Az időszakos MTII alkalmazás ismételt étvágytalanságot és robusztus zsír- és fogyást vált ki

Yi Zhang

1 Kutatási részleg, Malcom Randall Veterans Affairs Medical Center, NF/SG HCS, Gainesville, Florida

alkalmazás

2 Farmakológiai Tanszék, Floridai Egyetem, Gainesville, Florida

Renata Collazo

1 Kutatási részleg, Malcom Randall Veterans Affairs Medical Center, NF/SG HCS, Gainesville, Florida

2 Farmakológiai Tanszék, Floridai Egyetem, Gainesville, Florida

Yongxin Gao

1 Kutatási részleg, Malcom Randall Veterans Affairs Medical Center, NF/SG HCS, Gainesville, Florida

2 Farmakológiai Tanszék, Floridai Egyetem, Gainesville, Florida

Gang Li

1 Kutatási részleg, Malcom Randall Veterans Affairs Medical Center, NF/SG HCS, Gainesville, Florida

2 Farmakológiai Tanszék, Floridai Egyetem, Gainesville, Florida

Philip J Scarpace

2 Farmakológiai Tanszék, Floridai Egyetem, Gainesville, Florida

Absztrakt

1. Bemutatkozás

2. Anyagok és módszerek

2.1 Reagensek

Az MTII-t a Phoenix Pharmaceuticals, Inc.-től (Burlingame, CA 94010) szereztük be, és felhasználás előtt feloldottuk a mesterséges agyi gerincvelői folyadékban (ACSF) 80 mM végkoncentrációig.

2.2 Állatok

Három hónapos hím F344 × barna norvég patkányokat Harlan Sprague-Dawley-től (Indianapolis, IN) vásároltunk. Megérkezés után a patkányokat megvizsgálták, és egy hétig karanténban maradtak. Az állatokat a kísérleti állatok gondozására és felhasználására vonatkozó útmutató elveinek megfelelően gondoztuk. A patkányokat külön-külön, 12:12 órás fény: sötét ciklusban (07:00 és 19:00 óra között) helyezték el, és szabadon hozzáférhettek a vízhez és a szokásos chow étrendhez.

2.3 Központi MTII infúzió

A patkányokat xilazinnal (8 mg/kg, s.c.) altattuk. és 5 perccel később 90 mg/kg ketamin, i.p. amíg az érzéstelenítés stabil műtéti síkját el nem érik. A fájdalomcsillapítót, a buprenorfint (0,05 mg/kg) injekcióval injektálták. a műtét előtt és ismét 6-12 órával a műtét után. Az MTII-t (1 nmol/patkány/nap) vagy az ACSF-t egy agyi infúziós kanülön keresztül vezettük be sztereotaxikusan az oldalsó kamrába (1,3 mm-rel a bregma mögött, 1,9 mm-re a midsaggitalis varrathoz képest és 3,5 mm-es mélységig), 0,5 sebességgel. ul/óra A kanült egy katéteren keresztül szubkután ozmotikus mini szivattyúhoz csatlakoztatták. Minden állat ACSF-t kapott a műtéti helyreállítási szakasz első 10 napjában a kanül beültetése után. Ezt követően a patkányokat először MTII-vel vagy hordozóval infundálták 14 napig (1. szivattyú). Ezután az MTII-vel infundált patkányok felében lévő pumpákat kicseréltük hordozót tartalmazóakra (MTII-On/Off), míg a maradékokat 10 napon át friss MTII-t (MTII-On) tartalmazó pumpákkal (2. szivattyú). Végül mindkét csoportban a szivattyúkat újabb 6 napig friss MTII-t tartalmazó csövekkel helyettesítették (3. szivattyú). A fenti séma a kísérlet részleteit ábrázolja.

2.4. A szövetek betakarítása és előkészítése

A patkányokat méhnyak diszlokációval leölték 85 mg/kg pentobarbitális érzéstelenítő alatt. A vérmintákat szívszúrással vettük össze, és a szérumot 10 perces centrifugálással szérumszeparátor csövekben gyűjtöttük össze. A keringési rendszert 20 ml hideg sóoldattal perfundáltuk, és a barna zsírszövetet (BAT), a perirenalis és a retroperitoneális fehér zsírszöveteket (PWAT és RTWAT) és a hipotalamust kivágtuk. A hipotalamust úgy távolítottuk el, hogy a piriformes lebenyeket medialisan, az optikai chiasmnál caudalisan és az agyi crusszió elülső részén 2-3 mm mélységig metszettük [22]. A hipotalamit rövid ideig ultrahanggal kezeltük 0,3 ml 10 mM Tris-HCl-ben (pH 6,8), 2% SDS-ben és 0,08 μg/ml okadainsavban proteázinhibitorok, 1 mM PMSF, 0,1 mM benzamidin és 2 μM leupeptin jelenlétében. 100 ul homogenátum alikvot részét eltávolítottuk és lefagyasztottuk RNS izolálás céljából. A maradék homogenátumot azonnal felforraljuk és -80 ° C-on fagyasztva tároljuk a Western analízishez. A fehérjekoncentrációkat a DC protein assay kit (Bio-Rad, Hercules, CA) alkalmazásával határoztuk meg. A BAT és WAT mintákat 0,45 mikronos fecskendőszűrőn (Whatman, Clifton, NJ) átszűrtük a lipid részecskék eltávolítása érdekében a fehérje mérése előtt.

2.5 Western elemzés

Az 1-es protein (UCP1) szétkapcsolását BAT homogenátumokban anti-humán UCP1 antitesttel mértük (Linco Research, St. Charles, MO) [15]. A foszforilezett acetil-CoA karboxiláz 1 (P-ACC1) és az összes ACC1 PWAT-ban történő meghatározásához a fehérje homogenizátumot (20-50 μg) a P-ACC-re specifikus monoklonális antitesttel (Upstate Cell Signaling Solutions, Lake Placid) értékeltük., NY) vagy Streptavidin-HRP-konjugált antitest (1: 10 000 hígítással), amely specifikus a biotinnal társított teljes ACC1-re (PIERCE Biotechnology, Rockford, IL), és fokozott kemilumineszcens detektálással (ECL-plus, Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, New Jersey).

2.6 RT-PCR

2.7 Statisztikai elemzés