Az elválasztás utáni magas zsírtartalmú étrend növekedési porc elváltozásokat eredményez fiatal hím patkányokban

Samuel S. Haysom

1 Anatómiai és Orvosi Képalkotó Tanszék, Aucklandi Egyetem, Auckland, Új-Zéland

Mark H. Vickers

2 Liggins Intézet és Gravida: Nemzeti Növekedési és Fejlesztési Központ, Aucklandi Egyetem, Auckland, Új-Zéland

Lennex H. Yu

1 Anatómiai és Orvosi Képalkotó Tanszék, Aucklandi Egyetem, Auckland, Új-Zéland

Clare M. Reynolds

2 Liggins Intézet és Gravida: Nemzeti Növekedési és Fejlesztési Központ, Aucklandi Egyetem, Auckland, Új-Zéland

Elwyn C. Firth

2 Liggins Institute és Gravida: Nemzeti Növekedési és Fejlesztési Központ, Aucklandi Egyetem, Auckland, Új-Zéland

3 Gyakorlástudományi Tanszék, Aucklandi Egyetem, Auckland, Új-Zéland

Sue R. McGlashan

1 Anatómiai és Orvosi Képalkotó Tanszék, Aucklandi Egyetem, Auckland, Új-Zéland

Társított adatok

Minden releváns adat megtalálható a dokumentumban és a kiegészítő információkat tartalmazó fájlokban.

Absztrakt

Bevezetés

Az elmúlt években a fiatalkori elhízás riasztóan elterjedt, és számos mozgásszervi betegség társult az elhízottak nagyobb gyakoriságához az elhízott gyermekeknél és serdülőknél [1–3]. Néhány gyakori mozgásszervi betegség jelenléte gyermekkorban jelentős kockázati tényező az ortopédiai betegség későbbi életében. Például a gyermekkori törés növeli a törések kockázatát a későbbi életkorban [4, 5]. Az elhízott gyermekeknek nagy a kockázata, hogy elhízott felnőttekké váljanak [6, 7]. Az elhízás az osteoarthritis (OA) jelentős kockázati tényezője a felnőtteknél, és a krónikus gyulladás (szisztémásan és lokálisan is az ízületen belül) komplex kölcsönhatásaihoz, a bél mikrobiota állapotához és az immunműködési zavarhoz kapcsolódik [8–10]. A túlsúlyos vagy elhízott serdülők ízületi fájdalmakról panaszkodnak, kevésbé mozgékonyak [11, 12], és gyermekkorukban kevésbé hajlamosak az erőteljes tevékenységre. Az oszteoartritisz a fiatalok elhízásával járó morbiditás lehet, és ma már a metabolikus szindróma [13] alkotóelemeként szerepel, amelynek prevalenciája növekszik [14].

A mozgásszervi megbetegedéseket leíró jelleggel jól dokumentálták a végstádium idején, de ezeket nehéz tanulmányozni a korai stádiumú krónikus betegségeknél vagy azok kialakulása előtt. Ez különösen alkalmazható túlsúlyos vagy elhízott állapotban lévő ízületi megbetegedések esetén, amelyet a plazma adipokinek és gyulladásos citokinek megnövekedett koncentrációja jellemez, amelyekről ismert, hogy befolyásolják a porcokat [15–17]. A fiatalkori elhízott állapot teljes következményei a mozgásszervi funkciókra továbbra is homályosak a mechanisztikus szinten, különösen az elhízás a növekedés és a fejlődés időszakában. Noha a szisztémás és helyi ízületi adipokinek és gyulladásos citokinek szerepet játszanak az OA patogenezisében (áttekintve [8, 15]), a tanulmányok idősebb állatokra korlátozódtak [17, 18]. A citokinek hatása a fejlődő ízület porcaira (hyalin izületi porc és epifízis növekedési porc (EGC), amelyeket néha artikuláris-epifízis-porc-komplexnek neveznek), vagy a fiatal korban a fizikai aktivitás hatása nem tanulmányozták intenzíven.

Jelen vizsgálatunkban 4 hónapos, normál terhességből származó hím patkányokat vizsgáltunk, hogy megállapítsuk, vajon az elválasztáskor bevezetett magas zsírtartalmú (HF) étrend étrend okozta elhízást eredményez-e, ami rendellenes plazma gyulladásos biomarkereket és a combcsont és a comb morfológiáját eredményezi. tibialis hyalin ízületi és növekedési porcok. Feltételeztük azt is, hogy az önkéntes futókerék fizikai aktivitása jelentős hatással lenne a porc egészségére és az elkötelezettségre gyakorolt ​​védő hatásokra.

Anyagok és metódusok

Állatok

Az Aucklandi Egyetem Állatetikai Bizottsága jóváhagyta a vizsgálat összes létesítményét, eljárását és lefolytatását. A hím Sprague-Dawley elválasztó patkányokat (n = 40, 21 napos - d21) párokban, normál 40,6 x 50,8 x 20,9 cm-es ketrecekben tartottuk, 25 ° C-on és 12/12h fény: sötét ciklusban tartottuk. A patkányokat az Aucklandi Egyetem, a Vernon Janson Animal Unit-ból szerezték be. A testsúlyt és az élelmiszer-fogyasztást hetente kétszer regisztrálták, és a víz szabadon hozzáférhető volt. D21-től d63-ig a patkányok ad libitum hozzáféréssel rendelkeztek magas zsírtartalmú (HF) étrendhez (zsírból 45% kcal, D12451; Research Diets, Inc., New Brunswick, NJ) vagy kontroll Chow étrendhez (18% kcal zsír, 2018 Harlan Teklad, Egyesült Királyság). A d63 – d121-től kezdve az egyes diétacsoportok felénél csak spontán ketrec-aktivitás (SED) volt, míg a másik önként futókeréken is gyakorolhatott. Ez kiegyensúlyozott formában 4 csoportot eredményezett (n = 10 csoportonként), akár chow-, akár HF-diétával táplálva, 8 hetes testmozgással vagy anélkül, d63-65 és d121 között, az alábbiakban HF-SED, HF-Ex, Chow-SED néven. és Chow-Ex.

Kerékgyakorlat felvétele

A patkánypárok aktivitását 24 napon keresztül, egy napon rögzítettük a d70, 80, 90, 100 és d110 közelében vagy annak közelében, a futókerék gyakorlási aktivitását (méterben futott távolság) pedig 15 percenként (Lafayette Instrument Company, Lafayette)., IN), kivéve olyan rövid eljárásokat, mint a ketrec tisztítása, valamint az étel/víz ellátása. Az adatok azt mutatták, hogy mindkét testmozgási csoport teljes gyakorlati aktivitásának 96,2% -a 18 és 6 óra között halmozódott fel, és így az elemzést csak a sötét periódusra vonatkozó adatok alapján végezték el, miután levonták a fényidőszak rövid időintervallumait a teljes 24 órás távolságból. Az összes csoport futási távolságát ketrecenként 5 mérési periódusból számoltuk. A ketrecekben patkánypárok spontán mozgását nem mértük.

A testösszetétel és a testméret

Kettős energiájú röntgenabszorpciós (DXA) pásztázást (Lunar Prodigy, GE, Waltham, USA) d117-en végeztünk, könnyű izofluorán altatásban, patkánynál a szegycsont fekvésében. A testösszetételt (zsír- és sovány tömeg) dedikált állatszoftverrel számoltuk ki (Lunar Prodigy, Madison, USA). A d119-122-nél a patkányokat egy éjszakán át éheztettük, és nátrium-pentobarbitonnal (60 mg/kg, IP) végzett érzéstelenítést követően lefejezéssel leöltük. A bal combcsontot, valamennyi szalagot és inát eltávolítva, digitális féknyereggel mértük.

Vérplazma biomarkerek

A vért azonnal összegyűjtöttük az EDTA porszívókba, jégen tartottuk, amíg 15 percig centrifugáltuk 3000 g-on, és a plazma felülúszót -80 ° C-on tároltuk a biomarker elemzéshez. A leptin és az inzulin koncentrációját a kereskedelemben kapható patkányspecifikus ELISA (CrystalChem, IL, USA, Cat # 90040 és # 90060), valamint az interleukin (IL) 1β és IL6 alkalmazásával határoztuk meg patkányspecifikus ELISA (R&D Systems MN, USA) alkalmazásával.; RLB00, R6000B), a gyártó utasításainak megfelelően. Az IL1α, IL10, interferon (IFN) γ és tumor necrosis factor (TNF) α értékeket a BD ™ citokin gyöngytömb (BD Bioscience, Auckland, Új-Zéland), a BD Accuri C6 áramlási citométer és a BD Accuri C6 szoftver segítségével mértük. A citokinkoncentrációkat az FCAP Array Software v3 alkalmazásával számoltuk. Valamennyi kapott érték meghaladta a minimálisan kimutatható határértéket.

Femoro-tibialis ízület (FTJ) szövettana és osztályozása

A jobb oldali distalis combcsonton és a proximális sípcsonton történő transzektálást követően minden egyes femoro-tibialis ízületet (FTJ) 10 percen belül összegyűjtöttünk, és 4% paraformaldehidbe helyeztük 48 órán át szobahőmérsékleten, majd háromszor 10 percig 0,1 M foszfát-oldatban mostuk. pufferolt sóoldat (PBS). Az ízületeket (35%) hangyasav/formiát pufferolt oldatban mészkőmentesítettük 13 napon át szobahőmérsékleten, a szokásos szövettani viaszká történő feldolgozás előtt. A sagittális szakaszokat (8μm) 200 μm-enként összegyűjtöttük az egész ízületről, és poli-L-lizinnel bevont tárgylemezekre helyeztük. Mind a mediális, mind az oldalsó kondíliából származó referencia szakaszt a következő jellemzőkkel határoztuk meg: az elülső és a hátsó femorális HAC proximális kiterjedése megközelítőleg azonos szinten, az elülső és a hátsó meniszkusz szarvak nem kapcsolódtak egymáshoz, a tibialis vagy femorális keresztszalag kötődése nem látható szakasz. A vizsgálathoz a két referencia szakasz 400μm oldalirányú és 400μm mediális szakaszát választottuk ki, ami ízületenként összesen 6 szakaszt eredményezett. A metszeteket toluidinkékkel festettük, és egy Metafer4 (3.9.2 változat) futtató MetaSystems VSlide slide szkennerrel (2.1.124 verzió) 20x (NA 0.9) objektívvel képalkotottuk. A képeket a MetaSystems VS Viewer szoftver segítségével (verzió 2.0).

Az EPG morfológiai változásainak pontozására egy külön pontozási rendszert (1. táblázat) fejlesztettek ki, amelyet egy korábbi osztályozásból [20] finomítottak, és amelyeket az 1. ábra mutat be. Két diavetítést két külön alkalommal két megvakult nyomozó (SM és LY) pontozott, és az értékelők közötti egyetértés 99,3%, az értékelők közötti pedig 95,1% volt.

étrend

A 0. fokozat a hialin izületi porcot (HAC) és a tidemarkot (fekete nyíl) mutatja. Az 1. és 2. fokozat hipertrófiás sejteket tartalmazó visszatartott epiphysealis növekedési porcot (EGC) mutat, toluidinkékkel festett lyukakkal (nyílhegyek; 1. fokozat), a 2. fokozatban kék színnel festett fibrózis van jelen a visszatartott EPG és a subchondralis csont között (fekete nyíl) és üreg/ciszta a fibrotikus szövetben (*). A 3. fokozatú elváltozásokat ebben a vizsgálatban nem sikerült kimutatni.

Asztal 1

Az EGC állandó vastagsága

A HAC hossza mentén:

A kondrociták következetes, nagyjából függőleges zonális szervezése

Szorosan meghatározott vékony tidemark látható

Az ACC állandó vastagsága, amely követi az alatta lévő csont kontúrjait.

Az EGC fokálisan megvastagodott - kiterjed a subjaven epiphysisre

Megtartott EGC, amelyet a következők jellemeznek:

Szabálytalan kondrocita szerveződés

Csökkentett ECM térfogat

Tidemark részben vagy teljesen elhatárolhatatlan

A toluidinkék festék beszivárgása a kondrocita héjakba visszatartott EGC-ben.

A megtartott EGC-ben a kondrociták között kis üregek vagy üregek képződtek.

Repedés (ek) a kondro-csontos elágazásnál vagy a megtartott EGC-n belül. A repedések:

Folyamatos a megtartott EGC teljes hosszában vagy,

Rövidebb hosszúságú többszörös repedések

és/vagy,

Rostos szövetek az SCB zónában, a repedés (ek) alatt fekvő régiókban.

A hasadék (ok) a kondro-csontos csomópontban vagy a megtartott EGC-n belül folyamatosak a HAC felületig (Kato és mtsai, 1984), és így képezik:

HAC, ACC és EGC szövet fedele, amely az ízület üregébe nyúlik ki

vagy,

A fedél teljes leválasztása HAC-ból, ACC-ből és EGC-ből, laza testet alkotva.

Rostos szövet vagy cisztaszerű elváltozás (ok) az epiphysisben, vagy a fedél vagy hasadék alatt.

HAC - hyalin ízületi porc, ACC - ízületi meszesedő porc, SCB - subchondralis csont, ECM = extracelluláris mátrix

Az epiphysealis növekedési porc (EGC) fokozatai és kapcsolódó morfológiai jellemzői [20] -tól. Az egyes évfolyamok közös jellemzői szintén fel vannak sorolva. Egy adott fokozat megkövetelte az összes felsorolt ​​alapvető jellemzőt.

Minden egyes állat hat FTJ képét a 4 ízületi régióban pontoztuk: medialis femoralis condylus, lateral femoralis condylus, medialis tibialis plató, lateral tibialis plato, amelyet a pontozási rendszerben használtak. Az egy vagy több elváltozással rendelkező patkányok számát százalékban fejeztük ki. Az ízületenként mind a 6 szakaszból kiosztott fokozatot összegeztük, hogy meghatározzuk az elváltozások mértékét és súlyosságát a teljes ízületen belül. Azt is megvizsgáltuk, hogy az elváltozások gyakoribbak voltak-e a sípcsont és a combcsont mediális vagy laterális oldalán.

X típusú kollagén immunhisztokémia

Immunhisztokémiai analízist végeztünk minden csoport 1. fokozatú elváltozásain (a következő sorozatot 200 μm távolságra használva). 0. osztályú szakaszokat használtunk kontrollként. A paraffinba ágyazott szakaszokat viaszmentesítettük, herék hialuronidázában (2 mg/ml) inkubáltuk 1 órán át 37 ° C-on, desztillált vízben leöblítettük, mielőtt egér monoklonális X típusú kollagén antitesttel (1: 200; X53 klón, eBioscience Inc jelöltük volna). (USA) 2 órán át szobahőmérsékleten, majd az egér-patkányon HRP polimer csomaggal (Biocare Medical, USA) detektáltuk, a gyártó utasításainak megfelelően. A metszeteket hematoxilinnel ellenfestettük, dehidratáltuk és DPX-be helyeztük.

Statisztikai analízis

Az átlagos futótávolság mindkét gyakorolt ​​csoportban fokozatosan nőtt d100-ig, a legkisebb távolságot d70-en tették meg, amikor a patkányok a kerékhez akklimatizálódtak. A Chow-EX és a HF-EX között nem volt különbség a mért napok egyikében, vagy a teljes megtett távolságban (az öt mérési nap összesített átlagos aktivitása) az edzett csoportok között (2G és 2H ábra).

A porc morfológiája és osztályozása

Az OARSI pontozási iránymutatásai alapján a patkány FTJ esetében [21] nem észleltek rendellenességet az ízületi porc kontúrjában vagy felületi integritásában; nem volt bizonyíték a mátrix kimerítésére a HAC-ban. A 0. fokozatú ízületi szövetek egyenletes vastagságúak voltak az ízület peremén, és vékonyabbak voltak az elülső régiókban, mint a hátul. A HAC szabályos, szorosan meghatározott tidemarkot, szabályos kondrocita elrendeződést mutatott, és a meszesedett porc követte az alatta lévő csont körvonalait (3A. Ábra). Az 1. fokozatú porc megvastagodott toluidin kékkel festett régiókat tartalmazott, közvetlenül a HAC alatt. A HAC egyenletes toluidin festést és a kondrociták szabályos zónás elrendeződését mutatta, hasonlóan a 0. fokozatú porchoz. A tidemark azonban megszakadt, és csak szakaszosan volt jelen a megtartott EGC régió szélességében, ahol a kondrociták hipertrófiák voltak a toluidinkék festéssel felfújt üregekben. A chondro-osseous csomópont követte az EGC körvonalait, amelyek szabálytalanul vetültek ki az alatta lévő subchondralis csontba (3A. Ábra).

Nagyobb számú elváltozást észleltek a sípcsontban (57%) a combcsonthoz képest (43%), amelyek többsége hátul, a laterális vagy medialis meniscus hátsó szarvával szomszédságában helyezkedett el. Az elváltozások a laterális sípcsontban voltak leggyakoribbak az összes csoportban, kivéve a Chow-EX-t, amelyben a laterális femorális condylusban csak egy 1. fokú elváltozást azonosítottak.

Nem voltak bizonyítékok visszatartott növekedési porcra a metafízis növekedési lemezeken (physes) (4. ábra). Az egyes csoportok tibia fizikái egyenletes magasságot mutattak, és morfológiai jellemzőket mutattak a fiatal felnőtt patkányokban. Ez magában foglalta a szaporodó sejtek oszlopait (gyakran a nyugalmi zóna felé eső szűkítéssel), nagy területű acellularitás toluidinkékkel festett ECM-mel, 4-5 sor hipertrófiás sejt és nagyon kevés kimutatható nyugalmi sejt.

Semmilyen csoportban nem észleltek elváltozásokat vagy a visszatartott növekedési porc területeit. * az acellularitás régióit jelöli, ez a 16 hétnél idősebb patkányok fizikájának közös jellemzője.

X típusú kollagén

Annak igazolására, hogy az EGC elváltozások a hipertrófiás kondrociták retenciójának köszönhetők-e, az 1. fokozatú elváltozásokat X típusú kollagén antitesttel jelöltük, és összehasonlítottuk a 0. fokozatú szakaszokkal. Egészséges 0 fokozatú szakaszokban a kollagén X csak a hipertrófiás kondrociták utolsó 2-3 sorát körülvevő pericelluláris zónákban volt jelen, a chondro-osseous csomópont szomszédságában (5A. Ábra) és a metaphysealis növekedési lemez hipertrófiás zónájában (5B. Ábra). ). Ezzel szemben az 1. fokozatú elváltozásoknál a megtartott EGC régiók intenzív X típusú kollagént festettek az elváltozáson belüli összes sejt pericelluláris régióiban, amelyekben akár 9 réteg hipertrófiás kondrocita volt (5D. Ábra); Az 5C. Ábra negatív kontroll képet mutat (nincs primer antitest) a megfelelő szakaszból.

(A) X típusú kollagén jelölés (barna) a hyalin izületi porc régiójában, a 0. osztályba sorolt ​​szakaszban. A festés specifikusan a hipertrófiás sejtekben lokalizálódik a tidemark alatt. (B) X típusú kollagén eloszlás a metafízis növekedési lemezen. (C) Az 1. fokozatú elváltozás negatív kontroll (primer antitest nincs) szakasza. (D) X típusú kollagén eloszlás a visszatartott epiphysealis növekedési porcon belül.

Plazma biomarkerek

A plazma leptin koncentrációja éhgyomorra átlagosan az volt

4,5-szer magasabb a HF-, mint a Chow-táplált csoportokban (p 2. táblázat). Hasonlóképpen, az éhomi plazma átlagos inzulin koncentrációja jelentősen megváltozott (magasabb a HF-vel táplált, mint a Chow-táplált csoportokban, p 2. táblázat). Az átlagos IFNy-koncentrációt a diéta nem befolyásolta, de alacsonyabb volt az EX-ben, mint a SED-csoportokban, de csak a Chow- és nem HF-táplált csoportokban, erős fő- és interakciós hatásokkal (p 2. táblázat).

2. táblázat

ÜlőmozgásDiétaEdzésInterakcióChowHigh fatChowHigh fat
Leptin5,91 (0,86)27,26 (5,89)1,86 (0,37)8,61 (1,68)p 3. táblázat). Nem voltak szignifikáns különbségek a testtömegben, a sovány tömegben, az inzulinban és az összes többi plazma citokinben az elváltozásokkal és anélkül.

3. táblázat

Az asszociáció statisztikai jelentőségét Mann-Whitney U teszttel értékeltük. Nincs elváltozás (n = 18) és elváltozás (n = 22) csoport és * p (23K, xlsx)

Köszönetnyilvánítás

Köszönjük Satya Amirapunak a szövettani tanácsokat és segítséget, Claire Barkernek és Chris Hedgesnek a technikai segítséget, valamint az Orvostudományi Képalkotó Kutató Egységnek a Metasystems Vslide Scanner képzését és a hozzájuk való hozzáférést.

Finanszírozási nyilatkozat

Ezt a munkát az R238-as számú Grant támogatta, Arthritis New Zealand (ECF, SRM, MHV), www.arthritis.org.nz; Gravida Országos Növekedési és Fejlesztési Központ Masters Ösztöndíj (SSH), www.gravida.org.nz. A finanszírozóknak nem volt szerepük a tanulmányok tervezésében, adatgyűjtésben és elemzésben, a közzétételre vonatkozó döntésben vagy a kézirat elkészítésében.

Adatok elérhetősége

Minden releváns adat megtalálható a dokumentumban és a kiegészítő információkat tartalmazó fájlokban.