Az étrendi lipidek hatása a kínai ujjatlan rák hepatopancreas transzkripciójára (Eriocheir sinensis)

Egyformán járult hozzá ehhez a munkához: Banghong Wei, Zhigang Yang

Szerepek konceptualizálás, adatkezelés, formális elemzés, vizsgálat, módszertan, szoftver, írás - eredeti vázlat, írás - áttekintés és szerkesztés

Tagsági Halászati és Élettudományi Főiskola, Sanghaji Óceán Egyetem, Sanghaj, Kína

Egyformán járult hozzá ehhez a munkához: Banghong Wei, Zhigang Yang

Szerepek konceptualizálás, finanszírozás megszerzése, módszertan, írás - eredeti vázlat, írás - áttekintés és szerkesztés

A Halászati és Élettudományi Főiskola, Sanghaji Óceán Egyetem, Sanghaj, Kína

Szerepek Módszertan, írás - eredeti vázlat, írás - áttekintés és szerkesztés

Tagsági Halászati és Élettudományi Főiskola, Sanghaji Óceán Egyetem, Sanghaj, Kína

Szerepek Finanszírozás megszerzése

Tagsági Halászati és Élettudományi Főiskola, Sanghaji Óceán Egyetem, Sanghaj, Kína

Szerepek módszertan, szoftver

Tagsági Halászati és Élettudományi Főiskola, Sanghaji Óceán Egyetem, Sanghaj, Kína

Szerepek konceptualizálás, projekt adminisztráció, erőforrások, felügyelet

Tagsági Halászati és Élettudományi Főiskola, Sanghaji Óceán Egyetem, Sanghaj, Kína

Banghong Wei,
Zhigang Yang,
Jianyi Wang,
Aqin Chen,
Qiuyan Shi,
Yongxu Cheng

Ábrák

Absztrakt

Idézet: Wei B, Yang Z, Wang J, Chen A, Shi Q, Cheng Y (2017) Az étrendi lipidek hatása a kínai ujjatlan rák (Eriocheir sinensis) hepatopancreas transzkripciójára. PLoS ONE 12 (7): e0182087. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0182087

Szerkesztő: Linsheng Song, Kínai Tudományos Akadémia Ókológiai Intézete, KÍNA

Fogadott: 2017. március 31 .; Elfogadott: 2017. július 12 .; Közzétett: 2017. július 28

Adatok elérhetősége: Minden releváns adat megtalálható a dokumentumban és a kiegészítő információkat tartalmazó fájlokban.

Finanszírozás: Ezt a tanulmányt a Kínai Nemzeti Természettudományi Alapítvány támogatta [31472287 (ZGY), 31402272 (AQC) támogatás száma].

Versenyző érdeklődési körök: A szerzők kijelentették, hogy nincsenek versengő érdekek.

Bevezetés

A kínai ujjatlan rák (Eriocheir sinensis) Kelet-Ázsiában őshonos faj, és Kínában a legfontosabb gazdasági rákfajokká vált [14]. A legtöbb rákfélék maximális növekedését az étrend összes lipidjének (száraz tömeg) 2–10% -a indukálhatja [15]. A legtöbb rákféle rövidebb láncú és telített zsírsavakat részesíti előnyben az energiáért [16]; azonban a többszörösen telítetlen zsírsavak (PUFA-k) szintén fontos szerepet játszanak számos rákféle fiziológiai funkcióban, például az arachidonsav (ARA, 20: 4n-6), az EPA és a DHA szorosan kapcsolódik a rothadáshoz [17], és javíthatják a növekedést és immunitás a Litopenaeus vannamei korai növekedési szakaszában [9]. Korábban az E. sinensis lipid-táplálkozását vizsgáltuk. Eredményeink többsége azt sugallta, hogy a FO helyettesítése az E. sinensis étrendjében megvalósítható, ahol a növényi olaj részben helyettesítheti az FO-t anélkül, hogy befolyásolná a növekedést, de a zsírsav-összetétel jelentősen megváltozhat [18–20]. Az FO szubsztitúciójának fokozása érdekében meg kell vizsgálni az FO szubsztitúciójának hatásmechanizmusát.

A következő generációs szekvenálási technika, az RNS-szekvenálás (RNS-Seq) egy újonnan kifejlesztett technológia, amelyet biológiai vizsgálatok molekuláris mechanizmusainak tanulmányozására használnak [21], és sikeresen alkalmazták E. sinensis tanulmányozására. A legtöbb tanulmány azonban az E. sinensis fejlődésére, a moltingra, az immunutakra, a táplálkozás és a szaporodás összefüggéseire, az ozmoregulációra és a szemfeszes ablációhoz való alkalmazkodásra összpontosított [22–27]. Kevés kutató vizsgálta az étrendi lipidkészletek E. sinensisre gyakorolt hatását. Ebben a tanulmányban két növényi olajat választottak ki, amelyek főleg ω-3 és ω-6 zsírsavakat tartalmaznak, mint halolaj helyettesítőit az E. sinensis étrendjében. A pótlás arányát a korábbi eredményeink alapján határoztuk meg. A halolaj pótlásának mechanizmusának szemléltetésére két csoportot adtunk a halolaj teljes cseréjével a csere hatásának növelése érdekében. Ezután elemeztük a különböző diétákkal táplált E. sinensis hepatopancreas transzkripcióját, és meghatároztuk a különféle étrendi lipidek hatását az E. sinensis lipidanyagcseréjére.

Anyagok és metódusok

Kísérleti diéták

Öt izonitrogén, izolipid tisztított étrendet állítottak össze három lipidforrásból: FO, szójaolaj (SO) és lenmagolaj (LO). Az 1. táblázat felsorolja a kísérleti étrend összetevőit. Az étrendeket 1,5 mm átmérőjű pelletekké formáltuk, és felhasználásig -20 ° C-on tároltuk.

Kísérleti állatok és etetési kísérletek

Fiatalkori kínai ujjatlan rákokat a Sanghaji Óceán Egyetem Chongming kutatóbázisából szereztek be, és 1 hétig tartályokban rakták őket az akklimatizáció érdekében. Ebben az időszakban a rákokat FO diétával etették. 1 hét elteltével 60 egészséges hím rákot (kezdeti súly: 2,15 ± 0,10 g) véletlenszerűen öt csoportba soroltunk (n = 12). Az egyes csoportok mindegyik rákját egyetlen műanyag dobozban (36 cm × 18 cm × 18 cm) tenyésztették. A csoportokat véletlenszerűen egy kísérleti étrendhez rendeltük, és naponta egyszer, 13:00 órakor etettük 116 napig. Az el nem fogyasztott takarmányt 2 óra múlva szifoncsővel eltávolítottuk. A kísérlet során a vizet naponta egyszer kicserélték a tartály térfogatának 1/3–1/2 részével, és az egész etetési idő alatt levegőztették. A fotoperiódus körülbelül 12 órás világos volt: 12 órás sötét. A vízminőségi paramétereket hetente 2-3 alkalommal ellenőriztük 24,5–30,0 ° C-os, pH 8,0 ± 0,4, oldott oxigén> 5 mg/l és összes ammónia-nitrogén 1,0 fenntartása érdekében; RNS> 5 μg) használtuk a transzkriptóm elemzéshez.

Az RNS-Seq transzkriptóm könyvtárat egy Truseq RNS Sample Prep Kit (Illumina) segítségével készítettük. A PolyA mRNS-t poli-T oligóval kapcsolt mágneses gyöngyökkel (Invitrogen) tisztítottuk, és fragmentációs puffer segítségével véletlenszerűen 200 bp-os töredékekre osztottuk. Ezután az első szál komplementer DNS-t (cDNS) szintetizáltuk reverz transzkriptáz és random primerek felhasználásával, majd a második szálú cDNS szintézisét. A második szálú cDNS-t a végén helyreállítottuk az End Repair Mix (Illumina) alkalmazásával, és egyetlen A bázist adtunk a 3'-véghez az adapter ligálásához. A cDNS-célfragmenseket 2% -os alacsony tartományú ultra-agarózon (Bio-Red) szelektáltuk, majd 15 ciklus PCR-amplifikációt követtünk. A TBS-380 (Invitrogen) kvantifikáció után híd PCR-t hajtottunk végre, hogy a DNS-fragmenseket egymolekulájú DNS-klaszterekké amplifikáljuk, amelyeket később HiSeq 4000 (Illumina) szekvenálásban alkalmaztunk.

De novo összeszerelés és kommentárok

A SeqPrep (https://github.com/jstjohn/SeqPrep) és a Sarló (https://github.com/najoshi/sickle) minőségi vágása és adapternyírása után tiszta adatokat kaptunk az RNA de novo összeállításához a Trinity-vel (http: //trinityrnaseq.sourceforge.net/, Verzió: trinityrnaseq-r20140413) [28]. Annotálás céljából az összeállított átiratokat a BlastX (2.2.25 verzió) felhasználásával, az E-cut-cut cut-off segítségével az NCBI fehérje nem redundáns (Nr), a STRING, a Swiss-Prot és a Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) adatbázisaihoz igazították. érték −5. A Gene Ontology (GO) funkcionális besorolást végeztük a Blast2GO (http://www.blast2go.com/b2ghome) alkalmazásával a biológiai folyamatok, a molekuláris funkciók és a sejtkomponensek leírásához szükséges GO annotációk megszerzéséhez [29]. A KEGG-t (http://www.genome.jp/kegg/) használták az átírások érintett útvonalainak elemzésére.

Differenciális génexpresszió és funkcionális dúsítás

Az expressziós bőséget RSEM (http://deweylab.biostat.wisc.edu/rsem/) alkalmazásával határoztuk meg [30]. Az olvasási számlálást úgy kaptuk, hogy az egyes mintákat a megfelelő génhez képeztük. A génexpressziós szinteket az exon modell kilobázisára eső fragmentek millió feltérképezett leolvasás (FPKM) módszer szerint mértük. A differenciál expresszió elemzését edgeR (http://www.bioconductor.org/packages/2.12/bioc/html/edgeR.html) segítségével végeztük. A hamis felfedezési arány -AΔCt) képletnél a géneket szignifikánsan differenciáltan expresszáltuk (DEG). A ΔCt képletet kaptuk: ΔCt = Ct érdekes gén - Ct belső kontroll, majd a maximális ΔCt-t ΔCtmax-nak választottuk, ΔΔCt-t a következő képlettel számítottuk ki: ΔΔCt = ΔCt − ΔCtmax. Ezután az egyes gének relatív expresszióit 2 -ΔΔCt-vel határoztuk meg, az összehasonlító küszöbciklus (2 -ΔΔCt) képletének megfogalmazásával kapcsolatban további információkat Schmittgenre [31] utaltunk. A log-transzformáció után az egyes csoportok FPKM-értékét RNS-szekvenciában összehasonlítottuk a qRT-PCR eredményeivel az RNS-Seq validálásához.

Eredmények

Szekvenálás és de novo összeszerelés

A szekvenálás, a minőségi vágás és az adapter nyírása után összesen 320 973 688 leolvasást kaptunk az E. sinensis FO, SO, LO, FSO (FO + SO) vagy FLO (FO + LO) diétával táplált hepatopancreasából (3. táblázat) és de novo összeszereléshez használják. Összeállítás után 70 591 átiratot kaptunk, és az átiratokat további 55 167 unigénbe csoportosítottuk. Az átlagos transzkriptum és unigén hossza 946 bp, illetve 1083 bp volt. A 4. táblázat mutatja az összeállítás egyéb statisztikáit. Körülbelül 22 760 átirat (32,24%) és 20 929 unigén (37,94%) 1–400 bp hosszú volt, ami az átiratok és az unigének többségének felel meg.

Az unigének feljegyzése

Az összeállított unigéneket a BlastX segítségével összehangoltuk az Nr, STRING, Swiss-Prot és KEGG adatbázisokkal. Az összerakott unigének közül 25 920 (46,98%), 17 499 (31,72%) és 14 532 (26,34%) illesztett össze az Nr, a Swiss-Prot és a KEGG adatbázisokban; csak 5820-nak (10,55%) egyezett a STRING adatbázisban. Az Nr adatbázisban 13 305 unigént párosítottak 0-10 értékkel .

A DEG elemzése

qRT-PCR validálás az RNS-Seq

Az RNS-Seq eredmények igazolásához 10 véletlenszerűen kiválasztott gént analizáltunk ugyanazon hepatopancreas RNS mintákban qRT-PCR-rel. Az RNS-Seq és qRT-PCR eredményeket összehasonlítjuk a 7. ábrán, és megerősítettük az RNS-Seq megbízhatóságát.

Vita

A korábbi években a transzkriptóm elemzést széles körben alkalmazták a biológiai vizsgálatok során. A rákféléknél a hepatopancreas a lipidek tárolásának és anyagcseréjének egyik fő szerve, amelynek funkciói megegyeznek a gerincesek zsírszövetével és májával [32, 33]. A hepatopancreas egyes hormonok bioszintéziséért is felelős; ezért ideális szerv a különböző lipidforrású diétákkal történő táplálkozást követő transzkriptómaváltozások tanulmányozásához [34]. Ebben a tanulmányban elemeztük a különféle étrendi lipidforrások hatásait az E. sinensis hepatopancreas transzkriptómra. Az étrendi lipidforrások nyilvánvaló hatással voltak az E. sinensis lipidek emésztésére, felszívódására és anyagcseréjére.

A zsírsavak de novo szintézisét az étrendi lipid is jelentősen megváltoztatta. A zsírsavszintézis két lépést foglal magában: az elsőt az ACC és a FAS katalizálja, majd az ACC és a FAS által szintetizált zsírsavakat tovább megnyújtják és deszaturálják hosszú láncú telítetlen zsírsavakká [49]. A reakció a malonil-CoA acetil-CoA-ból történő szintézisével kezdődik, amelyet ACC katalizál. Ezután az FAS által katalizált szekvenciális Claisen kondenzációs reakciók acetil-CoA és malonil-CoA-val történnek [50]. Beszámoltak arról, hogy a FAS és az ACC expressziója a CaCo-2 sejtekben szoros kapcsolatban állhat a zsírsavakkal [51]. Ebben a tanulmányban, összehasonlítva az FO csoporttal, a FAS az SO, az LO és az FLO csoportokban, az ACC pedig az FLO csoportban csökkent. A legnagyobb különbség az FO, SO, LO és FLO étrend között a zsírsavösszetétel. A növényi olajjal összehasonlítva azonban az FO jelentősen elősegítheti a FAS expresszióját. feltételeztük, hogy ennek oka az FO szubsztrátjának számító FO étrend magas 14: 0 tartalma volt.

De a jelen tanulmányban a zsír-acil-Δ9-deszaturáz expressziója jelentősen megváltozott az SO, LO és FLO csoportokban. A zsírsav-acil-A9-deszaturáz a sebességet korlátozó enzim az egyszeresen telítetlen zsírsav-bioszintézisben, és kettős kötést vezethet be a palmitoil-CoA-ban (16: 0) és a sztearoil-CoA-ban (18: 0) [64]. Guo és munkatársai elsőként izolálták a zsírsav-α9-deszaturázt az E. sinensis-ből [55], és a BL21 (DE3) pLysS-ben jellemezték, az E. sinensis-ben található zsír-acil-A9-deszaturáz aktivitást mutatott a C18 deszaturációjában.: 0 [65]. Mivel a növényi olaj magas 18: 1n-9 tartalma, a zsírsav-Δ9-deszaturáz expressziója FO-ban szignifikánsan alacsonyabb volt, mint a növényi olajé. Feltételezzük, hogy a növényi olaj 18: 1n-9 magas tartalma annak a reakciónak a terméke, amelyben a zsír-acil-Δ9-deszaturáz részt vesz, és ezáltal gátolja a zsír-acil-Δ9-deszaturáz expresszióját az E. sinensis-ben.

Következtetések

Az étrendi lipidforrásoknak a kínai kesztyűrákra gyakorolt hatásait transzkriptómanalízissel elemeztük, amely azt mutatta, hogy az étrendi lipideknek nyilvánvaló hatása volt a rákok hepatopancreasában a lipid anyagcserére. Az FO cseréje növényi olajokkal jelentősen megváltoztatta a zsír emésztését és felszívódását, a zsírsavak anyagcseréjét, a zsírsavak lebomlását, a zsírsavak bioszintézisét, a telítetlen zsírsavak bioszintézisét és számos más lipid anyagcsere utat. Az FO-val összehasonlítva az egyre növekvő SO és LO hozzáadása a rákok étrendjében csökkentheti az étrendi lipidek emésztését és felszívódását, a zsírsavak bioszintézisét és a vírus immunológiai védekezését, és növelheti a β-oxidációt azáltal, hogy megváltoztatja a gének PL-expresszióját., ACSL-ek, CPTI, ACC, FAS, zsír-acil-9-deszaturáz, TLR-ek, STAT és más releváns gének. Az étrendi lipidek kínai kesztyűrákra gyakorolt hatásának részletei azonban még mindig nem tisztázottak; a jövőbeli vizsgálatoknak az E. sinensis genomiális szekvenciáját kell használniuk a transzkriptóm javítására. Ezenkívül a jelen tanulmány transzkripciós szinten történt; A fehérje expressziót szintén elemezni kell, hogy jobban megértsük a különféle lipid diétákkal táplált kínai kesztyű rákok lipidanyagcseréjét.