Az étrendi emulgeálószerek által kiváltott alacsony fokú gyulladás elősegíti a vastagbél karcinogenezisét

Keresse meg ezt a szerzőt a Google Tudósban
Keresse meg ezt a szerzőt a PubMed oldalon
Keresse meg ezt a szerzőt ezen a webhelyen
Levelezés céljából: [email protected]

Absztrakt

Bevezetés

A vastagbélrák a leggyakoribb emberi rosszindulatú daganatok közé tartozik (1), és szorosan kapcsolódik a krónikus bélgyulladáshoz, ami a „vastagbélgyulladással összefüggő rák” kifejezést eredményezi (2, 3). A vastagbélgyulladással összefüggő rák kialakulása gyulladásos bélbetegségben (IBD) szenvedő betegeknél az egyik legjobban jellemzett példa a bélgyulladás és a karcinogenezis közötti összefüggésre (4–7). A fekélyes vastagbélgyulladásban szenvedő betegek körében kiderült, hogy a vastagbélrák kockázata a kezdeti diagnózis után 10% -nál 2%, 20 évesen 8% és 30% után 18% (4). Ezzel szemben a sporadikus kolorektális rák életciklusának kockázata az Egyesült Államokban csak 5% (8).

Míg a bélgyulladás klasszikusan hisztopatológiailag meghatározott, elsősorban az immunsejt-infiltrátumok jelenlétével, ma már felismerték, hogy a gyulladás sokkal gyakoribb formája az „alacsony fokú bélgyulladás”, amelyet a proinflammatorikus citokinek fokozott szisztémás expressziója határoz meg. az immunsejt-infiltrátumok klasszikus aggregátumainak hiánya. A gazdaszervezet és a mikrobiota kapcsolatának változásai összefüggésbe hozhatók és elősegíthetik az alacsony fokú bélgyulladást (19). Sőt, egyre inkább felismerték, hogy az alacsony fokú krónikus gyulladás a bélben elősegítheti az olyan anyagcserezavarokat, mint a II-es típusú cukorbetegség, az érelmeszesedés és az elhízás, amely maga is a vastagbélrák fokozott előfordulásával jár együtt (20, 21).

Az emulgeálószerek olyan detergensszerű molekulák, amelyeket beépítenek a legtöbb feldolgozott élelmiszerbe a textúra és a stabilitás javítása érdekében, és nemrégiben bebizonyítottuk, hogy az emulgeálószerek megzavarták a nyálka – baktérium kölcsönhatásokat, és bélgyulladást váltottak ki (22). Ebben a közelmúltbeli tanulmányban két általánosan használt emulgeálószer, nevezetesen a karboxi-metil-cellulóz (CMC) és a poliszorbát-80 (P80) hatását vizsgáltuk a gazda belében. A CMC-t korábban leírták, hogy elősegítse a vékonybél túlnövekedését és gyulladását genetikailag fogékony egerekben (23), és a P80 képes in vitro fokozni a baktériumok transzlokációját az epitheliában (24, 25).

Ez a két emulgeálószer emészthetetlen, és főleg a széklettel ürül (26–29), és nemrégiben azt tapasztaltuk, hogy mind a CMC, mind a P80 elősegítette a mikrobiota behatolását és a proinflammatorikus flagellin és lipopoliszacharid (LPS) megnövekedett szintjét, amely korrelált a mikrobiota összetételének változásával és bélgyulladás. Az ilyen változások elősegítették a vastagbélgyulladást az ilyen rendellenességre genetikailag hajlamos egerekben, és alacsony fokú gyulladást és metabolikus szindrómát indukáltak a WT egerekben. Fontos, hogy ezek a hatások a mikrobiota jelenlététől függtek (csíra nélküli egereknél nem volt megfigyelhető fenotípus), és az emulgeálószerrel kezelt egerekből csíra mentes egerekbe ültetett székletmikrobiota transzferálta a bélgyulladás és a metabolikus szindróma egyes jellemzőit (22).

A jelenlegi tanulmányban feltételeztük, hogy az emulgeálószerek részt vehetnek a vastagbélrák kialakulásában az alacsony fokú bélgyulladás és a bél mikrobiota megváltoztatásának elősegítésével. Ennek a hipotézisnek a teszteléséhez a colitishez társuló rák jól bevált egérmodelljét használtuk az AOM karcinogén felhasználásával, majd két ciklust folytattunk dextrán-szulfát-nátriummal (DSS) két gyakran használt emulgeálószer, a CMC és a P80 krónikus expozíciójának kitett egereken. Itt közöljük, hogy az étrendi emulgeáló szerek a vastagbélben proinflammatorikus környezetet hoztak létre és tartottak fenn, ami a proliferáció/apoptózis egyensúly megváltozásával járt, ami súlyosbította a karcinogenezist. Ezek a változások a mikrobiota összetételének és sokféleségének változásaihoz kapcsolódtak és azoktól függtek, amelyek kedvező rést hoztak létre a tumorigeneisishez. Ezek a megállapítások alátámasztják azt az elképzelést, hogy a bél homeosztázisának megváltozását eredményező perzisztált gazda – mikrobiota kölcsönhatás elősegítheti a vastagbél karcinogenezisét.

Anyagok és metódusok

Anyagok

A nátrium-karboxi-metil-cellulózt (CMC, átlagos MW ~ 250 000, szubsztitúciós fok = 0,7) és a poliszorbát-80-at (P80) a Sigma-tól vásároltuk.

Négy hetes hím C57BL/6 WT egereket használtunk ebben a vizsgálatban. Az összes egeret a Georgia State University-n (Atlanta, GA) tenyésztették és elhelyezték intézményesen jóváhagyott protokollok (IACUC # A14033) alapján. Az egereket specifikus kórokozóktól mentes körülmények között helyeztük el, és ad libitum-mal etettük rendszeres chow-étrenddel. Ábrákon használt állatok. Az 1–6. Ábrát és az S1 – S10 kiegészítő ábrát Helicobacter pozitív helyiségben, a 7. ábrán és az S11 kiegészítő ábrán használt állatokat pedig Helicobacter negatív helyiségben helyeztük el.

Az étrendi emulgeálószerek mikrobiota-függő módon változtatják meg a hámsejtek szaporodását és az apoptózist. A hagyományos és csíramentes Swiss-Webster WT egereket CMC vagy P80 (1,0%) tartalmú ivóvíznek tettük ki 13 héten keresztül. CMC-t vagy P80-t (1,0%) tartalmazó ivóvíznek kitett hagyományos Swiss-Webster WT egerek bélmikrobiotáját 13 héten át csíranövénymentes Swiss-Webster WT egerekbe ültettük át. A ciklin D1 elemzése (A és G), ciklin D2 (B és H), Ki67 (C és én), BCL2 (D és J), BAD (E és K) és a VEGFA mRNS expressziója (F és L) qRT-PCR segítségével a vastagbélben csíramentes körülmények között végzett emulgeálószer-kezelést követően (A – F) és a mikrobiota-transzplantációt követően (G – L).

Emulgeálószer kezelés

Az egereket CMC-nek vagy P80-nak tettük ki ivóvízzel hígítva (1,0%). Ugyanezt a vizet (fordított ozmózissal kezelt atlantai városi víz) használtuk a vízzel kezelt (kontroll) csoportnál. Ezeket a megoldásokat minden héten megváltoztatták. A testtömeg-növekedésre gyakorolt emulgeáló hatás tanulmányozása érdekében a testtömegeket hetente mértük és a kezdeti testtömeg százalékában fejeztük ki (a 0. napon 100% -ot határoztak meg). Minden héten friss ürüléket gyűjtöttek a későbbi elemzés céljából.

A vastagbélgyulladással összefüggő rákmodell

Az S11. Kiegészítő ábrán vázlatosan az emulgeálószerrel kezelt állatokat hetente PBS-ben hígított AOM-mal (10 mg/testtömeg-kg) is kezeltük. A kísérlet végén az egereket 15 órán át éheztettük, elvégeztük a kolonoszkópiás eljárást (Karl Storz Endoskope), az egereket eutanizáltuk, és a szerveket összegyűjtöttük a korábban leírtak szerint.

Csíra nélküli kísérletek

Csíramentes svájci Webster egereket csíramentes körülmények között, csíramentes létesítményünkben, a Park Bioservices izolátorban tartottunk. A CMC-t és a P80-ot vízzel 1% -ra hígítottuk, majd csíramentes célból autoklávban tartottuk. Ugyanezt a vizet használtuk a vízzel kezelt (kontroll) csoportnál. A hagyományos, életkornak megfelelő és nem szerinti svájci Webster egereket párhuzamosan alkalmaztuk. 3 hónapos emulgeálószer-kezelés után terminális elemzéseket végeztünk.

Mikrobiota transzplantáció

A svájci Webster mosószerrel kezelt egerek szivacstartalmát 30% -os PBS-ben (1,0 ml) hígított glicerinben szuszpendáltuk és -80 ° C-on tároltuk az elemzésig. Csíra nélküli svájci Webster egereket (4 hetesek) eltávolítottunk az izolátorból, és szájon át 200 μl glicerin tartalmú széklet-szuszpenziót adtunk hozzájuk. A transzplantált egereket 3 hónapig figyeltük a terminális elemzés előtt.

A vastagbél mieloperoxidáz vizsgálata, a széklet Lcn-2, valamint a szérum CXCL-1 és IL6 mennyiségi meghatározása ELISA-val

Részletekért lásd a Kiegészítő módszerek részt.

A széklet flagellinje és az LPS terhelésének meghatározása

Kvantifikáltuk a flagellint és az LPS-t a korábban leírtak szerint (31), humán embrionális vese (HEK) -Kék-mTLR5 és HEK-BluemTLR4 sejteket (Invivogen) használva. A székletanyagot PBS-ben 100 mg/ml végkoncentrációra szuszpendáltuk, és Mini-Beadbeater-24 alkalmazásával homogenizáltuk gyöngyök hozzáadása nélkül, hogy elkerüljük a baktériumok károsodását. A felülúszókat sorozatosan hígítottuk, és az emlős sejtekre vittük fel. A standard görbe meghatározásához tisztított E. coli flagellint és LPS-t (Sigma) használtunk. 24 órás stimuláció után sejtkultúra-felülúszót vittünk fel a QUANTI-Blue táptalajra (Invivogen), és 30 perc után 620 nm-en mértük az alkalikus foszfatáz aktivitást.

RNS extrakció, valós idejű RT-PCR és baktériumok kvantifikálása qPCR segítségével

Részletekért lásd a Kiegészítő módszerek részt és az S1 Kiegészítő táblázatot.

A széklet mikrobiota elemzése 16S rRNS gén szekvenálással Illumina technológiával és metagenóma predikcióval

A 16S rRNS gén szekvenálását a korábban leírtak szerint hajtottuk végre (22), az adatokat az Európai Nukleotid Archívumban tároltuk PRJEB8035 azonosítószám alatt. További részletekért lásd: Kiegészítő módszerek.

Ki67 immunhisztokémia

A tumor nélküli egér proximális vastagbélt 10% pufferolt formalinban 24 órán át szobahőmérsékleten rögzítettük, majd paraffinba ágyazottuk. A szöveteket 5 μm vastagságban metszettük és paraffinoztuk. A metszeteket nátrium-citrát pufferben inkubáltuk, és nyomástartó edényben 10 percig főztük az antigén visszakereséséhez. A metszeteket ezután 5% -os kecskeszérummal blokkoltuk TBS-ben, majd egy órán át inkubáltuk anti-Ki67-gyel (1: 100, Vector Laboratories) 37 ° C-on. A TBS-sel végzett mosás után a metszeteket biotinilezett szekunder antitestekkel kezeltük 30 percig 37 ° C-on, és a színfejlődést a Vectastain ABC kit (Vector Laboratories) segítségével hajtottuk végre. Ezután a metszeteket hematoxilinnel ellenfestettük, dehidratáltuk és lefedtük. A kri67-pozitív sejteket kriptánként számoltuk.

Terminális dezoxinukleotidil-transzferáz-dezoxiuridin-trifoszfát nick-end jelöléses vizsgálat

A vastagbél hámsejtjeiben lévő apoptotikus sejtek számának meghatározásához a tumor nélküli egér proximális vastagbélt 10% pufferelt formalinban 24 órán át szobahőmérsékleten rögzítettük, paraffinba ágyazva, 5 μm vastagságban metszettük, deparaffinizáltuk és apoptotikus sejtekre festettük. a gyártó utasításainak megfelelően, az In situ sejthalál-detektáló készlet használatával (Roche Diagnostics). A DAPI magfestéssel átfedő terminális dezoxinukleotidil-transzferáz-dezoxiuridin-trifoszfát nick-end jelöléssel (TUNEL) rendelkező pozitív sejteket kriptánként számoltuk.

Statisztikai analízis

Az adatokat átlag ± SEM formában mutatjuk be. A szignifikanciát t tesztek segítségével határoztuk meg, minden kezelési csoportot összehasonlítva a kontroll csoporttal. Bonferroni utóvizsgálattal többszörös összehasonlítással korrigált kétirányú ANOVA csoportot alkalmaztunk a testtömeg időbeli mérésére és az alfa változatosság elemzésére (GraphPad Prism szoftver, 6.01 verzió). * és # statisztikailag szignifikáns különbségeket jelöl.

Eredmények

Az étrendi emulgeálószerek metabolikus szindrómával járó alacsony fokú bélgyulladást váltanak ki

Több egéralmot az elválasztáskor egyformán három csoportra osztottak, amelyek vizet, CMC-t vagy P80-ot kaptak ivóvízben (1,0% w/v vagy v/v) 13 héten keresztül, amint arról korábban beszámoltunk (S1. Kiegészítő ábra; ref. 22.) Korábbi munkánkkal összhangban az emulgeálószer-fogyasztás a krónikus alacsony fokú bélgyulladás jellemzőit eredményezte, beleértve a rövidített vastagbelet és a splenomegalia-t (S2. Kiegészítő ábra). A széklet lipocalin-2-t (Lcn2), amely az egerek bélgyulladásának érzékeny és széles dinamikájú markere (32), használták a bélgyulladás számszerűsítésére, és kimutatták, hogy az emulgeálószerrel kezelt egereknél a széklet Lcn2 szintje megemelkedett 9 hét diéta után. emulgeálószer-fogyasztás (63. nap; Kiegészítő ábra S2A – S2C), megerősítve az alacsony fokú gyulladás kiváltását. A várakozásoknak megfelelően mind a CMC, mind a P80 a testtömeg mérsékelt, de statisztikailag szignifikáns növekedését váltotta ki (S2D kiegészítő ábra). Az emulgeálószer-kezelés az éhomi vércukor-koncentrációval értékelve (a kiegészítő S2E. Ábra) is rontotta a glikémiás kontrollt, és fokozott ételfogyasztással társult (S2F. Kiegészítő ábra), megerősítve korábbi megfigyelésünket, miszerint az emulgeálószerek alacsony fokú bélgyulladást váltanak ki és rontják a glükóz anyagcseréjét (22).

Az emulgeálószer-fogyasztás súlyosbítja a karcinogenezist egy colitishez társuló rákos modellben

Az étrendi emulgeáló szerek megváltoztatják a bél mikrobiota összetételét, ami proinflammatorikus bélkörnyezethez vezet

A diétás emulgeálószerek megzavarják a hámsejtek proliferációs/apoptózis egyensúlyát

Az étrendi emulgeálószerek mikrobiota-függő módon változtatják meg a hámsejtek szaporodását és az apoptózist

Annak további vizsgálatához, hogy az emulgeálószer-fogyasztás hogyan befolyásolta a proliferációt/apoptózist, ezt követően qRT-PCR-rel elemeztük a proliferációt (ciklin D1, D2, Ki67), az apoptózist (BCL2 és BAD) és az angiogenezist (VEGFA) szabályozó gének expressziós szintjét. Amint a 7. ábrán látható, azt tapasztaltuk, hogy az étrendi emulgeálószer-fogyasztás után a ciklin D1, a ciklin D2 és a Ki67-et kódoló gének expressziója jelentősen deregulált (7A – C. Ábra), míg a β-catenin útvonala változatlan (Kiegészítő S10 ábra). Az AOM/DSS-sel kezelt csoportokban e gének expressziós szintjét tovább szabályozták, anélkül, hogy bármilyen különbséget észleltek volna a vízzel és az emulgeálószerrel kezelt csoportok között (az adatokat nem közöltük). Az anti- és proapoptotikusan kódoló Bcl2 és Bad gének (7D. És E ábra) és az angiogenezis VEGFA markere (7F. Ábra) változatlanok maradtak az emulgeálószer fogyasztása alatt.