A fahéj csillapítja az adipozitást és befolyásolja a metabolikus gének expresszióját a zebrafish étrend által kiváltott elhízási modelljében

Cikkek

  • Teljes cikk
  • Ábrák és adatok
  • Hivatkozások
  • Idézetek
  • Metrikák
  • Engedélyezés
  • Újranyomtatások és engedélyek
  • PDF

Absztrakt

Bevezetés

Ez a vizsgálat megalapozza a zebrafish-t, mint modellt az anyagcsere-betegségek genotípusos és fenotípusos jellemzőinek elemzéséhez, mint például az étrenden keresztüli elhízás, és megvizsgálható a fahéj potenciálja a káros étrend hatásainak enyhítésében. A fahéjról híres, hogy csökkenti az elhízás fizikai megjelenését, különösen a has körül, és stabilizálja a vércukorszintet, lehetővé téve az alanyok számára, hogy hosszabb ideig teltebbnek érezzék magukat. Feltételezik, hogy a fahéj képes lenne csökkenteni az elhízással járó genotípusos és fenotípusos jellemzőket a kialakult zebrafish modellben.

csillapítja

Anyagok és metódusok

Zebrafish tenyésztés

A zebrafish-t szabályozott hőmérsékleten, 28 ° C-on tartottuk 14 órás fény: 10 órás sötét ciklus alatt. Valamennyi állatkísérletet a Dr. B.R. Ambedkar Orvosbiológiai Kutatóközpont, Delhi Egyetem, Delhi, India.

Zebrafish takarmányozási eljárások

A halak három fő csoportját vizsgálták, amelyek különböző ételeket kaptak (az AB törzs vad típusú hím zebra halát használták). A hím AB zebrahalakat három csoportra osztották: Az első csoportot kontrollként hozták létre a garnélarák rendszeres mennyiségének etetésével Artemia; A második csoport túlsúlyos táplálkozással indukálta az elhízást Artemia; A harmadik csoport túlsúlyos táplálkozásával indukálta az elhízást Artemia de amelyet fahéjporral is etettek (Cinnamomum zeylanicum).

Normál táplálkozási csoport (5 mg Artemia/ hal/nap) - NF csoport

Táplálkozási csoport (60mg Artemia/ hal/nap, napi 20 mg háromszor etetve) - OF csoport

Táplálkozás + fahéjcsoport (60mg Artemia/ hal/nap, napi 20 mg háromszor etetve + 2 mg fahéjpor/hal/nap, háromszor etetve 20 perccel azelőtt Artemia táplálás) - C + OF csoport

A zebrafish-t tartályonként 5 halban tartották; 36 tartályt használtak, egyenként 5 halból, a kísérlet során 12 tartályt adtak minden etetési csoportnak. Az ebben a vizsgálatban alkalmazott etetési eljárásokat Oka et al. [20]. Vércukor és plazma triglicerid elemzést, valamint olajvörös O festést és kvantitatív RT-PCR-t végeztünk. Mindegyik eljáráshoz 2 tartályt használtak, egyenként 5 halból. Mivel kísérletenként 10 halat elemeztek, a halak egyedi nyomon követése nem volt lehetséges, mintánként átlagolták a hosszúságot és a kapcsolódó paramétereket. 3-4 héten át táplálkozik Artemia elegendő ahhoz, hogy elhízást idézzen elő a zebrafish-ban, és ez a modell szorosan hasonlít az emberek elhízásának valóságához.

A halak testtömegének és hosszának mérése

Mind az etetési kísérletek megkezdése előtt (0. hét), mind a végén (4. hét) megmértük az érzéstelenített zebrafish testtömegét és hosszát. A mérések elvégzéséhez a halakat pufferolt tricaine alkalmazásával altattuk. A tricaine-t 0,02% -os koncentrációban állítottuk elő a létesítmény vízében, és a halakat átadtuk az elegyet tartalmazó főzőpohárba. Ezután megfigyelték az érzéstelenítés III. Stádiumát, amelyben egyensúlyvesztés, operkulumveszteség és reaktivitásvesztés következett be. Ezt a szakaszt általában egy perc alatt érték el, amely után méréseket lehetett végezni. A testtömeg grammban mért értékét úgy vontuk le, hogy a létesítményvíz főzőpohárának és a halaknak a tömegét kivontuk csak a létesítményvíz főzőpohárának súlyából; a Zebrafish Facility skála segítségével. A kísérlet során minden héten meghatározták a súlyt. A halakat hagyták kiheverni az érzéstelenítésből. A hosszúságot cm-ben mérték a száj elülső legtávolabbi pontjától a farokcsonk leghátsó legtájibb részéig vonalzóval, testtömeg felvétele után. Az egyes csoportok hosszát a 0. héten és a 4. hét idõpontjában mértük.

A vércukorszint elemzése

Az éhomi vércukorszintet a hátsó artériából elemeztük glükózmérővel (Accu-Chek, Roche). A halakat egyik napról a másikra megfosztották az élelemtől, és tricaine-nal altatták őket, mielőtt a hátsó artérián dorzális vágás történt. Vért vettünk pipettával és glükózmérő csíkra vittük; hasonló módon, mint a cukorbetegek.

A szérum triglicerid szint elemzése

A szérum triglicerid szint elemzéséhez vérmintákat gyűjtöttünk a hátsó artériából, és etetési csoportonként összes zebrafish-ból egyesítettük az egyes etetési kísérleteket. A vért összegyűjtöttük és mikrocentrifuga csőbe helyeztük, majd szobahőmérsékleten 30 percig inkubáltuk. A mikrocentrifuga csöveket ezután 5000 fordulat/perc sebességgel szobahőmérsékleten centrifugáltuk 15 percig, majd a szérumot elválasztottuk és trigliceridszint elemzésnek vetettük alá a szérum triglicerid meghatározó készlet (Sigma) segítségével a gyártó utasításainak megfelelően.

A zebrafish szövettani elemzése

A zebrafish-t altatás után 0,1 mg/ml tricaine-nal (Sigma-Aldrich) eutanizálták (kiindulási érték 2 hét után, 4 hét diéta után). A szövetek minőségének megőrzése érdekében a májat 10% -os pufferelt formalin oldattal (Histo-Fresh) rögzítettük. A szöveteket ezután 3 órán át 4 ° C-on szacharóz-oldatba helyeztük, majd folyékony nitrogénnel hűtött izopentánban gyorsan lefagyasztottuk. Ezután beágyazták a Tissue-Tek-be, és kriosztát segítségével boncolták őket. A fagyasztott 5 μm-es kriosztát-szakaszokat 0,5% Olajvörös O-val (BDH Laboratory Supplies) festették propilénglikolban, és ellenfestették Carazzi-féle haematoxilinnel (Sigma-Aldrich). A mintákat fénymikroszkóppal, Zeiss Axiovert 40 CFL mikroszkóppal figyeltük meg. A képeket beépített AxioCam színes kamerával szerezték be. A máj steatosisát a hepatociták területének mérésével határoztuk meg a National Institutes of Health ImageJ szoftver segítségével (http://rsbweb.nih.gov/) [35].

Kvantitatív RT-PCR

A májszöveteket kivágták a zebrafish-ból, és homogenizálás előtt Trizol-ban (Invitrogen) adták hozzá. Az RNS-izolálást 200 µl kloroformmal, 500 µl izopropil-alkohollal, 500 µl 75% -os etanollal és 30-50 µl RNS-mentes vízzel végeztük. Az RNS mennyiségi meghatározását Nanodrop spektrofotométerrel végeztük. Ezt követően a cDNS szintézist Oligo (dT) 18, 10 mM dNTP, 5X puffer, 0,1 mM DTT, RNase OUT és SSIII reverz transzkriptáz alkalmazásával hajtottuk végre. Végül a lemezezést 2X Sybr Green Master Mix-el (Bio-Rad) végeztük, és a következő anyagcserével kapcsolatos géneket számszerűsítettük: PPARAB, NR2F2, PPARGC1AL, ALDOCA, LDLR, PDE4BA, FOXO1, SREBF1, SREBF2, RARGA, ACTB-vel mint endogén kontroll gén (1. táblázat).