Az ózonterápia gyengíti az NF-κB által közvetített helyi gyulladásos választ és a Th17 sejtek aktiválódását a pikkelysömör kezelésében.

Jinrong Zeng 1 *, Li Lei 1 *, Qinghai Zeng 1, Yuying Yao 2, Yuqing Wu 2, Qinxuan Li 2, Lihua Gao 1, Hongjiao Du 1, Yajie Xie 1, Jinhua Huang 1, Wenbin Tan 3,4, Jianyun Lu 1

1. Bőrgyógyászati Osztály, Harmadik Hsziangya Kórház, Közép-Déli Egyetem, Changsha, Hunan, Kína;
2. XiangYa Orvostudományi Kar, Közép-Déli Egyetem, Changsha, Hunan, Kína;
3. Orvostudományi Kar Sejtbiológiai és Anatómiai Tanszéke és
4. Orvostechnikai Tanszék, Műszaki és Számítástechnikai Főiskola, University of South Carolina, Columbia, South Carolina
* Ezek a szerzők egyformán járultak hozzá ehhez a munkához.

Idézet:
Zeng J, Lei L, Zeng Q, Yao Y, Wu Y, Li Q, Gao L, Du H, Xie Y, Huang J, Tan W, Lu J. Az ózonterápia gyengíti az NF-κB által közvetített helyi gyulladásos reakciót és a Th17 sejtek a pikkelysmr kezelsben. Int J Biol Sci 2020; 16 (11): 1833-1845. doi: 10,7150/ijbs.41940. Elérhető a https://www.ijbs.com/v16p1833.htm oldalon

Kulcsszavak: ózonterápia, NF-κB, TLR2, Th17, pikkelysömör

Az ózont erősen oxidáló tulajdonsága miatt először klinikailag sterilizáló szerként alkalmazták. Széles körben alkalmazták több mint 50 különböző kóros állapot kezelésére, ideértve a fertőző bőrbetegségeket [15-18], az allergiás betegségeket [19, 20], az erythema pikkelyes betegségeket [21, 22], a sebgyógyulást és a fekély helyreállítását [23]. . Az ózon hatásmechanizmusai megalapozhatják az antimikrobiális hatásokat, az immunszabályozást, az antioxidáns védekezést, az epigenetikai módosítást, a bioszintézist, a fájdalomcsillapítókat és az értágulatokat [24]. A bőrgyógyászat jelenlegi ózon gyógyászati készítményei a következő első osztályozásokba sorolhatók: ózon hidroterápia, helyi ozonált olaj, ózon autohemoterápia (OAHT) és ózon gáz üreg/akupunkt injekció [24]. A legújabb vizsgálatok kimutatták, hogy az ózonkoncentrációk pontos szabályozása különböző citokinek, például IFN-γ, IL-6 és TNF-α termelését indukálhatja [25]. Az ózon indukálhatja és aktiválhatja a szervezet antioxidáns enzimrendszerét, hogy szabad gyököket eltávolító szereket állítson elő, eltávolítsa a gyulladásos reakciók által generált szabad gyökök egy részét, és zavarja a gyulladásos faktorok termelését a betegség kialakulása során [26]. Az ózonterápia pontos mechanizmusait azonban a betegségek kezelésében tovább kell tisztázni.

Ebben a tanulmányban egy rövid távú ózonkezelés terápiás hatékonyságát értékeltük pikkelysömörben szenvedő betegeknél. Megvizsgáltuk a helyi ózonterápia lehetséges mechanizmusait a pikkelysömörhöz az imikimod- (IMQ) indukálta pikkelysömör-szerű egér modell alkalmazásával. Megállapítottuk, hogy az ózonterápia gyengítette a gyulladásos reakciókat a pikkelysömörben az NF-κB útvonal gátlásával. Eredményeink azt mutatják, hogy az ózonterápia biztonságos és hatékony kezelés a pikkelysömörben, és érdemes további klinikai értékelésekre és alkalmazásokra.

Betegek

Ezt a tanulmányt a Kínai Hunan, Changsha Közép-Déli Egyetem, Harmadik Hsziangya Kórház intézményi felülvizsgálati testülete (IRB) hagyta jóvá. Összesen 10 psoriasisos vulgaris diagnosztizált pszoriázisos beteget vontak be a vizsgálatba, és az írásbeli beleegyező űrlapokat minden alany aláírta. A betegekkel kapcsolatos klinikai információkat az 1. kiegészítő táblázat tartalmazza. A betegség aktivitásának értékelésére PASI-pontszámokat használtak. A vizsgálatba való felvétel kritériumai 18 és 60 év közötti, patológiás vizsgálatokkal diagnosztizált vulgaris pikkelysömörrel rendelkezőkre vonatkoztak. A kizárási kritériumok között szerepel az ózonozott vízre vagy olajra való allergia; terhesség vagy szoptatás; súlyos szisztémás betegségek; és az előző 2 hétben kortikoszteroidokat, D3-vitamin-származékokat, immungátlókat, biológiai terápiát vagy orális retinoidokat kapott.

A BALB/c egereket a Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd.-től szereztük be. 6 hetes korukban a nőstény egereket egy hétig adaptív módon etették és minden kísérlethez felhasználták. Valamennyi állatot a Közép-Dél Egyetem állatkísérleti központjában nevelték és kezelték, szigorúan a vonatkozó törvényeknek és intézményi irányelveknek megfelelően. Valamennyi állatkísérletet a Közép-Déli Egyetem Harmadik Hsziangya Kórházának Gyógyszer-állattartó és -használati Bizottsága hagyta jóvá és felügyelte.

Helyi ózonterápia

Valamennyi résztvevőt ozonizált vizes zuhannyal (3,0 ± 1,5 mg/l, HZ-2601B, Hunan Health Care Technology, Changsha, Kína) kezeltük 15 percig, naponta egyszer, majd helyi ozonozott olajjal (20160522, hozzávetőleges peroxid értéke 2000–2400 mmol-ekvivalens/kg, Hunan Health Care Technology, Changsha, Kína) naponta kétszer, 14 napig.

A bőrelváltozások klinikai fényképeinek és reflexiós konfokális mikroszkóp képeinek értékelése

Minden alany csak ingyenes ózonterápiát kapott; a kezelés során nem kaptak más kezelést és gyógyszert. A beavatkozás 14 napig tartott. A klinikai fényképeket, a PASI-pontszámokat és az RCM-képeket ugyanazok a hivatásos orvosok értékelték a betegség súlyosságának értékelése érdekében a kezelések előtt és után. Az irodalom szerint a PASI-pontszámok a bőrelváltozások, az erythema, a pikkelyezés és a megvastagodás területét tartalmazzák [27]. Mindegyik alanyot három különböző bőrelváltozás helyének RCM képeivel értékeltük. A bőr összes RCM-beolvasott vastagsága minden rétegben 51 réteg × 3,05 µm (függőlegesen) volt. RCM alatt az epidermális vastagságot és az infiltrált gyulladásos sejteket is értékeltük a kezelés előtt és után.

IMQ-indukált egérmodell a pikkelysömörről és az ózonintervencióról

A BALB/c nőstény (6-8 hetes) egereket megfelelő körülmények között etettük. Az egereket naponta egy 5% -os IMQ krémmel (Sichuan Med-Shine Pharmaceutical Co., Ltd., H20030128, Sichuan, Kína) kenjük be borotvált hátbőrükön 7 egymást követő napon. A kontrollcsoport egereit ugyanolyan mennyiségű vivőanyag-krémmel kezeltük. Az összes IMQ egeret véletlenszerűen három csoportra osztottuk: a nemintervenciós csoportra (IMQ csoport), az ózonkezelő csoportra (IMQ + ózon) és a hordozó krémmel kezelt csoportra (IMQ + jármű). Az ózonkezelő csoportot ozonizált vízzel kezelték (HZ-2601B, Hunan Health Care Technology Co., Ltd., Changsha, Kína) naponta egyszer 15 percig, majd helyi ózonozott olajjal kezelték (20160522, Hunan Health Care Technology Co ., Ltd., Changsha, Kína). A hordozó krémmel kezelt csoport ugyanolyan gyakorisággal kapott csapvizet és bázisolajat. A beavatkozás 7 napig tartott. A fenotípusos jellemzők értékeléséhez klinikai fényképeket és PASI-pontszámokat gyűjtöttünk. A 7. napon az összes egeret feláldoztuk a bőrelváltozások, lépszövetek és nyirokcsomók összegyűjtésére.

CD4 + T-sejtek izolálása

A perifériás vér mononukleáris sejtjeit (PBMC) a betegek perifériás vérétől a kezelés előtt és után centrifugálással választottuk el sűrűséggradiens táptalaj alkalmazásával (GE Healthcare, Chicago, IL, USA). A CD4 + T-sejteket pozitív szelekcióval izoláltuk Miltenyi gyöngyökkel, a gyártó utasításainak megfelelően (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Németország). Ezután az izolált CD4 + T-sejteket gyűjtöttük a későbbi kísérletekhez. Az egérkísérletben a CD4 + T-sejteket a lép egyesített egysejtű szuszpenzióiból tisztítottuk a Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Németország) egér CD4 + T-sejt izoláló készletével.

Áramlási citometria

A teljes RNS-t a sejtekből vagy a bőrszövetekből TRIzol alkalmazásával extraháltuk a gyártó utasításai szerint (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Az mRNS-t reverz átírással írtuk le PrimeScript® RT reagenskészlettel (Takara Biomedical Technology Co., Ltd., Kusatsu, Shiga, Japán), minden reakcióban 1 μg teljes RNS-sel. A valós idejű PCR reakcióelegye 2 μl cDNS-t, 10 μL SYBR Premix Ex Taq ™ -ot (Takara Biomedical Technology Co., Ltd., Kusatsu, Shiga, Japán) és 400 nM érzéki és antiszensz primereket tartalmazott térfogata 20 μL. A qPCR-t egy LightCycler® 96 (Roche, Rotkreuz, Svájc) termocikluson végeztük. A génexpresszió mennyiségét a 2-ACt módszerrel számoltuk ki, és gliceraldehid-3-foszfát-dehidrogenázra (GAPDH) normalizáltuk. Az alapozókat a 2. kiegészítő táblázat mutatja.

Western Blotting

A CD4 + T-sejteket lizáltuk, és a fehérjéket nukleáris extrakciós reagenssel extraháltuk (Boster Biological Technology, Pleasanton, CA, USA). A fehérjéket a Bradford-reagenssel (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) számszerűsítettük, majd 12% -os vertikális dodecil-szulfát-poliakrilamid gélelektroforézissel. A fehérjéket ezután egy polivinilidén-difluorid (PVDF) membránba vittük át (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). A PVDF membránt 5% sovány tejben blokkoltuk 1 órán át szobahőmérsékleten, majd P65 (GB11142, 1: 1000, Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, Kína) vagy P50 (ab7971, 1: 5000, Abcam, Cambridge, MA, USA) 12-16 órán át 4 ° C-on, majd inkubálás egér nyúlellenes IgG antitesttel (H&L) (GenScript, Piscataway, NJ, USA). A fehérjéket fokozott kemilumineszcencia (ECL) Western blot detektáló készlettel detektáltuk (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). A P65 és P50 mennyiségi meghatározását densitometriával normalizáltuk GAPDH-ra.

Szövettani elemzés

Az összes beteg és egér bőrszöveteit formalinban rögzítették és paraffinba ágyazták (Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan, Kína). A metszeteket (6 um) hematoxilinnal és eozinnal festettük és szobahőmérsékleten tároltuk. Megvizsgáltuk az epidermális vastagságot és az infiltrálódó gyulladásos sejteket.

Immunhisztokémiai festés

A metszeteket (6 µm) P50 (katalógusszám: BS1249, Bioworld Technology Co., Ltd., Nanjing, Kína), P65 (katalógusszám: 10745-1-AP, Proteintech, Rosemont, IL, USA) és TLR2 antitestekkel festettük. (katalógusszám: ab213676, Abcam, Cambridge, MA, USA) a gyártói utasításoknak megfelelően. A képelemzést fluoreszcens mikroszkóp és Leica Qwin Std elemző szoftver segítségével végeztük (Leica, Wetzlar, Németország).

Nagy áteresztőképességű szekvenálás

Az önkontrollos egérmodellekből származó bőrelváltozások bal és jobb oldalának transzkriptóm profilját kaptuk, valamint a kontrollcsoport és az IMQ csoport egér háti bőrének elváltozásait. Röviden: ezekből a bőrmintákból teljes RNS-t extraháltunk; az mRNS-t dúsítottuk, fragmentáltuk és felhasználtuk a cDNS-szintézishez. A cDNS-fragmenseket PCR-rel amplifikáltuk, és a szekvenáló könyvtár méretét és minőségét meghatároztuk egy Agilent 2100 Bioanalyzer segítségével (Agilent, Santa Clara, CA, USA). A könyvtárat HiSeq X Ten nagy áteresztőképességű szekvenáló platform (Illumina Inc., San Diego, Kalifornia, USA) segítségével szekvenáltuk. A kiválasztott minták között a differenciálisan expresszált géneket a Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) útvonal-dúsítási elemzéssel elemeztük.

Statisztikai analízis

Az összes, összesített adatokat ábrázoló diagram és grafikon a GraphPad Prism 6.0 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA) segítségével készült. Az adatokat átlagként ± az átlag standard hibájaként (SEM) ábrázolják. Az átlagok eloszlását nem paraméteres tesztekkel elemeztük (SPSS 18.0, IBM, Armonk, NY, USA). Az egyes kezelések különbségeit párosítottuk t tesztek. Statisztikai jelentőség (*P + T-sejtek a betegek perifériás véréből kvantitatív valós idejű PCR (qPCR) alkalmazásával. Várhatóan az IL-17a, IL-6, TNF-α, a transzformáló növekedési faktor (TGF) -β, az IFN-γ és az NF-κB expressziós szintje az ózonkezelés után alacsonyabb volt, mint a kezelés előtt (1f. Ábra). Az IL-17f és a Th17-sejt-specifikus transzkripciós faktor retinoid-rokon árva nukleáris receptor c (RORc) expressziós szintje csökkent az ózonkezelés után, de a csökkenésnek nem volt statisztikai szignifikanciája (1f ábra). Az IL-10 expressziója növekedett az ózonkezelés után, de nem szignifikánsan. Ezek az eredmények összhangban voltak a klinikai hatékonysággal. Eredményeink együttvéve azt mutatják, hogy a helyi ózonkezelés a gyulladásos folyamatok gátlásával javíthatja a betegek pszoriázisos bőrelváltozásainak állapotát.

A helyi ózonkezelés jelentősen gátolja az IMQ által kiváltott pikkelysömör-szerű elváltozásokat az egér bőrén. Az egereket véletlenszerűen négy csoportba osztottuk: Ctrl, IMQ, IMQ + Vehicle és IMQ + Ozone. a) A bőrelváltozások és szövettani jellemzők a különböző kezelési csoportok között. b) A testtömeg változásai és c) PASI pontszámok egereknél különböző kezelési csoportokban. d) Lép és lép-test-tömeg arány különböző kezelési csoportokban. Megjegyzés: * = P + Az egér lépéből és nyirokcsomóiból izolált T-sejtek. Western-blottolás a P65 expressziós szintjének értékeléséhez d) és P50 e) négy csoport egér lépéből és nyirokcsomóiból izolált CD4 + T sejtekben. A relatív expressziós szinteket GAPDH szintekre normalizáltuk. Megjegyzés: * = P

Megkapta 2020-1-12
Elfogadva 2020-3-21
Megjelent 2020-4-6