Az elhízással összefüggő bélmikrobioma-diszbiózis a bélpermeabilitás és az intesztinális sejtek homeosztázisában bekövetkező eltérésekkel függ össze, diétától függetlenül

1 Belgyógyászati-Molekuláris Orvostani és Mikrobiológiai és Immunológiai Tanszék, Wake Forest Orvostudományi Kar, Winston-Salem, NC, USA

diszbiózisa

2 Közegészségtudományi Osztály, Wake Forest School of Medicine, Winston-Salem, NC, USA

Absztrakt

1. Bemutatkozás

2. Anyagok és módszerek

2.1. Egerek

Körülbelül 8 hetes leptinhiányos (Lep ob/ob) és C57BL/6J hímek (

mindegyik csoportban) a Jackson Laboratóriumtól (Bar Harbor, ME, USA) szereztük be, és egy másik hőmérséklet-, páratartalom- és fényvezérelt (12 órás világos-sötét ciklusban) Wake Forest Animal Resource Program (ARP) létesítményben helyeztük el őket. 8 hét. Az egerek mindkét csoportját azonos táplálékkal etettük (Prolab® RMH 3000 5P00

a Lab Diets Inc.-től (St. Louis, MO), ad libitum. A székletmintákat és a testtömeg-mutatókat hetente gyűjtötték. 16 hét után kiszámítják a vércukor-, glükóz- és inzulin-tolerancia teszteket és a görbe alatti területet, ahogy azt korábbi publikációink leírják [6–8]. Ezután,

az egyes csoportokból származó állatokat CO2 kamrával eutanizálták, és a teljes vékonybelet (a nyombéltől az ileumig) alkalmazták organoid képződményekhez. Az állatok többi részét felhasználjuk a bélpermeabilitás, a bél szövettanának és a génexpressziós elemzések mérésére. Az összes állatkísérletet és eljárást a Wake Forest ARP IACUC jóváhagyta.

2.2. Bélorganoid képződés és tenyésztés

Minden egér teljes vékonybelet megtisztítottunk PBS-sel történő öblítéssel, majd hosszában felnyíltuk, megmostuk, tiszta PBS-be helyeztük és további 2 mm-es részekre vágtuk. A bélszegmenseket oda-vissza pipettáztuk, és hagytuk ülepedni. A mosásokat megismételték

2.3. Béláteresztési vizsgálat

Az állatok felét a bélpermeabilitás mérésére használtuk, miközben 4 órán keresztül nem volt hozzáférhető az élelemhez, majd 4 kDa FITC-dextránt (Sigma; 60 mg/100 g testtömeg) adtak be szájon át. 4 órás lenyelés után a vért a farokvénából gyűjtötték, és a szérumot a vér centrifugálásával elválasztották. A FITC fluoreszcencia intenzitását a plazmában mértük, hogy meghatározzuk a FITC-dextrán bélszivárgás mértékét [9].

2.4. Valós idejű PCR

A sejthalállal kapcsolatos gének kifejeződése (Rossz és Bax), a sejtek túlélése/szaporodása (azaz. Bcl2, Ccnd1, Cdk6, és Sox4), a bél őssejtjei (Lgr5, Olfm4, és Bmi1) [10], mucinbiológia (Muc2 és Muc6) és a szűk kereszteződések (occludin, zonulin-1, és Lekvár) valós idejű PCR-rel elemeztük (S1. táblázat). A teljes RNS-t RNeasy kit (Qiagen Inc., USA) segítségével izoláltuk, és reverz transzkripcióval nagy kapacitású reverz transzkripciós készletet (Applied Biosystems) használtunk, továbbá valós idejű PCR-hez cDNS-t használtunk, a korábbi tanulmányainkban leírtak szerint. 18S rRNS-t használtunk belső kontrollként. A relatív génexpressziót ΔΔCT eljárással számítottuk ki, és relatív hajtásváltozásként mutattuk be.

2.5. Western Blot elemzés

A bélszövetet (ileum) homogenizáljuk homogenizációs pufferben [6, 8], és Western blot elemzéseket hajtunk végre a szoros kapcsolódási fehérjék (például Zo1 és occludin) mérésére. A tubulint belső terhelésszabályozásként használták. A sávintenzitásokat ImageJ szoftverrel számoltuk, és hajtásváltozásként mutattuk be, miközben az egyes üregekbe töltött tubulin tartalommal normalizáltuk.

2.6. Hisztokémiai elemzés

A szövettani elemzéshez az egerek bélszöveteit összegyűjtöttük és PBS-sel, majd 10% -os formalinos oldattal mostuk. Ezután a bélszöveteket egy éjszakán át 10% -os formalinba mártottuk, és paraffin blokkokra rögzítettük, és a metszeteket 0,5 ° C-ra vágtuk μm vastagságú. A hematoxilin és az eozin (H&E) festését standard módszerek szerint végeztük, és a képeket AmScope mikroszkóppal készítettük 20-szoros nagyítással, 9MP digitális fényképezőgéppel. A villi hosszát és a bélfal vastagságát ImageJ szoftverrel mértük meg egy vakon.

2.7. Bélmikrobiom elemzés

A mikrobiómák elemzéséhez szükséges ürüléket azonnal steril csövekbe helyezték aszeptikus körülmények között, lefagyasztották és -80 ° C-on tárolták a további feldolgozásig. A mintákból származó DNS-t Qiagen DNS Stool Mini Kit (Qiagen, CA, USA) alkalmazásával extraháltuk, majd a 16S rRNS gént 515F (vonalkódolt) és 806R primerek segítségével amplifikáltuk, amelyek a 16S baktériumok V4 hipervariábilis régióját határozták meg, a következő módon: Earth Microbiome Project protokoll [11–13]. PCR-reakció után az amplikonokat Agencourt® AMPure® XP (Beckman Coulter) alkalmazásával tisztítottuk, a Qubit 3 fluoriméterrel (Invitrogen) számszerűsítettük, azonos koncentrációra (4 nm) normalizáltuk és Illumina MiSeq platformon történő szekvenáláshoz egyesítettük [12].

A 16S rRNS gén amplikonokat demultiplexeltük, minőségi szűrést és klaszterezést használtuk az alapértelmezett paraméterek felhasználásával a mikrobiális közösség elemzését lehetővé tevő Quantitative Insights Into Microbial Ecology (QIIME 1.8.0 verzió) szoftverben [11]. A szekvenciákat 97% -os szekvencia-hasonlósággal operatív taxonómiai egységekbe (OTU-k) csoportosítottuk, és az OC-khoz rendeltük az UCLUST in QIIME nyílt referencia-kiválasztó szoftveren keresztül. A taxonómia hozzárendelését és a diverzitás elemzését, beleértve a megfigyelt OTU-kat, valamint a Shannon, Chao1 és PD Whole Tree változatosság indexeket a QIIME-n keresztül alapértelmezett beállításokkal számoltuk ki, hogy összehasonlítsuk a baktériumok fajgazdagságát a két csoport között. Az egyes minták bakteriális összetételét különféle taxonómiai szinteken (fülön keresztül a nemzetségen keresztül) mértük QIIME alkalmazásával. Alfa és béta változatosságokat QIIME-n belül állítottunk elő súlyozott és súlyozatlan UniFrac távolságmátrixok felhasználásával. Az UniFrac távolságokat a baktériumközösségek közötti távolságként értékeljük, amely megmagyarázza a baktériumok filogenetikai kapcsolatát [14].

2.8. Statisztikai analízis

Az itt bemutatott összes érték átlag ± standard átlaghiba. Diák t-tesztet és post hoc ANOVA elemzéseket végeztünk a statisztikai szignifikancia megállapításához.

statisztikailag szignifikánsnak tekintették. A nem paraméteres Spearman-korrelációs együtthatókat a biom és az egér jellemzői között mutatjuk be az értékekkel a nulla korreláció nullhipotézisével szemben.

3. Eredmények

3.1. Megnövekedett béláteresztő képesség a ob ob ob ob egerekben, amelyek a csökkent szoros kötéshez és a mucin gén expresszióhoz kapcsolódnak

A bélpermeabilitás jelentős növekedését (amelyet a 4KDa FITC-dextran fokozott diffúziója jelzi a bélből a vérbe) figyeltek meg Lep ob/ob egerekben a B6 kontrollhoz képest (1. ábra (a)). A szűk kereszteződésű fehérjék, mint például (mRNS és fehérje) okkluzin, zonulin-1 (Zo1) és a kötési adhéziós molekula (Jam), valamint a mucin szintézis gén mRNS-ek (Muc2 és Muc6) expressziója szignifikánsan csökkent a Lep ob/ob-ben egerek (1. (b) –1. (d) ábra), ami arra utal, hogy a leptinhiányból eredő elhízás csökkentette a szoros junction és mucin szintézis gének expresszióját, ami megnövekedett permeabilitású bélszivárgást eredményezhet.

az értékeket úgy definiáljuk

3.2. Az elhízás összefügg a bél és a bél organoidjainak szerkezeti eltéréseivel

A villi hossza szignifikánsan csökkent, míg a kripta hossza nőtt a Lep ob/ob egerekben (1. (e) –1 (g) ábra), ami arra utal, hogy az elhízás jelentős szerkezeti eltéréseket váltott ki a bélszövetekben, az étrendi összetevők közötti különbség nélkül. . Az elhízásnak a bélsejtek bélszerkezeti felépítésének és fenntartásának képességére gyakorolt ​​hatásának további vizsgálatához elemeztük a Lep ob/ob-ből és normál egerekből előállított bélorganoidokat, és megállapítottuk, hogy a rügyképző képesség és az összes rügyek száma (kezdő organoidokban) ) szignifikánsan csökkent a Lep ob/ob-eredetű organoidokban (2. a) –2. c) ábra). Az elhízott eredetű organoidokban megnövekedett a központi térfogat a normál értékhez képest (az adatokat itt nem mutatjuk be), ami arra utal, hogy az elhízás a bélsejtek stabil változásainak kialakulásával járt, amelyek hozzájárulnak a bélszerkezet rendellenes szerveződéséhez.


az értékeket úgy definiáljuk

3.3. Sejtforgalom és szár növekedett a Lep ob/ob bélben

Az elhízásnak a bélsejtek homeosztázisára gyakorolt ​​hatásának további meghatározása érdekében, amely fenntartja a szövetek szerkezetét és integritását, megmértük a sejthalál/túlélés, proliferáció és őssejt gének expresszióját az organoidokban és a bélszövetben. Megállapítottuk, hogy mind a sejthalál (Rossz és Bax) és a sejtek szaporodása (Ccnd1, Cdk6, és Sox4) gének szignifikánsan megnövekedtek a Lep ob/ob egerek organoidjaiban és belében a normál értékhez képest (2. (d), 2. (e), 2. (g) és 2. (h) ábra). A sejt túlélési gén expressziója (Bcl2) elhízottaknál szignifikánsan csökkent (2. (d) és 2. (g) ábra). Ezenkívül az őssejtmarkerek, mint a leucinban gazdag ismétlődést tartalmazó G-fehérjéhez kapcsolt 5 receptorok (Lgr5), olfaktomedin 4 (Olfm4), és a BMI1 (protoonkogén, polikombos gyűrűsujj) expressziója növekedett a Lep ob/ob belekben, valamint azok organoidjaiban (2. (f) és 2. (i) ábra), ami arra utal, hogy az elhízáshoz kapcsolódó bél mikrobiom diszbiózis expozíció társul a bélsejtek gyorsabb/rendellenes sejtforgalma, fokozott szárral együtt [15].

3.4. A bel ob mikrobiom diszbiózisa és anyagcserezavarai társulnak a lep ob/ob egerekben, amelyek függetlenek az étrend különbségeitől
3.5. Az elhízott bél mikrobiom-diszbiózisa összefügg a bélsejtek homeosztázisával, amely szabályozza a béláteresztést és a mucinbiológiát


az értékeket úgy definiáljuk

4. Megbeszélés

Azonban itt még mindig nem tudjuk, kik járultak hozzá elsősorban az ilyen változásokhoz, az elhízáshoz vagy a bél mikrobiom-diszbiózisához, és az ilyen ok-okozati és következményes hatások további vizsgálatokat indokolnak. Az ilyen hatások azonban egyértelműen függetlenek az étrend-összetevők különbségeitől. Ezért sok mindent meg kell találnunk annak érdekében, hogy tisztázzuk az elhízás, a mikrobiota és a bélpermeabilitás közötti összefüggést, amely hozzájárulhat a rendellenes bélműködéshez és a sejtes homeosztázishoz.

5. Következtetések

A bél mikrobioma hozzájárulása az elhízás patofiziológiájában ismert; hatásmechanizmusa (i) azonban nincsenek pontosan meghatározva. Vizsgálatunk szoros kapcsolatot hozott létre az elhízással összefüggő bélmikrobiom diszbiózis között, hogy rendellenességeket okozzon a bél sejtforgalmának homeosztázisában és a bélpermeabilitás szabályozásának funkcióiban, függetlenül az étrendi összetevőktől, például a magas zsírtartalomtól. Bár vizsgálatainknak még mindig vannak korlátai a mikrobiómás diszbiózis által kiváltott sejtszintű forgalom változásának ok-okozati összefüggése és ennek következménye közötti összefüggések magyarázatára, vagy fordítva, eredményeink határozottan támogatják a tápanyag-mikrobiom-gén kölcsönhatások szerepének vizsgálatának alapját a bélfiziológia modulálásában az elhízás patológiájában.

Adatok elérhetősége

A tanulmány eredményeinek alátámasztására létrehozott és felhasznált összes adatot a cikk és a kiegészítő információs fájl (ok) tartalmazzák. Bármely további adat, amely alátámasztja a tanulmány eredményeit, kérésre rendelkezésre áll a megfelelő szerzőnél.

Összeférhetetlenség

Erre a munkára nem jelentenek be összeférhetetlenséget.

Köszönetnyilvánítás

Ezt a munkát a Wake Forest Orvostudományi Kar és a Cukorbetegség, elhízás és anyagcsere központja, valamint a Védelmi Minisztérium finanszírozása támogatta (PR170446). Ezenkívül a szerzők szeretnék elismerni a Wake Forest Klinikai és Transzlációs Tudományos Intézet (WF CTSI) finanszírozási támogatását, biostatisztikáját és angol nyelvű szerkesztését, amelyet a Transzlációs Tudományok Fejlesztésének Országos Központja (NCATS), a National Egészségügyi Intézetek az UL1TR001420 számú támogatási díj révén.

Kiegészítő anyagok

Kiegészítő S1 ábra: a testtömeg (a), az éhgyomri (b) és az etetett (c) Lep ob/ob és C57BL/6J egerek vércukorszintje (

minden csoportban). Glükóz-tolerancia teszt (d) és inzulin tolerancia teszt (e), valamint a görbe alatti terület a GTT (f) és az ITT (g) során Lep ob/ob és B6 egereknél. Az itt bemutatott értékek átlag ± SEM/SD. az értékeket a, és. Kiegészítő S2 ábra: alfa diverzitási indexek, mint például a filogenetikai fokú (PD) fa (a), a Chao1 (b), a megfigyelt OTU-k (c) és a Shannon-index (d) a bélmikrobiom Lep ob/ob és C57BL/6J egerekből. S1. Táblázat: valós idejű PCR-hez használt primer szekvenciák (egér) (átvette: PrimerBank: https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/). S2. Táblázat: a Lep ob/ob-ben szignifikánsan eltérő mikrobiális közösségek relatív bősége a C57BL/6J (B6) egerekben. S3. Táblázat: Spearman-korreláció elemzése metabolikus, bélpermeabilitási, bélszerkezeti és génexpressziós elemzések között Lep ob/ob és C57BL/6J egerek bélmikrobiómás aláírásával. (Kiegészítő anyagok)

Hivatkozások