Az α tumor nekrózis faktor meghatározó tényezője a központi idegrendszer mikobakteriális fertőzésének patogenezisében és a betegség előrehaladásában

Közli: Maclyn McCarty, The Rockefeller University, New York, NY (áttekintésre kapott: 1999. január 12.)

Absztrakt

A központi idegrendszer tuberkulózisa (CNS) a betegség egyik legsúlyosabb megjelenési formája. Gyermekeknél a tuberkulózisos agyhártyagyulladás (TBM) körülbelül 50% -os halálozással jár, és a túlélők többségének állandó neurológiai következményei vannak, és jelentős fogyatékosságot tapasztalnak (1–4). A klinikai megjelenés súlyossága ellenére a központi idegrendszerben a mycobacterialis betegség patogenezisének hátterében álló sejtes és molekuláris mechanizmusok rosszul ismertek.

Korábban beszámoltunk a kísérleti TBM nyúlmodelljéről (5). Amikor a nyulakat nagy dózisú mikobaktériumok fertőzték meg a központi idegrendszerben, néhány napon belül engedtek a fertőzésnek. Ebben a modellben a fertőzött nyulak szokásos tuberkulózisellenes antibiotikumokkal történő kezelése nem védte meg az állatokat az agyhártyagyulladással összefüggő pusztulástól. Az antituberculus gyógyszerek és a talidomid immunmoduláló gyógyszerek kombinációja azonban drámai javulást eredményezett, és a fertőzött nyulak túlélték. A talidomid jótékony hatása a tumor nekrózis faktor α (TNF-α) termelésének gátlásával, a cerebrospinalis folyadékban csökkent leukocitózis (CSF) és az agyhártya gyulladásos reakciójának csillapításával járt.

A TNF-α az egyik olyan citokin, amely részt vesz a mikobaktériumok elleni sejtek által közvetített immunválaszban (6). Védő szerepe mellett a TNF-α termelés összefüggésbe hozható az in vivo patológia kialakulásával, beleértve a szöveti nekrózist és a cachexiát (elpusztulás) (7, 8). A központi idegrendszerben a TNF-α részt vesz a lázreakció indukciójában, aktiválja a hipotalamusz – hipofízis – mellékvese tengelyt, és kiváltja más citokinek felszabadulását (9–12). A TNF-α a vér – agy gát (BBB) „megnyitásával” is befolyásolhatja a vegyületek agyi transzportját (10). Bakteriális meningitisben szenvedő betegeknél a CSF magas TNF-α szintje korrelál az IL-6 és a fehérje megemelkedett szintjével, valamint az alacsony glükózszinttel (13). Ezenkívül a TNF-α és az IL-1β szintje hosszan tartó lázzal, görcsrohamokkal, görcsökkel és halálsal jár (13–15).

Annak tesztelésére, hogy a TNF-α szintje a CSF-ben meghatározza-e a patogenezis mértékét, a központi idegrendszerben nyulakat fertőztünk különböző Mycobacterium bovis törzsekkel, köztük virulens M. bovis Ravenel és avirulens M. bovis bacillus Calmette – Guérin (BCG) törzsekkel. Figyeltük a fertőző organizmusok perzisztenciáját, a TNF-α szinteket, a leukocitózisokat és a fehérje szinteket a CSF-ben, és követtük a fertőzés klinikai lefolyását. A TNF-α patogenezisben való részvételének közvetlen értékeléséhez a nyulakat megfertőzték az M. bovis BCG rekombináns törzsével, amely szekretálja az egér TNF-α-ját. Kiértékeltük a gyulladásos paramétereket, a betegség progresszióját és az agy patológiáját ezekben a nyulakban, és összehasonlítottuk ezeket a kontroll nyulakkal, amelyeket csak a plazmidvektort hordozó M. bovis BCG-vel oltottunk be.

ANYAGOK ÉS METÓDUSOK

Fertőző szervezetek.

Az alkalmazott M. bovis törzsek a következők voltak: (i) M. bovis Ravenel (Trudeau Mycobacterial Culture Collection, TMC 401), amelyekről ismert, hogy nagyon virulensek nyulakban (16, 17); (ii) M. bovis BCG Pasteur (Trudeau Mycobacterial Culture Collection, TMC 1011 sz.), amely avirulens nyulakban; (iii) rekombináns M. bovis BCG törzs, Montreal, amelyet genetikailag módosítottak egér TNF-α (BCG mTNF-α) kiválasztására; és (iv) az M. bovis BCG Montreal kontroll törzse, amely csak a plazmid vektort hordozza [BCG Montreal (v)] (18). A BCG genetikai manipulációi nem befolyásolták növekedési sebességüket: mindkét törzs [BCG mTNF-α és BCG Montreal (v)] hasonló növekedést mutatott folyékony és szilárd táptalajon. Ezenkívül a két törzs hasonló növekedési sebességet mutatott a tüdőben a B6x129 egerek intravénás fertőzése után (L.-G. Bekker és G. Kaplan, nem publikált adatok). A mikobaktériumokat Middlebrook 7H9 táptalajban (Difco) növesztettük, majd tenyésztést végeztünk Proskauer és Beck táptalajban, amely 0,01% Tween 80-at tartalmazott, a leírtak szerint (19). Rekombináns mikobaktériumokat a fentiek szerint növesztettünk 20 μg/ml kanamicinnel (Sigma) a leírtak szerint (18). A mikobaktériumokat fagyasztva, alikvot részekben tároltuk, majd felolvasztottuk és rövid ultrahangvizsgálatnak vetettük alá őket az aggregátumok felbomlása érdekében. Végső egysejtű szuszpenziókat készítünk 5–10 5 vagy 2 × 107 7 telepképző egység/cfu/0,1–0,2 ml oltás eléréséhez.

A meningitis kiváltása.

~ 2,5 kg új-zélandi fehér nyulakat (Charles River Breeding Laboratories) használtunk a leírtak szerint (5). Az érzéstelenített nyulakat sztereotaxikus keretbe helyeztük, gerinc tűt vezettünk be a cisterna magnába CSF mintavétel céljából, és 0,1–0,2 ml élő mikobaktériumot vagy pirogénmentes sóoldatot injektáltunk intraciszternálisan (kísérletenként 4–6 állat). Az oltás után 2 órával CSF-mintát nyertünk, hígítottunk és 7H10 agarra helyeztük, hogy meghatározzuk az injektált cfu számát. Néhány kísérletben a CSF mintákat az oltás után 0, 2, 4, 6 és 8 nappal vettük ki. Más kísérletek során a mintákat a 0., 1., 3., 7., 14. és 21. napon nyertük. Eutanázia után az agy felét, valamint a tüdő, a máj és a lép egy szegmensét aszeptikusan összegyűjtöttük, homogenizáltuk és felhasználtuk. a bacilláris terhelés értékelése. Az agy másik felét és a szervek többi részét eltávolítottuk és 10% (térfogat/térfogat) pufferolt formalin-acetátban (Fisher) rögzítettük, és felkészítettük hisztopatológiára. Ezt a protokollt a Rockefeller Egyetem Állattenyésztési és Felhasználási Bizottsága hagyta jóvá.

Ezenkívül rekombináns egér TNF-α-t (4 μg 200 μl sóoldatban; Endogen, Cambridge, MA) injektáltunk a nyulak cisterna magnájába. A leukocitózist 0, 4, 6, 8, 10 és 24 órán belül értékeltük az alábbiakban leírtak szerint.

CSF minták.

Közvetlenül a gyűjtés után kétszeres CSF-mintákat elemeztek a fehérvérsejtek számára (Coulter), és 100 μl CSF-t eltávolítottunk a baktériumterhelés meghatározásához. A CSF fennmaradó részét centrifugáltuk 10000 x g-vel 5 percig, és a felülúszót -70 ° C-on tároltuk TNF-α és fehérje vizsgálatokhoz. A CSF fehérje koncentrációját a gyártó által leírt bicinchonininsav módszerrel (BCA kit, Pierce) határoztuk meg. A sejtes üledéket differenciális sejtszámláláshoz (Diff-Quick, Baxter) és elektronmikroszkópiához használtuk.

Vérminták.

A heparinizált fecskendővel a vért különböző időpontokban gyűjtöttük a fülartériából, és centrifugáltuk 10000xg-vel. A plazmát elválasztottuk és -70 ° C-on lefagyasztottuk a TNF értékeléséhez.

TNF assay.

Mivel nyulak számára jelenleg nem áll rendelkezésre TNF-α ELISA készlet, a TNF biológiai aktivitását (TNF-α és TNF-β) CSF-ben és plazmában úgy határoztuk meg, hogy egér L929 fibroblasztokat használtunk célsejtként egy citotoxicitási vizsgálatban, amint azt leírtuk (20). A minimális kimutatási szint 16 egység/ml volt.

Az egér TNF-α szintjének meghatározása.

A rekombináns mikobaktériumok egér TNF-α szekréciós képességét ELISA módszerrel (Endogen, Cambridge, MA) ellenőriztük a baktériumtenyészet felülúszóinak a citokin koncentrációjának mérésével. Az egér TNF-α szintjét a nyúl CSF mintáiban szintén ELISA-val határoztuk meg.

cfu Assay.

A fertőzött nyulak baktériumterhelését a CSF-ben, az agyban, a tüdőben, a májban és a lépben úgy értékeltük, hogy a CSF és a szervhomogenátumok tízszeres hígítását hoztuk a Middlebrook 7H10 agar lemezekre (Difco), valamint a Middlebrook 7H10 agarra. 20 μg/ml kanamicinnel (Sigma) kiegészítve. A lemezeket 37 ° C-on inkubáltuk 2-3 hétig. A telepeket megszámoltuk és CFU-ként fejeztük ki.

Hisztopatológia.

10% -os formalinban (Fisher) történő rögzítés után a szervmintákat paraffinba ágyazottuk (TissuePrep 2, Fisher), majd metszettük és hematoxilinnel, eozinnal és saválló festéssel (Kinyouns) festettük. Az agyakat keresztirányban, 2-3 mm-es szakaszokban vágtuk a rostralis-caudalis-ig. Az elülső, a középső és a hátsó agyakat ábrázoló szakaszokat választottuk ki.

Elektronmikroszkópia.

A CSF sejtes üledéket és az agy egy részét, beleértve az agyhártyákat is, feldolgoztuk transzmissziós elektronmikroszkópiára a leírás szerint (21). A metszeteket megfestették és JEM 100CX transzmissziós elektronmikroszkóppal (JEOL) vizsgálták.

Statisztikai analízis.

Az eredményeket az egyes idõpontokban értékelt összes állatra kapott értékek átlagaként mutatjuk be. Az adatokat egy független Student-teszt segítségével elemeztük az állatok különböző csoportjainak összehasonlítására. P5 cfu) vagy magas (2 × 107 cfu) dózis viszonylag magas dózisfüggő TNF-szintet indukált a CSF-ben, amely a fertőzés után 2 órával tetőzött (1. ábra). Jelentős szinteket figyeltünk meg a 8. napig (az adatokat nem közöljük). A TNF-et szisztémásan kimutatták a Ravenel nagy dózisával fertőzött nyulak plazmájában is (az adatokat nem közöljük). Ezzel szemben a BCG Pasteurral oltott nyulak TNF-szintje alacsonyabb volt a CSF-ben 2 óra múlva, és alig volt kimutatható a későbbi időpontokban a posztinfekció után (1. ábra). Ezeknek a nyulaknak a plazmájában soha nem volt kimutatható TNF. A BCG Montreal (v) -vel fertőzött nyulak csúcsa (2 óra) alatt alacsonyabb volt (magas dózis), vagy nem volt TNF a CSF-ben (alacsony dózis). Így Ravenel több TNF-et indukált, mint a BCG törzsek, amelyek vagy alacsonyabb szintet, vagy egyáltalán nem.

A TNF szintje a CSF-ben 2 órával a fertőzés után. A nyulakat intraciszternálisan oltottuk be magas (2 × 10 7 cfu) (árnyékolt oszlopok) vagy alacsony (5 × 105 5 cfu) (keresztkötésű oszlopok) mikobaktériumok adagjával. Jelentősen alacsonyabb TNF-szinteket figyeltek meg az M. bovis BCG Montreal (v) alacsony dózisával fertőzött nyulakban, összehasonlítva az M. bovis Ravenel-rel (P = 0,02). Az értékek csoportonként 4–6 nyúlból kapott eredmények átlagai ± SEM. ∗ statisztikai szignifikanciát jelöl.

Jelentős különbségeket figyeltünk meg a leukocita válaszban a CSF-ben is (2. ábra). A Ravenel magas leukocita-felhalmozódást váltott ki, amely fokozatosan növekedett, jelezve, hogy a BBB-t megsértették. A 6. napon az alacsony dózissal és nagy dózissal fertőzött nyulakban a sejtszám meghaladta a 11 000/mm 3 és> 15 000 sejt/mm 3 -et. Ezzel szemben a BCG Pasteur és Montreal (v) bármikor nem tudott figyelemre méltó leukocitózist kiváltani (2. ábra). Valamennyi nyúlnál a CSF differenciálszámának vizsgálata azt mutatta, hogy a sejtek több mint 90% -a mononukleáris (monocita és limfocita).

A fertőzött nyulak leukocita száma és cfu a CSF-ben. A nyulakat intraciszternálisan oltottuk be magas (töltött szimbólumokkal) vagy alacsony (nyitott szimbólumokkal) M. bovis Ravenel, BCG Pasteur vagy BCG Montreal (v) dózissal. A leukocitózis csökkent a BCG Pasteur és a BCG Montreal (v) fertőzött nyulakban a Ravenellel összehasonlítva a 4. napon (P Tekintse meg ezt a táblázatot:

Soron belüli megtekintése
Felugró ablak megtekintése

A fertőzött nyulak szerveinek mikobaktériumszintje (8. nap)

Meningitis különböző M. bovis törzsekkel való fertőzés után.

A gyulladásos paraméterek és a bakteriális terhelés korreláltak az agyhártyagyulladás klinikai lefolyásával. A nagy dózisú Ravenel-fertőzött nyulaknál súlyos neurológiai tünetekkel járó akut progresszív agyhártyagyulladás alakult ki, beleértve aluszékonyságot vagy ingerlékenységet, koordinációvesztést, hemiparesist vagy hemiplegiát, és 4-8 napig túlélték. Az alacsony dózisú Ravenel szubakut gyulladásos választ váltott ki, amely késleltetett, kevésbé súlyos tüneteket és legalább 8 napos túlélést eredményezett. A BCG Pasteurral vagy Montreal-nal oltott állatoknál (v) semmilyen tünet nem jelentkezett, és nem mutatták a központi idegrendszeri betegség klinikai jeleit.

Nyulak válasza CNS-fertőzés után egér TNF-α-t szekretáló rekombináns BCG-vel.

A fent leírt eredmények arra utaltak, hogy a TNF-α csúcsszintje 2 órával a posztinokuláció után meghatározta a mycobacterialis CNS fertőzés patogenezisét és lefolyását. A TNF-α szerepének közvetlen kezelése érdekében a nyulakat megfertőztük a BCG Montreal rekombináns törzsének alacsony dózisával (5 × 105 cfu), amely kifejezi az egér TNF-α génjét (BCG mTNF-α) vagy a kontroll törzset. BCG Montreal (v). Az állatokat 3 hétig figyeltük.

Annak igazolására, hogy a BCG mTNF-α szekretálja az egér citokint a fertőzés során, a CSF-ből kinyert mikobaktérium-telepeket 5 napig 20 μg/ml kanamicinnel kiegészített 7H9 táptalajban növesztettük, és a felülúszókat TNF-α-val teszteltük. ELISA. A TNF-α koncentrációk minden időpontban 10 000–40 000 pg/ml tartományban voltak, ami azt jelzi, hogy a rekombináns BCG egér TNF-α-t termelt a kísérlet során.

BCG mTNF-α-val fertőzött nyulak reakciója. A nyulakat intraciszternálisan 5x105 cfu BCG mTNF-α-val (töltött szimbólumok) (n = 10) vagy BCG Montreal (v) (nyitott szimbólumok) (n = 9) fertőztük és 21 napig figyeltük. (Bal felső sarok) TNF-koncentráció a fertőzött nyulak CSF-jében. A TNF szintjei 2 óra múlva magasabbak voltak a BCG mTNF-a-val oltott nyulakban, mint a BCG Montreal (v) (P3) volt megfigyelhető a CSF-ben 24 órával a citokin beadása után. Ez az eredmény hasonló az exogén módon beadott nyúl TNF-α hatásainak korábbi vizsgálatában elért eredményekhez (11). Megállapításunk azt mutatja, hogy a nyulak reagálnak az egér TNF-α-ra.

Ezt követően a leukocita választ vizsgáltuk a CSF-ben. A BCG Montreal (v) nem váltott ki szignifikáns leukocitózist (3. ábra). A sejtszám a kísérlet során 3 volt. Ezzel szemben a BCG mTNF-α kiterjedt leukocita beáramlást indukált a CSF-be. A magas leukocita szám a 21. napig fennmaradt.

A BBB sérülés másik jellemzője a fehérje felhalmozódása a CSF-ben. A BCG Montreal (v) oltott nyulak CSF fehérje szintje a normál tartományon belül volt (lásd ezt a táblázatot:

Soron belüli megtekintése
Felugró ablak megtekintése

CFU fertőzött nyulak szerveiben (21. nap)

A fertőzött nyulak agyhártyájának és agyának hisztopatológiája (21 nap). (A) BCG Montreal fertőzött nyúl (v). Enyhe fokális gyulladásos reakció látható az agyhártyán (nyilak). Nincs bizonyíték perivaszkuláris szövetkárosodásra vagy leukocita infiltrációra a neuropilon belül. (B) BCG mTNF-α-val fertőzött nyúl. A leptomeningek jelentős megvastagodása és az arachnoidális tér kitágulása figyelhető meg nagyszámú gyulladásos sejt által (nyilak). Megjegyzés: a perivaszkuláris gyulladás kiterjesztése neuropilra. A metszeteket hematoxilinnal és eozinnal festjük. Nagyítás × 25. Az ereket felcímkézik V.

A BCG mTNF-α-val (A és C) vagy a BCG Montreal (v) (B) fertőzött nyulak CSF sejtes üledékének (14. nap) és az agyhártya (21. nap) elektronmikroszkópos felvételei (C és D). és D). (A) BCG mTNF-α-val fertőzött nyúl CSF-jéből származó sejtes üledék. Mononukleáris sejtek figyelhetők meg, beleértve a megnagyobbodott szabálytalan makrofágokat (M) és a limfocitákat (Ly). Jegyezzük fel a mikobaktériumokat egy parazitált makrofág citoplazmájában lévő szűk vakuolában (nyilak). Nagyítás × 3600. a) A mikobaktériumokat tartalmazó vakuola nagyobb nagyítása. Nagyítás × 20 000. (B) BCG Montreal-val fertőzött nyúl sejtszintű üledéke (v). Kerek limfociták (Ly) és monociták (M) figyelhetők meg. Ezekben a sejtekben nem detektáltak fagocitált mikobaktériumokat. Nagyítás × 2900. (C) BCG mTNF-α-val fertőzött nyúl agyhártyája. Az agyhártya területének kapilláris eret (V) tartalmazó része látható, a perivaszkuláris térben limfociták (Ly) és monociták (M) vannak. Jegyezzünk fel egy migráló limfocitát, amely a mikrográf tetején keresztezi az endotheliális monoréteget. Nagyítás × 2900. (D) BCG Montreal fertőzött nyúl agyhártyája (v). Meningealis ér (V) látható. A perivaszkuláris térben kevés migráló makrofág (M) látható. Nagyítás × 2200.

VITA

Az itt leírt kísérletek azt mutatják, hogy a TNF-α a központi idegrendszerben a mikobakteriális patogenitás meghatározója. Több bizonyíték is alátámasztja ezt a következtetést. Amikor a nyulakat olyan mikobaktériumtörzs fertőzi meg, amely magas TNF-α szintet indukál a CSF-ben, súlyos akut agyhártyagyulladás alakul ki, és néhány napon belül elpusztul. Ez nem figyelhető meg, ha a nyulakat olyan mikobaktériumtörzsek fertőzik meg, amelyek nem sok TNF-α felszabadulást indukálnak. Ezenkívül korábban kimutattuk, hogy a fertőzött nyulakban a TNF-α termelés thalidomid kezeléssel történő gátlása blokkolja az agyhártyagyulladás kialakulását (5). Végül, amikor a nem vírusos törzset genetikailag úgy módosítják, hogy tartalmazzon egy funkcionális gént a TNF-a számára, a nem vírusos törzs virulenssé válik. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a mycobacteriumok központi idegrendszerben való patogenitása legalább részben függ a TNF-α indukciójától, ami a BBB megsértését és a gyulladásos kaszkád kiváltását eredményezi. Ezek a változások agyödémához, cerebrovaszkuláris elváltozásokhoz és megnövekedett koponyaűri nyomáshoz vezetnek (22).

A központi idegrendszerben a TNF-α termelés annyira káros lehet, mert prokoaguláns aktivitás (23), trombusképződés és nitrogén-oxid szintáz (24–26) termelésével indukálja az érrendszeri endotheliumot, ezáltal endarteritist okozva. A nagy vagy kicsi erek elzáródása okozza a koponya idegi bénulását, a hemiparézist és a bénulást. Ezenkívül beszámoltak arról, hogy a rekombináns humán TNF-a injekciója a nyulak cisterna magnájába az agy oxigénfelvételének akut csökkenését és az agyi véráramlás elhúzódó csökkenését eredményezi (24). Még kis mennyiségű TNF-α is káros hatást gyakorolhat a kapillárisokra, amelyeket a mikobaktériumok már érzékenyítenek (27). A BCG mTNF-α-val fertőzött nyulak agyán és agyhártyáján végzett morfológiai vizsgálataink közvetlenül a vaszkulatúra károsodását mutatják be a TNF-α helyi termelésével (5. és 6. ábra).

Lehetséges, hogy a TNF-α hatását a fertőzött sejten belüli mikobaktériumok számára az apoptózis szabályozása közvetíti. Nemrégiben beszámoltunk arról, hogy a mikobaktériumok által fertőzött makrofágok apoptózisának indukciója ATP 4– vagy H2O2-vel társult az intracelluláris bacillusok megölésével (21, 30). Jelenleg azt vizsgáljuk, hogy a TNF-α szintje meghatározza-e in vitro a mikobaktériumokkal fertőzött humán monociták apoptózisának mértékét, és azt is, hogy a citokin-modulált apoptózis összefügg-e intracelluláris bacillusok megölésével a nyúl fertőzés modelljében.

Köszönetnyilvánítás

Köszönjük Wilhelmine Hellmann-nak az elektronmikroszkópos vizsgálatokhoz nyújtott szakértői segítségét, Judy Adams-nak az ábrák elkészítéséért és Marguerite Nulty titkársági segítségét. Ezt a munkát részben a Celgene Corporation (Warren, NJ) támogatta.