Az oxidatív stressz szerepe a hipoxiának és endotoxinnak kitett újszülött patkányok akut vesekárosodásában

A.N. Belozersky Fizikai-Kémiai Biológiai Intézet, M.V. Lomonoszov Moszkvai Állami Egyetem, Oroszország

V. I. Kulakov Szülészeti, Nőgyógyászati ​​és Perinatológiai Kutatóközpont, Orosz Föderáció Egészségügyi Minisztériuma, Moszkva, Oroszország

Levelezés

E. Y. Plotnikov vagy D. B. Zorov, Lab. A mitokondrium szerkezete és funkciói, A.N. Belozersky Intézet, Lomonoszov Moszkvai Állami Egyetem, Moszkva 119992, Oroszország

Fax: +7 495 939 3180

Tel .: +7 495 939 5944

A.N. Belozersky Fizikai-Kémiai Biológiai Intézet, M.V. Lomonoszov Moszkvai Állami Egyetem, Oroszország

Orosz Kardiológiai Kutató és Termelő Központ, Moszkva, Oroszország

A.N. Belozersky Fizikai-Kémiai Biológiai Intézet, M.V. Lomonoszov Moszkvai Állami Egyetem, Oroszország

V. I. Kulakov Szülészeti, Nőgyógyászati ​​és Perinatológiai Kutatóközpont, Orosz Föderáció Egészségügyi Minisztériuma, Moszkva, Oroszország

A.N. Belozersky Fizikai-Kémiai Biológiai Intézet, M.V. Lomonoszov Moszkvai Állami Egyetem, Oroszország

V. I. Kulakov Szülészeti, Nőgyógyászati ​​és Perinatológiai Kutatóközpont, Orosz Föderáció Egészségügyi Minisztériuma, Moszkva, Oroszország

Nemzetközi Lézerközpont, M.V. Lomonoszov Moszkvai Állami Egyetem, Oroszország

A.N. Belozersky Fizikai-Kémiai Biológiai Intézet, M.V. Lomonoszov Moszkvai Állami Egyetem, Oroszország

A.N. Belozersky Fizikai-Kémiai Biológiai Intézet, M.V. Lomonoszov Moszkvai Állami Egyetem, Oroszország

V. I. Kulakov Szülészeti, Nőgyógyászati ​​és Perinatológiai Kutatóközpont, Orosz Föderáció Egészségügyi Minisztériuma, Moszkva, Oroszország

V. I. Kulakov Szülészeti, Nőgyógyászati ​​és Perinatológiai Kutatóközpont, Orosz Föderáció Egészségügyi Minisztériuma, Moszkva, Oroszország

A.N. Belozersky Fizikai-Kémiai Biológiai Intézet, M.V. Lomonoszov Moszkvai Állami Egyetem, Oroszország

V. I. Kulakov Szülészeti, Nőgyógyászati ​​és Perinatológiai Kutatóközpont, Orosz Föderáció Egészségügyi Minisztériuma, Moszkva, Oroszország

Levelezés

E. Y. Plotnikov vagy D. B. Zorov, Lab. A mitokondrium szerkezete és funkciói, A.N. Belozersky Intézet, Lomonoszov Moszkvai Állami Egyetem, Moszkva 119992, Oroszország

Fax: +7 495 939 3180

Tel .: +7 495 939 5944

A.N. Belozersky Fizikai-Kémiai Biológiai Intézet, M.V. Lomonoszov Moszkvai Állami Egyetem, Oroszország

V. I. Kulakov Szülészeti, Nőgyógyászati ​​és Perinatológiai Kutatóközpont, Orosz Föderáció Egészségügyi Minisztériuma, Moszkva, Oroszország

Levelezés

E. Y. Plotnikov vagy D. B. Zorov, Lab. A mitokondrium szerkezete és funkciói, A.N. Belozersky Intézet, Lomonoszov Moszkvai Állami Egyetem, Moszkva 119992, Oroszország

Fax: +7 495 939 3180

Tel .: +7 495 939 5944

A.N. Belozersky Fizikai-Kémiai Biológiai Intézet, M.V. Lomonoszov Moszkvai Állami Egyetem, Oroszország

Orosz Kardiológiai Kutató és Termelő Központ, Moszkva, Oroszország

A.N. Belozersky Fizikai-Kémiai Biológiai Intézet, M.V. Lomonoszov Moszkvai Állami Egyetem, Oroszország

V. I. Kulakov Szülészeti, Nőgyógyászati ​​és Perinatológiai Kutatóközpont, Orosz Föderáció Egészségügyi Minisztériuma, Moszkva, Oroszország

A.N. Belozersky Fizikai-Kémiai Biológiai Intézet, M.V. Lomonoszov Moszkvai Állami Egyetem, Oroszország

V. I. Kulakov Szülészeti, Nőgyógyászati ​​és Perinatológiai Kutatóközpont, Orosz Föderáció Egészségügyi Minisztériuma, Moszkva, Oroszország

Nemzetközi Lézerközpont, M.V. Lomonoszov Moszkvai Állami Egyetem, Oroszország

A.N. Belozersky Fizikai-Kémiai Biológiai Intézet, M.V. Lomonoszov Moszkvai Állami Egyetem, Oroszország

A.N. Belozersky Fizikai-Kémiai Biológiai Intézet, M.V. Lomonoszov Moszkvai Állami Egyetem, Oroszország

V. I. Kulakov Szülészeti, Nőgyógyászati ​​és Perinatológiai Kutatóközpont, Orosz Föderáció Egészségügyi Minisztériuma, Moszkva, Oroszország

V. I. Kulakov Szülészeti, Nőgyógyászati ​​és Perinatológiai Kutatóközpont, Orosz Föderáció Egészségügyi Minisztériuma, Moszkva, Oroszország

A.N. Belozersky Fizikai-Kémiai Biológiai Intézet, M.V. Lomonoszov Moszkvai Állami Egyetem, Oroszország

V. I. Kulakov Szülészeti, Nőgyógyászati ​​és Perinatológiai Kutatóközpont, Orosz Föderáció Egészségügyi Minisztériuma, Moszkva, Oroszország

Levelezés

E. Y. Plotnikov vagy D. B. Zorov, Lab. A mitokondrium szerkezete és funkciói, A.N. Belozersky Intézet, Lomonoszov Moszkvai Állami Egyetem, Moszkva 119992, Oroszország

Fax: +7 495 939 3180

Tel .: +7 495 939 5944

Absztrakt

Rövidítések

Bevezetés

Az újszülött csecsemők nagyon érzékenyek a vese ischaemiára, és tartós és tartós akut tubuláris vagy kortikális nekrózis alakul ki további parenchymás ödéma és a nekrotikus tubulus hámsejtek csőszerű lumenbe történő elnyúló hatásával [9]. Lehetséges, hogy mindez annak köszönhető, hogy az újszülött vese éretlen a születéskor, és a funkcionális érés folytatódik a posztnatális időszakban [10]. .

Az ischaemia által kiváltott vesekárosodás ezen kóros mechanizmusai univerzálisak, azonban eltérőek lehetnek, ha összehasonlítjuk a hipoxia felnőtt és újszülött patkányok veséjére gyakorolt ​​hatását. Ez utóbbiakról kiderült, hogy reverzibilis sejtkárosodást szenvednek, míg felnőtt patkányokban a vesetubulusok hámja tartósan elveszíti a reabsorpciós funkciót [11]. .

Az újszülöttek normális és patológiás állapotában kialakuló vese működésének sajátosságai különböző követelményeket határoznak meg a károsodás markereivel szemben [12, 13]. Például az élet első napjaiban bekövetkezik a veseműködés kialakulása, és a fiziológiás oliguria elhomályosíthatja az AKI-t. A veseelégtelenség klasszikus markerei a kreatinin és a karbamid csak a sérülés késői markereivé válnak, amelyek nagymértékben függenek az étrendtől, a vázizom funkcióitól és a vese működésének stabilitásától [13]. Az újszülöttek megnövekedett szérum kreatininszintjének megfigyeléséhez a funkcionális nephronok körülbelül 75% -ának elvesztése szükséges (felnőtteknél - 50%), és emelkedése csak 24–48 óra múlva figyelhető meg. Ennek megfelelően az AKI új markerei: a neutrofil zselatinázzal társult lipokalin (NGAL) és a vesekárosodás-molekula-1 (KIM-1) a klinikákon elkezdődött, és alkalmazásuk a neonatológiában ésszerűnek tűnik, ha indokolt [14]. .

Az új markerek vizeletben történő növekedésének specifitása, érzékenysége és időzítése nélkülözhetetlenné teszi őket a klinikai gyakorlatban: az NGAL alkalmazása fokozatosan beépül a rutin diagnosztikai eljárásba kontrasztos nephropathia alatt, de használatuk az újszülöttekben még mindig kísérleti jellegű, és további vizsgálatokra van szükség.

Ebben a tanulmányban felmértük az újszülött patkányok újszülött AKI modellként történő felhasználásának lehetőségét, amelyet az endotoxin [(lipopoliszacharid (LPS)] által okozott hipoxia és szisztémás gyulladás indukál. A cél az volt, hogy betekintést nyerjünk a vesekárosodás mechanizmusaiba kísérleti nephropathiában. oxidatív stressz-relevanciával és antioxidánsok alkalmazásával a nephroprotection érdekében.

Eredmények

Akut vesekárosodás újszülötteknél hipoxia és LPS kezelés után

Az LPS injekció és a patkányok teljes oxigénhiánya akut vesekárosodáshoz vezetett. Huszonnégy órával az LPS beadása után a vér karbamid-nitrogénjének (BUN) jelentős növekedését figyelték meg, míg a hipoxia alatt a BUN szintje nem változott (1A. Ábra). Míg ezzel a mutatóval a veseelégtelenséget csak az LPS-nek való kitettség után figyelték meg, a vizeletben kimutatott egyéb karbamid AKI markerek, az NGAL és a KIM-1 kimutatták a vesekárosodás jelenlétét mindkét csoportban (1B, C ábra). Huszonnégy órával a hipoxia után a vizeletben a KIM-1 növekedése kicsi volt, de statisztikailag szignifikánsP ≤ 0,05), míg az LPS bevezetése után az NGAL és a KIM-1 szintje sokszorosára nőtt (P

szerepe

A veseszövet hisztopatológiai változásai hipoxia és LPS kezelés után

A szövettani vizsgálat feltárta mind a hipoxia, mind az LPS injekció által kiváltott változásokat a vese morfológiájában (2A, B ábra). A vesében a hipoxia és az LPS után 24 órával megfigyelt változások súlyos tubuláris dilatációt jeleznek, amelyet a tubuláris lumen területének növekedéseként (2C. Ábra) és a tubulusok megnövekedett átlagos területének a medullában mérnek (2D ábra). Ezenkívül az LPS és a Hypoxia csoportokban a glomerulusok által elfoglalt terület jelentősen csökkent (2E. Ábra), ami a glomeruláris szklerózis kialakulására utalhat. 72 órával az LPS vagy a hipoxia expozíciója után a kóros változások már kisebb mértékben megnyilvánultak (3. ábra). Jelentős különbségeket csak a medulla tubulusainak területén észleltünk (3D ábra) és csak az LPS-sel kezelt csoportban.

Az LPS kezelés oxidatív stresszt indukál az újszülött vesében

Mivel kiderült, hogy az újszülött patkányok veséjére a legkárosítóbb hatást az LPS indukálta, további kísérleteket hajtottunk végre ezzel a modellel. Megfigyeltük, hogy a reaktív oxigénfajok (ROS) termelése, amelyet DCF fluoreszcencia detektál a kéreg vitális szakaszaiban, szignifikánsan magasabb volt az LPS-nek kitett kölykök veséjében, összehasonlítva a kontrollokkal (4A, B ábra), amely az oxidatív stressz kialakulását bizonyítja.

N‐Acetil-cisztein (NAC) megmenti a vesét az LPS káros hatásaitól

Vita

Ebben a vizsgálatban újszülött patkányokat használtak az újszülött AKI modelljében, amelyet különböző tényezők váltottak ki, amelyek a klinikai gyakorlatban leggyakrabban előfordulnak, nevezetesen a teljes hipoxia (a magzati hipoxia és az újszülöttkori asphyxia analógjaként) és az LPS bevezetése, szimulálva az újszülöttek szepszisét . Nyilvánvaló, hogy az állatokon, és különösen a patkányokon kapott bármely kísérleti adat emberre fordításának alapja a csecsemő ember és patkány veséjének nephrogenesisének és fiziológiájának összehasonlítása, ami végső soron befolyásolja a károsodás és a helyreállítás mechanizmusait. a vese.

A peri- és újszülött patológiák, például a placenta megszakadása, az intrapartum hypoxia, az asphyxia, a szepszis, a véráramlás centralizációjához és végső soron a szervek, például a vese ischaemia/reperfúziós károsodásához vezethetnek. Széles körben elfogadott, hogy a reperfúziós sérülés oxidatív stresszel társul, amelyet elsősorban a mitokondriális diszfunkció okoz [20, 21]. Sőt, a mitokondriális rendszer hasonló károsodása, valamint az ROS és más szabad gyökök hiperprodukciója figyelhető meg a vesében más patológiák, például toxikus myoglobinuria vagy pyelonephritis esetén [22]. Feltételezhetjük, hogy ez a kóros mechanizmus univerzális és jól bevált felnőtt állatok veséjében, de hasonló jelenségeket írtak le patkánykölykök vesekárosodására, például hiperoxiás vesekárosodás esetén, ami fibrózishoz vezet [23] és intrauterin asphyxia okozó AKI [24]. Ha azonban összehasonlítjuk a hipoxia felnőtt és újszülött patkányok veséjére gyakorolt ​​hatását, az utóbbi reverzibilis sejtkárosodást mutatott, míg felnőtt patkányokban a vesetubulusok hámja következetesen elveszíti a visszaszívódási funkciót [11]. .

Az LPS által okozott újszülött vesekárosodás mechanizmusainak további vizsgálata feltárta az oxidatív stressz fő szerepét ebben a folyamatban. Az LPS 3 órás intraperitoneális beadása után megnövekedett ROS termelést detektáltunk a patkányok vese tubulusaiban. Ez azt jelzi, hogy az oxidatív stressz okozhatja a vesekárosodást, míg a vesekárosodás markereit ebben az időszakban még nem lehet kimutatni a vizeletben (az adatokat nem mutatjuk be). Ezek az adatok jól egyeznek az ismert tényekkel az oxidatív vesekárosodás szerepéről a szepszisben és a SIRS-ben felnőtt állatokban [27, 28]. Az oxidatív stressz elsődleges szerepe alapján megkíséreltük az LPS által kiváltott nephropathiát antioxidáns NAC-tal gyógyítani. A NAC a klasszikus antioxidánsok egyike, amelyet a kísérleti vizsgálatok során használnak, és nephroprotektív hatásait számos olyan oxidatív robbanással járó modellben bizonyították, mint például a vese ischaemia [29], rabdomyolysis [30] és gentamicin által kiváltott nephropathia [31] .

Anyagok és metódusok

Állatkísérletek

A munkában kinyújtott fehér patkányokat használtak állattartó létesítményben, 12 órás fényciklussal, állandó hőmérsékleten (22 ± 2 ° C). A kísérleteket a laboratóriumi állatok elhelyezésére és gondozására vonatkozó etikai előírásoknak és ajánlásoknak megfelelően hajtották végre, amelyekre az állatok kísérleti vizsgálatokhoz történő felhasználásáról szóló 2010/63/EU európai közösség tanácsi irányelvek vonatkoznak. Az alomban lévő kölykök száma 9–12 volt. A kísérleteket mindkét nem 7 napos, 9–14 g tömegű kölykein végezték.

Hypoxiás és szeptikus károsodás modellezése

Az azonos alomból származó patkánykölyköket véletlenszerűen három csoportba osztották: Kontroll, ép állatok; Hypoxia, hypoxiás patkányok; LPS, patkányok, akik LPS injekciót kaptak. Minden csoportban összesen 12 állat volt (különböző almokból). A Hypoxia csoportban a patkányokat 2 órán át szisztémás hypoxiának vetettük alá multigazos NewBrunswick inkubátorban, 8% oxigént és 92% nitrogént tartalmazó atmoszférában, 37 ° C hőmérsékleten. Az LPS-csoportba tartozó állatokat intraperitoneálisan injektáltuk Escherichia coli 0127: B8 törzs (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 4 mg · kg –1 dózisban. Az expozíció után az állatokat visszavitték anyjukhoz, és 24 és 72 óra múlva vér- és vizelet- és vesemintákat vettek Western-blot-vizsgálatra és szövettani vizsgálatra.

Western blottolás

A vesekárosodás, a KIM ‐ 1 és az NGAL markereinek elemzéséhez a kezelés után 24 és 72 órával a kölykökből gyűjtött vizeletet használtuk. A mintavételhez a vizeletet négyszeresére hígítottuk 10% 2-merkaptoetanolt tartalmazó mintapufferben. A mintákat 5 percig forraljuk, és 20 μl mintát helyezünk a gél lyukába.

A sejtproliferáció markerét, a PCNA-t detektálták egy vese homogenizátumában. Az állatot eutanizálták, majd a veséket eltávolították és gyorsan lehűtötték PBS-ben. A veséket töredékekre zúztuk, majd 0,5 ml PBS-ben homogenizáltuk, amely 1 mmol/1 -1 proteáz inhibitor PMSF-t tartalmazott. A kapott homogenizátumot 1500 ° C-on centrifugáltuk g 3 percig a felülúszót összekevertük 4% mintapufferrel, amely 10% 2-merkaptoetanolt tartalmaz, és 5 percig forraljuk. A felülúszó alikvot részét használtuk a teljes fehérje koncentrációjának meghatározására egy bicinchonininsavon alapuló kereskedelmi készlet segítségével (Sigma-Aldrich). A gél minden egyes lyukja azonos mennyiségű fehérjét tartalmazott.

A fehérje elektroforézist poliakrilamid gélen, denaturáló körülmények között, Laemmli végezte. Az elválasztott fehérjéket félszáraz blottolással polivinilidén-difluorid membránra (Amersham Pharmacia Biotech, Rainham, Egyesült Királyság) vittük át. A membránokat 1 órán át 25 ° C-on PBS-ben 5% zsírmentes száraz tejjel és 0,05% Tween-20-tal blokkoltuk, NGAL, KIM-1 (Abcam, Cambridge, Egyesült Királyság) és PCNA (Abcam) elleni primer antitestekkel inkubálva. 1: 1000 hígítás PBS/BSA/Tween-20-ban, majd torma-peroxidázzal konjugált másodlagos antitestekkel, 1: 10000 hígítással PBS/Tween-20-ban. A sávokat kemilumineszcens szubsztrát segítségével detektáltuk a torma peroxidázzal fokozott kemilumineszcencia rendszerhez (ECL; Amersham Pharmacia Biotech). A kemilumineszcenciát ChemiDoc instrument MP Imaging System-rel (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) detektáltuk, a kapott képeket a 6.0 image lab szoftver (Bio-Rad) segítségével elemeztük.

Vese szövettana

A vese az állat feláldozása után azonnal izolálásra került, jéghideg foszfáttal pufferolt sóoldattal mossuk, 10% -os pufferolt formalinban rögzítjük, paraffinba ágyazzuk és szövettani vizsgálathoz használjuk. Öt mikrométer vastag metszeteket vágunk, paraffinizálunk, hidratálunk, és hematoxilinnal és eozinnal festjük. A vese metszeteket vak módon vizsgáltuk Axiovert invertált mikroszkóppal (Carl Zeiss Inc., Jena, Németország). Minden vese tárgylemezén legalább 10 mezőt vizsgáltunk, és kóros súlyosságuk alapján pontoztunk. A morfometrikus elemzést imagej szoftver segítségével végeztük (NIH, Bethesda, MD, USA).

Konfokális mikroszkópia

A kísérleteket 20 ° C-on végeztük. A vese szeleteket Vibroslice rezgő mikrotómával (WPI, Sarasota, FL, USA) kaptuk, DMEM-ben mostuk és 10 μm DCF-DA-vel inkubáltuk 10 percig. A maradék DCF kimosása után a szeleteket LSM510 invertált konfokális mikroszkóppal (Carl Zeiss Inc.) készítettük. A fluorokróm beépülésének elemzését üvegfenekű edényekben végeztük gerjesztéssel 488 nm-nél és emissziót gyűjtöttünk 500–530 nm-en. A fotoindukált mitokondrium/sejt károsodásának a relatív fluoreszcencia intenzitáshoz való hozzájárulása minimalizálása érdekében a képelemzést csak az első négy vizsgálat átlagán végezték el. A képeket imageJ szoftver (NIH) segítségével dolgozták fel.

Statisztika

Minden adatot átlag ± SEM-ként adunk meg. A csoportok közötti összehasonlításokat Student's segítségével végeztük t teszttel és Mann – Whitney teszttel a P érték

Köszönetnyilvánítás

Ezt a munkát az RFBR 17-04-01045 támogatása támogatta.

Összeférhetetlenség

A szerzők kijelentik, hogy nincsenek összeférhetetlenségük.

Szerzői hozzájárulások

Az EYP kísérleteket tervezett, konfokális mikroszkópos kísérleteket végzett, elemezte az adatokat és szerkesztette a papírt; A TAP és a DNS állatkísérleteket végzett és elemezte a szövettani adatokat; Az IBP és az LDZ Western blot-ot végzett; A VNM szövettani vizsgálatot végzett; A GTS és a DBZ meghatározta a vizsgálat koncepcióját, felügyelte a kísérleteket, elemezte az irodalmat és megírta a kéziratot.