CTELS: Cellamentes rendszer a fordítás befejezési arányának elemzésére

Kis és nagy molekulatömegű inhibitorok vizsgálata CTELS módszerrel. (a) A blasztidin S (BLS) FLUC és CTELS1 transzlációra gyakorolt ​​hatásainak elméleti előrejelzése, tekintve, hogy a gyógyszer specifikusan gátolja a terminációt. Amikor a vegyületet hozzáadták a FLUC által programozott sejtmentes rendszerhez (kék görbék), el kell nyomnia a transzlációt a peptid felszabadulás gátlása miatt, míg a CTELS mRNS-sel (vörös görbék) álló keverékhez való hozzáadása nem befolyásolhatja a luciferáz aktivitását hozam a kezdeti lépésben, amíg az úttörő riboszómák által szintetizált összes enzimmolekula be nem fejeződik; csak ezt követően kell a CTELS mRNS transzlációt is lezárni, ami fennsíkot eredményez a görbében. (b) A lezárt és poliadenilezett FLUC és CTELS1 mRNS-ek RRL-ben történő transzlációjával létrehozott luciferáz-aktivitás. Három független kísérlet reprezentatív görbéjét mutatjuk be. c). Az eRF1 (AGQ) FLUC és CTELS1 transzlációra gyakorolt ​​hatásainak elméleti előrejelzése, figyelembe véve, hogy a fehérje specifikusan gátolja a terminációt. d) A (b) pontban leírt riporter mRNS-ekkel végzett kísérlet eredményei 25 ng/μl eRF1 mutáns (pontozott görbék) vagy puffer (szilárd görbék) hozzáadásával.

A 3 ′ UTR rövidítésének hatása a transzláció befejezésére, amint azt a CTELS megközelítés feltárta. (a) A kísérletben használt, lezárt, nem poliadenilezett FLUC mRNS konstrukciók halmaza. Ugyanaz a CTELS2 átiratkészlet nem látható. (b - d) A FLUC és CTELS2 mRNS-ek három különböző sejtmentes rendszerben történő transzlációjával létrehozott luciferáz-aktivitás: RRL (b), Krebs-2 S30 kivonat (c) és hibrid RRL/Krebs-2 rendszer (d) . Legalább három független kísérlet reprezentatív görbéjét mutatjuk be.

Az átolvasás indukáló szekvencia hatása a transzláció befejeződési sebességére. Egy riporter mRNS (FLUC és CTELS2), amelyek a 3 'végén vagy 3' UTR-t tartalmaznak a mesterséges szekvenciával (agcatc) 10 (3′UTR_60), a VEEV 3 'UTR-ből származtatott szerkezettel, vagy nem 3' UTR-vel egyáltalán (3′UTR_0), valamint a nonstop mRNS-t RRL (a) vagy hibrid RRL/Krebs-2 (b) sejtmentes rendszerekben transzláltuk. Legalább három független kísérlet reprezentatív görbéjét mutatjuk be.

Az elakadás okozta hülyeség elnyomásának és idő előtti befejezésének modellje. (Felső) Rendszeres megnyúlás és végződés, amely általában az értelemben (zöld téglalapok) és a stop kodonoknál (piros színnel) történik. (Alul) egy ritka kodon (balra) vagy a stop kodon (át) átolvasást elősegítő kontextusa (jobbra) ideiglenes elakadást okoz, amelyet nem megfelelő módon lehet megoldani, mivel a felszabadulási faktorok riboszómával kötődnek a kodon vagy egy szuppresszor tRNS érzékeléséhez. stop kodon, ami idő előtti végződéshez vagy átolvasáshoz vezet. Az eEF1A-t a sötétzöld ábra, az eRF1 – eRF3 komplexet a rózsa és a narancssárga ábrázolja.

Absztrakt

teljes

Kis és nagy molekulatömegű inhibitorok vizsgálata CTELS módszerrel. (a) A blasztidin S (BLS) FLUC és CTELS1 transzlációra gyakorolt ​​hatásainak elméleti előrejelzése, tekintve, hogy a gyógyszer specifikusan gátolja a terminációt. Amikor a vegyületet hozzáadták a FLUC által programozott sejtmentes rendszerhez (kék görbék), el kell nyomnia a transzlációt a peptid felszabadulás gátlása miatt, míg a CTELS mRNS-sel (vörös görbék) álló keverékhez való hozzáadása nem befolyásolhatja a luciferáz aktivitását hozam a kezdeti lépésben, amíg az úttörő riboszómák által szintetizált összes enzimmolekula be nem fejeződik; csak ezt követően kell a CTELS mRNS transzlációt is lezárni, ami fennsíkot eredményez a görbében. (b) A lezárt és poliadenilezett FLUC és CTELS1 mRNS-ek RRL-ben történő transzlációjával létrehozott luciferáz-aktivitás. Három független kísérlet reprezentatív görbéjét mutatjuk be. c). Az eRF1 (AGQ) FLUC és CTELS1 transzlációra gyakorolt ​​hatásainak elméleti előrejelzése, figyelembe véve, hogy a fehérje specifikusan gátolja a terminációt. d) A (b) pontban leírt riporter mRNS-ekkel végzett kísérlet eredményei 25 ng/μL eRF1 mutáns (pontozott görbék) vagy puffer (szilárd görbék) hozzáadásával.

A 3 ′ UTR rövidítésének hatása a transzláció befejezésére, amint azt a CTELS megközelítés feltárta. (a) A kísérletben használt, lezárt, nem poliadenilezett FLUC mRNS konstrukciók halmaza. Ugyanaz a CTELS2 átiratkészlet nem látható. (b - d) A FLUC és CTELS2 mRNS-ek három különböző sejtmentes rendszerben történő transzlációjával létrehozott luciferáz-aktivitás: RRL (b), Krebs-2 S30 kivonat (c) és hibrid RRL/Krebs-2 rendszer (d) . Legalább három független kísérlet reprezentatív görbéjét mutatjuk be.

Az átolvasás indukáló szekvencia hatása a transzláció befejeződési sebességére. Pár riporter mRNS (FLUC és CTELS2), amelyek a 3 'végén vagy 3' UTR-t tartalmaznak a mesterséges szekvenciával (agcatc) 10 (3′UTR_60), a VEEV 3 'UTR-ből származtatott szerkezettel, vagy nem 3' UTR-vel egyáltalán (3′UTR_0), valamint a nonstop mRNS-t RRL (a) vagy hibrid RRL/Krebs-2 (b) sejtmentes rendszerekben transzláltuk. Legalább három független kísérlet reprezentatív görbéjét mutatjuk be.

Az elakadás okozta hülyeség elnyomásának és idő előtti befejezésének modellje. (Felső) Rendszeres megnyúlás és végződés, amely általában az értelemben (zöld téglalapok) és a stop kodonoknál (piros színnel) történik. (Alul) egy ritka kodon (balra) vagy a stop kodon (át) átolvasást elősegítő kontextusa (jobbra) ideiglenes elakadást okoz, amelyet nem megfelelő módon lehet megoldani, mivel a felszabadulási faktorok riboszómával kötődnek a kodon vagy egy szuppresszor tRNS érzékeléséhez. stop kodon, ami idő előtti végződéshez vagy átolvasáshoz vezet. Az eEF1A-t a sötétzöld ábra, az eRF1 – eRF3 komplexet a rózsa és a narancssárga ábrázolja.