPY1R és NPY5R gének és leptin (LEP) között. Úgy tűnik, hogy ezek és a hálózat más génjei összefonódnak az inzulinban, a vaszkuláris endoteliális növekedési faktorban (VEGF), a növekedési hormonban és az IL-1 jelátviteli útvonalakon, amelyekről ismert, hogy fontos szerepet játszanak az anyagcsere szabályozásában.

Az Ingenuity szoftver által azonosított hálózat a 41 legmagasabb rangú gén elemzéséből kiderült, hogy összefüggésben vannak a mikroarray adatok súlygyarapodásával, és a GeneIndexer irodalmában szintén erősen összefügg az elhízással. A CPE, NPY1R, NPY5R és APOM gének arra utalnak, hogy ezek az alanyok a transzplantáció utáni súlygyarapodás előtt változást mutathatnak a leptin és az inzulin válasz génjeiben.

Vita

Súlygyarapodás veseátültetett betegeknél

A CPE gén a karboxipeptidáz E enzimet kódolja, amely elhízott személyeknél magasan expresszálódik a zsigeri zsírlerakódásokban [20]. A CPE lebontja a peptidkötéseket, és részt vesz az energiaegyensúlyban részt vevő számos peptidhormon bioszintézisében, beleértve az inzulint is. Azt is felvetették, hogy a CPE megváltoztatja a proopiomelanokortin (POMC) feldolgozását a hipotalamuszban, ami segít a keringő leptin- és inzulinszintre reagálva szabályozni az energiaegyensúlyt [21]. Ezen jelátviteli utak bármelyikének megváltozása megnövekedett súlyt okozhat. Valójában a CPE knockout egerek testtömegének majdnem kétszerese meghaladja a vad típusú alomtársak testét, csökkentik a zsír energiabontását, és magasabb a keringés a leptin és a proinzulin szintjén [22].

A CPE a dopamin transzporter aktivitásával is összefüggésben van [23]. A dopamin egy neurotranszmitter, amely szerepet játszhat az étkezés kellemes (kifizetődő) aspektusaiban. Így a CPE nemcsak az energiamérlegben játszik szerepet, hanem az étkezés érzelmi vonatkozásaiban is. A gén ontológiai elemzésből kiderült, hogy veseátültetett befogadóink statisztikailag szignifikánsan megnövekedett expressziót mutattak 5 másik génben (p 2 a transzplantáció előtt, és így az Országos Egészségügyi Intézet BMI-re vonatkozó irányelvei elhízottnak minősítették. Valamennyi alany hasonló immunszuppresszív terápiás protokollon volt Közvetlenül a transzplantációt követően 80% (n = 21) 20 milligramm (mg) prednizont, 8% (n = 2) 10 mg prednizont, 8% (n = 2) 15 mg prednizont és 4% (n = 1) 50 mg prednizont kapott. 6. hónapban 92% (n = 24) 5 mg prednizont szedett, és 8% (n = 2) nem szedett prednizont.

RNS expressziós elemzés

A hasi szubkután zsírszövet gyűjtését, feldolgozását és tárolását korábban részletesen leírták [31]. Röviden, a mintákat intraoperatív módon gyűjtöttük a vesetranszplantált betegek standardizált helyéről a vesetranszplantáció idején. A transzplantációs sebész hasi bemetszésből zsírmintákat kapott szikével. A mintákat azonnal jégre tettük egy Petri-csészébe, a műtőn kívülre mozgattuk, 10 részre vágtuk, egyedi krio-fiolákba helyeztük, majd folyékony nitrogénben fagyasztva felvillantunk. Az RNS integritásának fenntartása érdekében a gyűjtéstől a fagyásig eltelt idő kevesebb, mint két perc volt. A folyékony nitrogénben lefagyasztott mintákat ezután egy létesítménybe szállítjuk, és tárolás céljából –80 ° C-on tartjuk. Az RNS-t TRizol plus RNeasy Lipid Kit alkalmazásával izoláltuk. Az RNS mennyiségét NanoDrop® ND-1000 spektrofotométerrel (NanoDrop Technologies, Inc., Wilmington, DE) teszteltük. Az RNS tisztaságát egy Agilent 2100 Bioanalyzer segítségével (Agilent Technologies, Santa Clara, Kalifornia) teszteltük. Végül az RNS expressziós szinteket az Affymetrix Human Gene 1.0 ST GeneChip® (Santa Clara, CA) alkalmazásával mértük.

qPCR-t alkalmaztunk a mikroarray eredmények validálásához. Az RNS-t Trizol módszerrel extraháltuk a 26 alany mindegyikéből származó további fagyasztott mintákból, és a cDNS-t a Transcriptor First Strand cDNS szintézis készletből készítettük (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). A qPCR-t Taqman® módszerrel végeztük a Lightcycler®480-on. Az eredmények validálásához a mikroarray legalacsonyabb p-értékű génjeiből öt és a microarray-eredményekből származó két érdekes gént használtunk fel [32]. Mindegyik gént normalizáltuk a referenciagénhez a ΔCt módszerrel [33], majd átlagoltuk mind a 26 alanyra, hogy átlagos ΔCt-t kapjunk. Ezt az átlagos ΔCt-t ezután a Pearson-termék korrelációjával korreláltuk a mikroarray eredményekkel. Ezeket az eredményeket az S3 táblázat mutatja.

Adatelemzés

A transzplantáció után 6 hónappal az alanyok relatív súlyváltozása a kiindulási állapotban visszafejlődött a génexpressziós szinteken, kontrollálva a nemet és a fajt. A génexpressziós szintekhez tartozó regressziós együttható (marginális) p-értékeit használtuk a q-értékek kiszámításához az R-ben elérhető szoftver segítségével [34]. A q-érték a p-érték pozitív hamis felfedezési arányának (FDR) analógja, és a null-hipotézis összes elutasítása között a hamis pozitívok várható hányadaként határozható meg. Találtunk 1936 olyan szondát (amely 1553 egyedi génnek felel meg), amelyeknek a regressziós p-értéke 0,2 tipikusan kifejezett összefüggést jelez (pl. A szó valóban megjelenik a génösszevonásokban), és a 0,1 és 0,2 közötti pontszám általában implicit kapcsolatot mutat [37 ]. A kutatócsoport manuálisan választott 14 neurológiai és elhízással kapcsolatos kulcsszó fogalmat, amelyeket a Partek szoftver (St Louis, MO) alkalmazásával végzett klaszterezéssel értékeltek a GeneIndexer által származtatott irodalmi asszociációs pontszámok alapján (S1. Ábra). Ezután az Ingenuity szoftvert alkalmaztuk a GeneIndexer által 41 legmagasabb rangú gén hálózati elemzésére, amelyek kifejezett vagy implicit összefüggésben vannak az elhízás kulcsszavakkal. A legkiemelkedőbb hálózatot a 4. ábra mutatja.