Az ősi mikrobiómák helyreállítása elősegíti a bogár alkalmazkodását az új étrendekhez

Keresse meg ezt a szerzőt a Google Tudósban
Keresse meg ezt a szerzőt a PubMed oldalon
Keresse meg ezt a szerzőt ezen a webhelyen
Levelezés céljából: aagarwal @ ncbs.res.indagashe @ ncbs.res.in

ABSZTRAKT

BEVEZETÉS

A gazdaszervezethez tartozó mikrobák döntő fontosságúak lehetnek a gazda túlélése szempontjából [1], ezt példázza a rovar-gazda társulásokkal kapcsolatos nagy munka. Különösen a bélhez kapcsolódó mikrobiális szimbiontok biztosíthatják rovar gazdaszervezeteiket korlátozó tápanyagokkal [2], vagy fokozhatják a komplex vegyületek emésztését. Például az Aedes aegypti szúnyog belében lévő baktériumok segítik a vörösvértestek lízisét, lehetővé téve a tápanyagok hatékony felszívódását a gazda részéről [4]. A mikrobák elősegíthetik a gazda-étrend méregtelenítését is, amint azt a bab- és büdösbogaraknál megfigyelték, amelyek szimbiontusai lebontják az inszekticideket [3, 5]. A bélbaktériumok tehát közvetlenül befolyásolhatják a gazdaszervezet fittségét: az antibiotikumok beadása csökkenti az A. aegypti termékenységét [4], és késlelteti a lárvák növekedését Anopheles stephensi-ben [6]; és a csíra nélküli Drosophila csökkent élettartamot és lárvák növekedését mutatja [7].

Az ilyen erős gazda-bél mikrobás asszociációk nagyobb valószínűséggel alakulnak ki stabil környezetben [8], különösen, ha a mikrobák a gazda generációkon keresztül terjednek. Nem világos azonban, hogy az ilyen rovar-bél mikroba kölcsönhatások fennmaradhatnak-e, és ha igen, mennyiben tarthatók fenn, ha a gazdák életük során, vagy az egymást követő generációk során jelentős környezeti változásokat tapasztalnak. Például a generalista rovarok több generációval is táplálkozhatnak néhány generáció alatt, és potenciálisan mintát vehetnek az étrendhez kapcsolódó mikrobiális közösségek sokféleségéből. Általánosabban elmondható, hogy amikor bármely rovar étrendi váltáson megy keresztül, a gazda és annak mikrobiomja is új szelekciós nyomásnak lehet kitéve. Ha a gazdaszervezet hasznát veszi az ősi élőhelyen található bélmikrobiómának, egy étrendi váltás megzavarhatja a jótékony mikrobaközösséget és csökkentheti a gazdaszervezet fittségét. Ebben a forgatókönyvben milyen lehetséges adaptív pályák állnak a gazdaszervezet rendelkezésére, és milyen hatással van a mikrobiomjára?

Általánosságban elmondható, hogy a gazda diéta eltolódásának négy lehetséges hatása van a mikrobiomra (1. ábra). Mindegyik esetre két további lehetőség van: a gazda és annak mikrobiális közössége funkcionálisan társulhat, vagy a gazda csak passzívan szerezheti be és helyezheti el a mikrobiális közösséget. E pályák valószínűsége több tényezőtől függ, például az ős- és új diéták tápanyagtartalma és fitnesz következményei közötti különbségtől; az étrendhez kapcsolódó mikrobák közötti különbség az egyes környezetekben; valamint az adaptív mutációk relatív aránya a gazdaszervezetben és a mikrobákban. A mai napig azonban egyetlen tanulmány sem tesztelte közvetlenül a környezeti változások hatását a gazda-mikrobiom társulások hosszú távú sorsára. A gyors környezeti változás sajátos példájaként az étrendi váltások lehetőséget kínálnak ennek a hiányosságnak a kezelésére. Mivel az étrendi változások mindenütt jelen vannak a rovarok között, a gazda-mikrobiom kölcsönhatások vizsgálata az étrend-váltások összefüggésében új betekintést nyújthat a rovarökológiába és az evolúcióba is.

Megjegyezzük, hogy bár a mikrobák egészen biztosan mutációkat fognak szerezni a gazda diéta szar alatt, itt csak olyan mutációkra utalunk, amelyek befolyásolják a gazdaszervezet fitneszét.

MÓD

Bogárpopulációk

Valamennyi kísérlethez a Tribolium castaneum bogár kinőtt populációját használtuk, amelyet 12 vadon gyűjtött populáció felnőttjeinek felhasználásával generáltunk Indiából. 4 hét diszkrét generációs ciklusban tartottuk fenn a készletállományt az egyetlen vállalattól beszerzett búzalisztben. Lisztzsákokat -80 ° C-on tartottunk 4 órán át, hogy elpusztítsuk a lisztben lévő rovartojásokat. Ezt követően hagytuk, hogy a zsákok szobahőmérsékleten megolvadjanak. Ezt a lisztet használtuk minden kísérletünkhöz. Minden generációnak hagytuk, hogy a felnőttek 1 hétig peteérjenek, majd eltávolítottuk őket a lisztből. Négy hetes fejlesztés után a kapott felnőtt utódokat használtuk a következő generáció beindításához. A populációkat kerek műanyag dobozokban helyeztük el, generációnként 2500-3000 felnőtt.

Kísérletileg fejlődő, új erőforrásokhoz alkalmazkodó populációk számára (13 kukorica és 12 cirok populáció) 100, 200 vagy 500 felnőtt felnőtt populációt alapítottunk 1 g liszt sűrűségű egyedenként (a populációk egy független vizsgálat részét képezték, amely változót igényelt alapító népességméretek). Ezeket a populációkat diszkrét generációs ciklusokban is fenntartották. Mivel a kukoricában a lárvák fejlődése lassú, a kukorica populációinak 6 hét fejlődését engedélyeztük, ami kevesebb generációs kísérleti fejlődést eredményezett a kukoricában. Minden generációban az élő felnőtt utódok számát és az egy főre eső népesség becsült növekedési ütemét a következő módon számoltuk össze: (# Felnőttek t - # Felnőttek t − 1)/(# Felnőttek t − 1).

A liszthez kapcsolódó mikrobiális közösségek megzavarása

Megzavartuk a liszt mikrobaközösségét azzal, hogy vékony lisztrétegeket sugároztunk UV fény alatt 2 órán át egy lamináris burkolatban, légáramlás nélkül. Alternatív megoldásként lisztet keverhetünk három különböző széles spektrumú antibiotikum (tetraciklin, ampicillin vagy kanamicin, 0,005 tömeg%) egyikével. Egyetlen tojást vagy felnőtteket adtunk hozzá a kezelt liszthez egy lamináris burkolatban (96 lyukú mikrotányérokban, petrezselyemben, mikrocentrifuga csövekben vagy dobozokban), és az összes edényt nagyobb légmentesen lezárt dobozokban tároltuk a kísérlet ideje alatt, hogy megakadályozzuk a későbbi szennyeződéseket. A kontroll csoportokat (kezeletlen liszttel) azonos körülmények között kezeltük és tároltuk, csak a besugárzási lépést elhagyva.

Fitness vizsgálatok

Az új környezet sikeres gyarmatosításához a női termékenység és az utódok túlélése egyaránt kritikus fontosságú. Ezért az alkalmasság becsléséhez megtermékenyedést és a petesejt túlélését mértük a mikroba kimerült és a kezeletlen liszt esetében. A termékenység mérésére 2 hetes felnőtt nőstényeket 0,7 g átszitált lisztben 48 órán keresztül izoláltunk, és megszámoltuk az egyes nőstények által rakott peték számát (n = 25 nő kezelésenként). A tojás túlélésének mérésére összegyűjtöttük

100 állomány a törzsállományból, és 24 órán át hagytuk ovipozíciót 100 g átszitált búzalisztben (# 50-es szitán történő szitálás eltávolítja a nagy lisztrészecskéket, megkönnyítve ezzel a tojások azonosítását és számlálását). A tojásokat 96 lyukú lemezeken izoláltuk, és liszttel láttuk el az egyes kísérleti kezelésekhez szükséges liszttel (pl. Kezeletlen vagy UV-kezelt liszt). Megszámoltuk a túlélő utódok számát 3 hét után (n = 96 petesejt/kezelés/blokk; kezelésenként két független blokk).

Kísérletileg kifejlődött populációk esetében 50 nőstényt gyűjtöttünk össze a 17. generáció (cirokhoz adaptált populációk esetében) vagy a 10. generáció (a kukoricához adaptált populáció) ütemezett 1 hetes ovipozíciós periódusa után. Emlékezzünk arra, hogy ezeket a nőstényeket egyébként eldobták volna; ezért ezen vizsgálatok során nem zavartuk a fejlődő populációkat. A nőstények ebben a szakaszban 2-3 hetesek voltak, jóval a termékenységi csúcsidőszakon belül. A termékenység mérésére izoláltuk a nőstényeket, és hagytuk őket, hogy petesejtbe kerüljenek

0,7 g szitált liszt (kezeletlen vagy UV-kezelt kukorica vagy cirok; n = 25 nő/kezelés) 48 órán át. A tojás túlélésének mérésére összegyűjtöttük

100 egyed a 18. generációban (cirok adaptálva) vagy 11. generációban (kukorica adaptálva), és hagytuk őket 24 órán át 50 g átszitált lisztben peteérni. A tojás túlélését a megfelelő erőforrásban mértük a fent leírtak szerint. Azok a fejlett vonalak, amelyek nem alkalmazkodtak sikeresen az új forrásokhoz, nagyon alacsony népességszámmal rendelkeztek, ezért nem volt elegendő mintanagyságunk a fitnesz vizsgálatok elvégzéséhez.

Mikrobák megismertetése az UV-kezelt liszttel

Az ősök vagy a kialakult populációkhoz kapcsolódó mikrobák fitnesz hatásának elemzéséhez ezeket a mikrobákat bevezettük az UV-kezelt szitált lisztbe, lárva székletanyagon keresztül. Az ősmikrobák hatásának teszteléséhez megengedtük

kéthetes korban) egy búzakészletből 24 órán át UV-kezelt lisztben fogyasztani és üríteni. A lárvák bevitelének mikrobafüggetlen hatásainak kontrollja érdekében a liszt felét ismét UV-vel kezeltük a mikrobiális terhelés csökkentése érdekében. Ezután mértük a termékenységet mikrobákkal dúsított vagy kimerített kezelésekben, a fent leírtak szerint (n = 25 nő/kezelés). Az adaptált populációkból származó mikrobák hatásának teszteléséhez a 8. generációban összegyűjtöttük a cirokhoz adaptált populációból származó felnőtteket, és hagytuk őket, hogy friss ciroklisztben peteérjenek. 2 hét múlva gyűjtöttük össze a lárvákat, és ezeket használtuk a cirokhoz kapcsolódó mikrobák bevitelére UV-kezelt búzában vagy cirokban. Hasonlóképpen összegyűjtöttük a felnőtteket a kukoricához adaptált populációból a 12. generációban, hagytuk, hogy friss kukoricalisztben peteérjenek, és 2 hetes lárvákat használtunk kukoricához adaptált mikrobák bevitelére az UV-kezelt kukoricában.

A bakteriális közösség összetételének meghatározása

A 16S rRNS gén amplikonszekvenálásával meghatároztuk a lisztmintákhoz és a bogarakhoz tartozó baktériumközösséget. Minden kezeléshez 2-7 egyedet (lárvákat vagy 1 hetes felnőtt nőstényeket) izoláltunk, és 70% -os etanollal a felületen sterilizáltunk, majd DNSse-vel és RNSse-mentes ultratiszta vízzel mostuk. A liszthez kapcsolódó mikrobák azonosításához négy ismételt lisztmintát gyűjtöttünk (

Átlagosan azt találtuk

300 bakteriális OTU lisztmintákban és

450 baktérium OTU a bogármintákban (S1-S3. Ábra). Először az egyes mintákban jelen lévő teljes baktériumközösséget szemléltettük korlátlan klaszterező megközelítés (Principle Coordordinate analysis, PcoA) felhasználásával az R csomag majom v5.1 [16] pcoa függvényével, és a grafikonokat generáltuk a R csomag BiplotGUI [17]. Korlátozott klaszterezést (ordinációs elemzést) is alkalmaztunk a CAPdiscrim függvénnyel a BiodiversityR csomagban [18]. A liszt- és erőforrás-kezelések teljes baktériumközösségekre gyakorolt hatásának statisztikai teszteléséhez PERMANOVA-elemzéseket használtunk, amelyek Adonis funkcióval valósultak meg a Vegan csomagban [19].

A teljes baktériumközösség összetett, ezért nehezen látható. Ezért a legdominánsabb bakteriális OTU-k variációjának vizualizálása érdekében elemeztük az öt leggyakoribb OTU-t is egy adott kezelés ismételt mintáin keresztül (lásd például az S4 ábrát). Ezek a domináns baktériumok nagyobb valószínűséggel funkcionális szerepet játszanak a gazda-mikroba asszociációban, mivel azt várjuk, hogy a hasznos baktériumok dúsulnak a bogárral társult közösségben. Ne feledje, hogy az összehasonlító halmazon belüli különféle minták nem oszthatják meg a leggyakoribb OTU-kat. Ennélfogva a legelterjedtebb OTU-k végső listájában egy adott összehasonlításban bárhol rendelkezhetünk 5 OTU-val (ha az összes bőséges OTU-t megosztjuk) és 25 OTU-val (ha az öt leggyakoribb OTU minden csoport esetében egyedi volt). Az összes olyan baktériumos OTU-t, amely egyetlen mintában sem volt az öt leggyakoribb, a „többi” kategóriába soroltuk.

Eredmények és vita

Darwin híresen megkezdte mérföldkőnek számító dolgozatát a linnai társadalom számára [20] az „Minden természet háborúban van” kifejezéssel, utalva az élőlények folyamatos létharcára. Sok eukarióta azonban nincs egyedül ebben a küzdelemben, hanem olyan mikrobákra támaszkodik, amelyek alapvető fitneszelőnyöket nyújtanak. Az ilyen gazdaszervezet-mikroba kapcsolatok megértésének legnagyobb része azonban egyetlen környezetben végzett vizsgálatokból származik. Mi történik, ha az élőlények szétszóródnak új élőhelyeken, mikrobiomjuk megszakad, és mikrobiális partnereik vagy hiányoznak, vagy nem tudnak megtelepedni az új környezetben?

A bogár fittsége az ősliszt mikrobáitól függ, de nem újszerű erőforrás

Először azt teszteltük, hogy a lisztbogarak mikrobiális flórájukból származnak-e fitnesz előnyök, és hogy a mikrobák környezettel szerezhetők-e be vagy vertikálisan terjednek-e. Megzavartuk a lisztbogarak környezetéhez kapcsolódó mikrobaközösséget azáltal, hogy a lisztet UV sugárzással kezeltük, és az egyéneket bevezettük a kezelt lisztbe. 48 órán belül a női termékenység jelentős csökkenését figyeltük meg az UV-kezelt búzalisztben (2A. Ábra; t-teszt UV-kezelt és kezeletlen búzaliszthez, p = 0,0002. Hasonlóképpen, sokkal hosszabb időtartamokban (3 hét), a petesejt túlélése az UV-kezelt búzában is csökkent (2B ábra; ChiSq teszt a számlálási adatokhoz, p = 0,003), csakúgy, mint más fitnesz-helyettesek, például a felnőttek élettartama és a testtömeg (S5. ábra; Kaplan-Meier-teszt az élettartamra: p 0,05; 2A-B. Ábra), és az ampicillin hozzáadása a cirokliszthez nem változtatta meg a cirok termékenységét (t-teszt az ampicillin cirok hatására, p = 0,99; S6C ábra). Tehát a bogár fittsége erősen függ a liszthez kapcsolódó környezeti mikrobáktól mind a lárva, mind a felnőtt életszakaszban, de csak abban az ősbúzában, amelyhez a gazdaszervezetek jól alkalmazkodtak.

Miért erőforrásfüggő a lisztes mikrobák fitnesz hatása? Az egyik lehetőség az, hogy az új erőforrások annyira nem optimálisak, hogy ezekben a vizsgálatokban nem tudtuk észlelni a liszt mikrobák kis hatását. Ez azonban valószínűtlen, mert a bogár fitnesze az ujjak kölesben és a cirokban drámai módon nem különbözik a kezeletlen búzáétól (2A-B. Ábra). Eredményeink tehát valószínűleg nem tükrözik az új környezet által előidézett szelekció erősségét. Egy másik lehetőség az, hogy az új erőforrások mikrobaközösségét nem zavartuk meg kellőképpen, ezért nem figyeltünk meg fitneszhatást. A 16S rRNS amplikon szekvenálás azonban azt mutatta, hogy a különböző lisztek különböző baktériumközösségeket hordoznak, és hogy az UV-kezelés mindegyik esetben jelentősen megzavarta a közösségeket (S7. Ábra; PERMANOVA: presource Az ősmikrobák új erőforrásokba történő bevezetése növeli a termékenységet. búza mikrobákkal dúsított lisztben, vagy további UV-kezelés után dúsított lisztben (lásd a vázlatot a tetején; + Wh = búza mikrobák; n = 25 nő kezelésenként; a dobozok és a nyers adatok a 2. ábrán leírtak szerint láthatók). szignifikáns különbség a kezeletlen és az UV-vel kezelt erőforrások között.

A dobozos táblák a búza mikrobákkal dúsított lisztbe vagy a további UV-kezelés után dúsított lisztbe rakott tojások mediánszámát mutatják (lásd a vázlatot a tetején; + Wh = búza mikrobák; n = 25 nő kezelésenként; a dobozok és a nyers adatok a leírás szerint vannak feltüntetve) a 2. ábrán). A csillagok jelentős különbséget jeleznek a kezeletlen és az UV-vel kezelt erőforrások között.

Az ősök mikrobiomjának fokozatos helyreállítása segíti az új erőforrásokhoz való alkalmazkodást

(A)A kísérleti evolúciós rendszer sematikus ábrázolása. (B és C) A felnőttek száma populációnként generációkonként, alkalmazkodó populációk számára (fekete) és egy olyan populáció számára, amely nem alkalmazkodott sikeresen (piros), a (B) kukorica és (C) cirok. (D) Termékenység (n = 25 nő kezelésenként) kezeletlen vagy UV-kezelt lisztben az ős nőstényeknél („Anc”: egyetlen generáció számára táplálkoznak az új erőforrással), vagy az új erőforráshoz alkalmazkodó populációkból származó nőknél („ Ada ”). A dobozdiagramokat és a nyers adatokat a 2. ábra írja le. A csillagok jelentős különbséget jeleznek a kezeletlen és az UV-vel kezelt erőforrások között. (E) A túlélő utódok frakciója 3 hét fejlődés után kezeletlen vagy UV-vel kezelt lisztben (n = 96 állományban gyűjtött tojás kezelésenként), az ősökből vagy adaptált populációkból származó peték esetében, a fentiek szerint. A csillagok jelentős különbséget jeleznek a kezeletlen és az UV-vel kezelt erőforrások között.

Újszerű, mégis egyszerű alkalmazkodási út új élőhelyeken

Eredményeink alapján (összefoglalva a 6. ábrán) a gazda-mikrobiom társulás változásainak következő pályáját feltételezzük az adaptáció során. Közvetlenül az új élőhelyek bevezetése után az alapító bogarak mikrobiomája drámai módon elmozdult, hogy tükrözze az új étrendhez kapcsolódó baktériumközösséget. Noha az alapító felnőttek búzaszármazású baktériumokat is hordoztak (és vezettek be) székletükön keresztül, ezek a baktériumok vagy ritkák voltak, vagy nem voltak képesek hatékonyan megtelepíteni a bogár bélét az új liszthez kapcsolódó mikrobák és az új étrend jelenlétében. Így kezdetben nagyon kevés bogárban voltak hasznos baktériumok. Nemzedékeken át - mivel a baktériumokat hordozó egyedek is többet szaporodtak - az ősi jótékony baktériumok bősége megnőtt az új élőhelyen. Ebben a szakaszban megfigyelhettük a bogár fittségének a liszt mikrobáktól való függését.

A „+” jelek a bogarak relatív alkalmasságát jelzik az egyes erőforrásokban, liszttel kapcsolatos mikrobákhoz való hozzáféréssel vagy anélkül (amint azt a bogarakban lévő baktériumok jelzik). Azokat az eseteket, amikor jelentős mikrobafüggő fitnesz-csökkenést figyeltünk meg, halványzöld színnel emelünk ki (a normál és kimerült mikrobiális terhelésű bogarak páros összehasonlítása alapján). Az üres cellák hiányzó adatokat jeleznek.

Mivel a bogarak különböző erőforrásokban gyűltek össze hasonló közösségeken, azt is feltételezzük, hogy az ilyen generalista bogarakhoz kapcsolódó baktériumok maguk is generalisták lehetnek, fokozva a gazdaszervezet fittségét több erőforráson keresztül. Valójában az Enterococcus nemzetségből és az Enterobacteriacae családból származó baktériumok (a búza-adaptált bogarakhoz társuló domináns taxonok) gyakran előfordulnak több rovar belében [8]. Az Enterococcusok általában sokféle cukrot és szénhidrátot hasznosíthatnak; például az emberi bél kommenzális Enterococcus faecalis képes megemészteni a növényi alapú szénhidrátok, például a cellulóz széles skáláját, amelyet az emberek nem tudnak megemészteni [21, 22]. Hasonlóképpen, az Enterobacteriacae család tagjai általában raktározott gabonaraktárakban találhatók, és különféle gabonaféléken növekedhetnek [23]. Így ezek a baktériumok metabolikusan képesek lehetnek több erőforrás felhasználására. További munkánk során reméljük, hogy megvizsgáljuk, hogy ezek a taxonok különösen alkalmasak-e a bogárbél gyarmatosítására és/vagy különféle gabonamagvak felhasználására, és kifejezetten felelősek-e a megfigyelt bogár-mikrobiom társulásért.

Következtetések

Meglepően gyors és megismételhető ősi mikrobiómák helyreállítását figyeltük meg a különböző erőforrásokban és populációkban, ami egy érdekes paradigmára utal a gazda evolúciójára az új élőhelyeken. Javasoljuk, hogy ez általános jelenség lehet, amikor az ősmikrobák bejuttatása csökkentheti a gazdaszervezet kihalásának valószínűségét egy új környezetben. Ezzel szemben a gazda által közvetített mikrobiális szétszóródás lehetővé teheti a baktériumok számára a különféle élőhelyek gyarmatosítását is, miközben jelentősen megváltoztatja a mikrobiális közösségeket az új környezetekben. Ezért mind a bakteriális partnerek, mind a gazdaszervezet befolyásolhatják egymás képességét az új környezetek mintavételezésére és gyarmatosítására. Tanulmányi rendszerünk egyedülálló lehetőséget kínál a gazdaszervezetek és a hozzájuk kapcsolódó baktériumok elemzésére a gazda-mikrobiális asszociációk létrejötte során.

A SZERZŐ HOZZÁJÁRULÁSAI

Eltervezett és megtervezett kísérletek: DA, AA. Végzett kísérletek: AA. Elemzett adatok: AA, DA. Írta a kéziratot: DA, AA. Megszerzett finanszírozás: DA.

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

Köszönjük az Agashe labor tagjainak a kézirathoz fűzött megjegyzéseket; Amruta Rajarajan, Soumya Panyam, Gaurav Agavekar és Riddhi Deshmukh laboratóriumi segítségért; Gaurav Diwan, Kruttika Phalnikar, Umesh Mohan és Rittik Deb a QIIME és R elemzéshez nyújtott segítségért; valamint Awadhesh Pandit és az NCBS Next Generation Sequencing létesítményének egyéb munkatársai. Elismerjük a Wellcome Trust DBT India Alliance Fellowship (IA/I/17/1/503091 támogatás száma DA-nak) és a Nemzeti Biológiai Tudományos Központ (NCBS) támogatását és támogatását.