Az étrend szénhidrát anyagcseréjének változása a bélbaktériumok által cseppek mikrofluidikus tenyészetével

Max M. Villa

Molekuláris Genetikai és Mikrobiológiai Tanszék, Duke Egyetem, Durham, Észak-Karolina, USA

szénhidrát

b Genomikai és Számítási Biológiai Központ, Duke Egyetem, Durham, Észak-Karolina, USA

Rachael J. Bloom

b Genomikai és Számítási Biológiai Központ, Duke Egyetem, Durham, Észak-Karolina, USA

c Genetikai és Genomikai Egyetemi Program, Duke University, Durham, Észak-Karolina, USA

Justin D. Silverman

e Információs és Technológiai Főiskola, Penn State University, University Park, Pennsylvania, USA

h Orvostudományi Tanszék, Penn State University, Hershey, Pennsylvania, USA

Heather K. Durand

Molekuláris Genetikai és Mikrobiológiai Tanszék, Duke Egyetem, Durham, Észak-Karolina, USA

b Genomikai és Számítási Biológiai Központ, Duke Egyetem, Durham, Észak-Karolina, USA

Sharon Jiang

Molekuláris Genetikai és Mikrobiológiai Tanszék, Duke Egyetem, Durham, Észak-Karolina, USA

b Genomikai és Számítási Biológiai Központ, Duke Egyetem, Durham, Észak-Karolina, USA

Anchi Wu

f Orvostechnikai Tanszék, Duke Egyetem, Durham, Észak-Karolina, USA

Eric P. Dallow

molekuláris genetikai és mikrobiológiai tanszék, Duke University, Durham, Észak-Karolina, USA

b Genomikai és Számítási Biológiai Központ, Duke Egyetem, Durham, Észak-Karolina, USA

Shuqiang Huang

g Shenzhen Szintetikus Biológiai Intézet, Shenzhen Institute of Advanced Technology, Kínai Tudományos Akadémia, Shenzhen, Kínai Népköztársaság

Lingchong Te

b Genomikai és Számítási Biológiai Központ, Duke Egyetem, Durham, Észak-Karolina, USA

f Orvostechnikai Tanszék, Duke Egyetem, Durham, Észak-Karolina, USA

Lawrence A. David

molekuláris genetikai és mikrobiológiai tanszék, Duke University, Durham, Észak-Karolina, USA

b Genomikai és Számítási Biológiai Központ, Duke Egyetem, Durham, Észak-Karolina, USA

c Genetikai és Genomikai Egyetemi Program, Duke University, Durham, Észak-Karolina, USA

d Számítástechnikai és bioinformatikai program, Duke University, Durham, Észak-Karolina, USA

f Orvostechnikai Tanszék, Duke Egyetem, Durham, Észak-Karolina, USA

Társított adatok

A baktériumok mozgékonysága olajos vizes cseppekben. A képalkotás fokozása és a fókuszsíkban lévő cseppek ellapítása érdekében a vizes cseppeket elválasztó olajrétegnek hagyták részben elpárologni. Ez a párolgás ahhoz vezet, hogy a cseppek hatszögletűvé válnak. Letöltés Video S1, AVI fájl, 10,1 MB.

Az antibiotikumokkal történő növekedés eredményei cseppekben (A) és 96 lyukú lemezeken (B) négy bél izolátum (Bacteroides spp. 1, Bacteroides spp. 2, Bacteroides thetaiotaomicron és Enterobacter cloacae) felhasználásával, mGAM-ban és hat különböző antibiotikum-kombinációban ( amoxicillin [100 μg/ml] [amox], amoxicillin és klavulanát [100 μg/ml] [amoxclav], ampicillin [100 μg/ml] [amp], gentamicin [10 μg/ml] [gent], kanamicin [50 μg/ml] [kan] és ciprofloxacin [5 μg/ml] [cipro]). A növekedést qPCR és szekvenálás (cseppek) és OD600 (96 lyukú lemezek) segítségével mértük 24 óra elteltével. (C) A MicDrop assay vevő működési jellemzőinek (ROC) görbéje különböző növekedési küszöbérték-határértékeket eredményez, a B. panelen látható adatok felhasználásával. A megduplázódás legalább 2,14 × [Δln (SV DNS-szám) ≥ 1,48] növekedési határértéke maximalizálta az igaz-pozitív arányt, miközben minimalizálta a hamis-pozitív arányt (Youden-féle J; a görbén csillaggal jelölt maximális érték), és ezt alkalmazták. az A panelen ábrázolt hőtérkép megrajzolásához. Töltse le az S2 ÁBRA TIF fájlt, 2,1 MB.

A MicDrop kísérletben kimutatott összes SV-t emberi székletminta alkalmazásával. A módosított Gompertz növekedési görbéket idősorokhoz illesztjük. Az SV-ket a taxonómia színezi, és a teljes növekedés (görbe aszimptóta magasság, görög delta nagybetűvel [Δ] jelzi) szerint rendezi, amelyet az egyes részterületeken jelölnek. A könnyebb megtekintés érdekében a görbéket függőlegesen eltolják úgy, hogy az y metszéspontok az origónál legyenek. Töltse le az FIG S3 TIF fájlt, 1,7 MB.

Az azonos fagyasztott törzsből származó tenyészoltások összehasonlítása. (A) A sejteket egy éjszakán át újjáélesztettük fagyasztott széklettrágyákból gazdag táptalajban (mGAM), hogy a sejtek fagyásból helyreállhassanak. A felesleges tápanyagokat ezután kimerítettük, baktériumokat tenyésztve egy éjszakán át minimális táptalajban, amely egyedüli szénforrásként glükózt és galaktózt tartalmaz. A betöltési koncentráció meghatározása után a baktériumokat a kapszulázás előtt mossuk és hígítjuk. (B) Az oltóanyag összetételének reprodukálhatósága azonos fagyasztott állományforrásokból történő újraélesztést követően. Töltse le az S4 FIG, TIF fájlt, 0,9 MB.

(A) Annak vizsgálata, hogy mely prebiotikus kombinációkat figyelték meg véletlenül egyre kevésbé. A diagram alján található plusz- és mínuszjelek jelzik az adott kombinációnál megfigyelt taxonok számát, amelyek statisztikailag egyre nagyobb valószínűséggel fordulnak elő határértéknél (P Ez a tartalom a Creative Commons Attribution 4.0 International licenc feltételei szerint kerül terjesztésre.

16S rRNS szekvenálás minta metaadatai és olvasási mélység. Töltse le az S1 táblát, XLSX fájlt, 0,02 MB.

A görbe illesztésének érzékenysége a paraméterhatárokhoz. Az x-tengely adatai az egyes illeszkedési paramétereket ábrázolják, az Anyagok és módszerek részben leírt határokkal. Az y tengely adatai az illesztési paramétereket tükrözik alternatív paraméterhatárokkal. Minden pont a különálló SV illesztési paramétereit képviseli. Töltse le az S6 FIG, TIF fájlt, 1,9 MB.

A prebiotikus vizsgálathoz használt tápközeg összetételének és szénforrásainak táblázata. Töltse le az S2 táblát, XLSX fájlt, 0,01 MB.

A tanulmányban használt baktérium törzsek listája. Letöltés S3 táblázat, XLSX fájl, 0,01 MB.

Az ebben a vizsgálatban generált 16S rRNS nukleotid szekvenciákat az Európai Nukleotid Archívumban tették hozzáférhetővé a PRJEB33065 csatlakozási szám alatt.

ABSZTRAKT

FONTOSSÁG A baktériumtenyészet és a vizsgálat az alapvető mikrobiológiai kutatások, a gyógyszerfejlesztés és a diagnosztikai szűrés összetevői. A közösségi sokszínűség azonban kihívást jelenthet az egyes mikrobiota-tagok bevonásával végzett kísérletek átfogó elvégzése. Itt bemutatunk egy új mikrofluidikus tenyésztési platformot, amely lehetővé teszi a mikrobiota alkotórészek növekedésének és működésének egyetlen kísérletsorozatban történő mérését. A koncepció bizonyítékaként bemutatjuk, hogy a platform hogyan használható annak mérésére, hogy a különböző emberekből származó bélbaktériumok százai hogyan metabolizálják az étrendi szénhidrátokat. A továbbiakban azt várjuk, hogy ez a mikrofluidikás technika alkalmazható lesz számos egyéb mikrobiológiai vizsgálati igényhez.

BEVEZETÉS

A kultúrán alapuló vizsgálatok fontos funkcionális különbségeket tárhatnak fel az egyének bélmikrobiális közösségei között. Ilyen különbségek gyakran nem derülnek ki a 16S rRNS szekvenálási vizsgálatokból, amelyek nem oldják meg a baktériumok taxonómiáját a fajszint alatt (1). A kultúrán alapuló vizsgálatok képesek megoldani a törzsszintű funkcionális variációkat, amelyek ösztönözhetik az egyének közötti eltéréseket a mikrobiómával összefüggő egészségügyi és betegségkimenetelekben. Például szelektív növekedési vizsgálatokat régóta alkalmaznak a kommenzális bél mikrobiális taxonjainak patogén törzseit hordozó egyének azonosítására (2). Gátlási vizsgálatokat alkalmaztak a baktériumfajokon belüli törzsváltozások feltárására is, amelyek meghatározzák, hogy az egyének mikrobiota képes-e ellenállni a kórokozóknak (3), és a szén-felhasználási szűrők azt mutatták, hogy ugyanazon baktériumfaj törzsei különböző emberektől elkülönülve képesek metabolizmusuk képességében különbözni diétás szénhidrátok (4, –6).

Itt kifejlesztettünk egy platformot a baktériumok elkülönítésére, tenyésztésére és tesztelésére az emberi bél mikrobiotájából cseppekben (MicDrop), hozzáférhető technikák és berendezések segítségével. A módszer egyik fő kihívása az izolátumok növekedésének mérése különálló mikrofluidikus cseppekben. Ennek megvalósításához a 16S rRNS génekre, mint belső DNS vonalkódokra támaszkodunk, amelyek ugyanazon baktérium taxonokat hordozó cseppek között oszlanak meg. Ez a megközelítés viszont lehetővé teszi számunkra, hogy a taxonok növekedését cseppekben mérjük anélkül, hogy kettős emulziós technikákat vagy cseppek válogatását kellene alkalmaznunk. Ehelyett egyesítjük az egyszeres emulziós (víz az olajban) mikrofluid cseppprotokollokat molekuláris technikákkal (kvantitatív PCR [qPCR] és 16S rRNS génszekvenálás). Ezek az egyszerűsített protokollok lehetővé teszik számunkra a polc nélküli mikrofluid szivattyúk és chipek alkalmazását, amelyek elég kompaktak ahhoz, hogy elférjenek tipikus anaerob kamrákban.

Hogy bemutassuk a MicDrop hasznosságát az emberi mikrobiota minták közötti funkcionális különbségek mérésére az egyes baktériumok taxonjainak szintjén, a bél mikrobiológiai kutatásainak egyik kiemelkedő kérdésének kezelésére alkalmaztuk a platformot: különböznek-e az egyének a bélbaktérium fajok számától, amelyek képesek lebontani a komplexet diétás szénhidrátok? A MicDrop segítségével az étrendi poliszacharid metabolizmusát jellemeztük kilenc különböző ember bélbaktériumainak százai között. Megállapítottuk, hogy minden egyén olyan mikrobákkal rendelkezik, amelyek képesek lebontani a vizsgált szénhidrátokat, mégis a szénhidrátot lebontó baktériumok szintje eltér az egyének között. A bélbaktériumok taxonjai tágan kategorizálhatók az alapján is, hogy egyetlen vagy több poliszacharidon nőttek-e. Ezek az adatok együttesen racionális megközelítéseket javasolnak a prebiotikus tervezéshez, és bemutatják a mikrofluidikus cseppvizsgálatok lehetőségét az egyes baktériumtörzsek növekedési ütemének és funkcióinak összehasonlítására a komplex mikrobiális közösségek között.

EREDMÉNYEK

MicDrop: platform az emberi bél mikrobiota cseppekben történő tenyésztésére.

S1. Ábra