Egyeseknek táplálék, másoknak méreg - méh méhpempő és növekedését gátló hatása az európai Foulbrood baktériumokra

Institut für Biologie, Zoologie - Molekulare Ökologie, Martin-Luther-Universität Halle ‐ Wittenberg, Halle (Saale), Németország

Departamentul de Apiculturǎ şi Sericiculturǎ, Facultatea de Zootehnie és Biotehnologii, Universitatea de Ştiinţe Agricole şi Medicinǎ Veterinarǎ, Kolozsvár, Románia

Institut für Biologie, Zoologie - Molekulare Ökologie, Martin-Luther-Universität Halle ‐ Wittenberg, Halle (Saale), Németország

Levelezés

Anja Buttstedt; Institut für Biologie - Molekulare Ökologie, Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg, Halle (Saale), Németország.

Institut für Biologie, Zoologie - Molekulare Ökologie, Martin-Luther-Universität Halle ‐ Wittenberg, Halle (Saale), Németország

Departamentul de Apiculturǎşi Sericiculturǎ, Facultatea de Zootehnie şi Biotehnologii, Universitatea de Ştiinţe Agricole şi Medicinǎ Veterinarǎ, Kolozsvár, Románia

Institut für Biologie, Zoologie - Molekulare Ökologie, Martin-Luther-Universität Halle ‐ Wittenberg, Halle (Saale), Németország

Institut für Biologie, Zoologie - Molekulare Ökologie, Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg, Halle (Saale), Németország

Levelezés

Anja Buttstedt; Institut für Biologie - Molekulare Ökologie, Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg, Halle (Saale), Németország.

Absztrakt

Méhcsaládok (Apis mellifera) vonzó gazdaszervezetként szolgálnak a különféle kórokozók számára, optimális hőmérsékletet, páratartalmat és rengeteg ételt biztosítva. Így a mézelő méheknek egész életükben meg kell küzdeniük a kórokozókkal, és még lárvákként is olyan súlyos fiasítási betegségek érintik őket, mint például az Melissococcus plutonius. Ennek megfelelően erősen alkalmazkodó, hogy a lárva táplálkozási zselé antibiotikus vegyületeket tartalmaz. Bár az étkezési zselét elsősorban a méhlárvák fogyasztják, ennek a zselének az antibiotikus hatásait vizsgáló tanulmányok nagyrészt az emberi bakteriális betegségekre koncentráltak. Ebben a tanulmányban megmutatjuk, hogy a méhpempő a királylárváknak táplálva, hozzáadva a drón- és munkalárvák zseléjéhez, nemcsak az európai Foulbrood-hoz kapcsolódó baktériumok szaporodását gátolja, hanem annak kórokozóját is M. plutonius. Kimutatták, hogy ezt a hatást a méhpempő fő fehérje (fő méhpempő fehérje 1) okozza.

1. Bemutatkozás

Felnőtt mézelő méhek (Apis mellifera) a kaptárban növekvő lárváikat nemtől, kaszttól és kortól függően különböző étkezési zselékkel táplálják. A királyi lárvák csak méhpempőt (RJ) kapnak, a fiatal munkaméhek hypopharyngealis és mandibularis mirigyének váladékát, amely tartalmazza az összes tápanyagot, amely a királynénnyá való fejlődéshez szükséges (Snodgrass, 1925). A munkás és a drón lárvákat RJ-vel táplálják, kiegészítve mézzel és virágporral, amelyet a kaptár raktáraiban szereznek be. Ez a hatalmas mennyiségű, optimális hőmérsékleten tárolt élelmiszer (

30 ° C) és a páratartalom (

60%) baktériumok és gombák szaporodásához ideális feltételeket biztosítanak mindenféle kórokozó szaporodásához. Tekintettel arra, hogy a telep minden lárvája kiveszi a részét az RJ pitéből, nem biztos, hogy meglepő, hogy az RJ antibiotikus tulajdonságokkal rendelkezik számos baktérium ellen (Fujiwara et al., 1990; Hinglais, Hinglais, Gautherie és Langlade, 1955; McCleskey És Melampy, 1939), bár az elvégzett vizsgálatok túlnyomó többsége emberi betegségeket okozó baktériumokhoz kapcsolódik. Ami a méh kórokozóit illeti, elképesztően keveset lehet tudni az RJ hatásáról a méhspecifikus kórokozókra, tekintettel a globális telepveszteségekre vonatkozó tudományos és közvélemény-tudatosságra (Moritz & Erler, 2016; Potts et al., 2010). A legtöbb kutatás a gram-pozitív baktériumokra korlátozódott Paenibacillus lárvák a fiasítási betegségért felelős American Foulbrood (AFB) (Erler & Moritz, 2016; White, 1906).

A telepek azonban elpusztulhatnak az európai fertőzöttségtől (EFB) is, amely egy másik, különböző baktériumokhoz társuló fiasítási betegség (Forsgren, 2010). Bár az EFB fő kiváltója a gram-pozitív mikroaerofil Melissococcus plutonius (Forsgren, 2010; White, 1912) más baktériumok, például, Enterococcus faecalis, Paenibacillus alvei, Brevibacillus laterosporus, Bacillus pumilus, és Achromobacter euridice, kimutatták, hogy az EFB-vel, úgynevezett másodlagos betolakodókkal együtt fordulnak elő (Erler, Denner, Bobiş, Forsgren és Moritz, 2014; Forsgren, 2010). Mivel, M. plutonius kétségtelenül patogén és kiváltja az EFB-t, P. alvei, B. pumilus, és A. euridice a felnőtt mézelő méh bél mikroflórájának gyakori baktériumfajaként is azonosították (Gilliam, 1997) és B. laterosporus méhlárvákban, bábokban és takarmányokban detektálták anélkül, hogy kórokozók lennének (Marche, Mura és Ruiu, 2016). Azonban az együttes előfordulás mellett M. plutonius, a másodlagos betolakodók szerepe az EFB előrehaladása során nem tisztázott.

1 kDa) az MRJP1 C-terminálisából származó antimikrobiális peptidek szintén jelen vannak a lárvaeledelben (Fontana et al., 2004). Azonban ezekben a vizsgálatokban tesztelt baktériumok többsége nem kapcsolódott a mézelő méh betegségekhez, és az MRJP-k antimikrobiális aktivitásáról semmit sem tudni M. plutonius és a méhbetegség másodlagos betolakodói EFB. Itt számolunk be az RJ és fő fehérje, az MRJP1 hatásáról M. plutonius és az EFB-hez kapcsolódó baktériumfajokon, amelyek az evolúció szempontjából releváns adaptációkat tárhatják fel az emberi kórokozók átvizsgálása helyett.

2 Anyag és módszerek

2.1 Baktériumtörzsek és tenyésztés

2.2 Baktérium növekedési vizsgálatok

2.3 Méhpempő minták

Méhpempő mintákat a Naturprodukte Lembcke GbR-től (Faulenrost, Németország) (RJNP, Kínából importálták), a Cum Natura GmbH-tól (Bühl, Németország) (RJCUM, Thaiföldről importálták) és az Aspermühle Naturwaren-Niederrhein GmbH-tól (Goch-Asperden) vásárolták., Németország) (RJASP, Kínából importálva) és közvetlenül érkezés után -20 ° C-ra fagyasztva, 2 g-os alikvotokban. Egyik minta sem mutatott antibiotikum-szennyeződést a kimutatási határ felett (elemzéseket az Intertek Holding Deutschland GmbH, Leinefelden-Echterdingen, Németország végezte). A vizsgált antibiotikumok sztreptomicin, szulfonamidok és trimetoprim voltak az összes RJ mintához, valamint a tetraciklinek, klóramfenikol, nitrofurán metabolitok, nitroimidazolok, fluorokinolonok és az RJNP és RJCUM makrolidjai.

2.4 Méhpempő víz/táptalaj kivonatok elkészítése és elemzése

Az RJ víz/táptalaj kivonatok elkészítéséhez 2 g RJ-t vagy 2 ml dupla desztillált vízzel kevertünk a fizikai-kémiai elemzéshez, vagy 2 ml megfelelő táptalajjal a baktérium növekedési vizsgálathoz. A mintákat kétszer 10 percig centrifugáltuk 20 000-nélg a szilárd anyagok eltávolításának biztosítása érdekében. A glükóz-, fruktóz- és szacharóztartalmat HPLC-vel (Sesta, 2006) határoztuk meg egy Shimadzu VP sorozatú folyadékkromatográf segítségével, amely gáztalanítóval, szivattyúval, kontrollerrel, oszlopkemencével és automatikus injektorral volt felszerelve (Shimadzu Scientific Instruments, Columbia, USA). Acetonitrilt/75% (v/v) vizet használtunk mozgófázisként a cukrok elválasztására Alltima Amino 100Å 5 μm oszlopon (256 × 4,6 mm) 1,3 ml/perc, 30 ° C-os áramlási sebességgel, és kimutattuk. RID-10A törésmutató-detektorral. A 10-HDA-tartalmat (Liu, Yang, Shi, & Peng, 2008) szerint határoztuk meg Shimadzu VP sorozatú folyadékkromatográffal, fotodiódarendszer-detektorral és LC-18 (5 μm) oszloppal (256 × 4,6 mm). LC ‐ 18 2CM előoszlopos készlettel. A teljes fehérjetartalmat a Bradford (Bradford, 1976) módszerrel és a BSA-val (szarvasmarha-szérum albumin) határoztuk meg a kalibrációs görbe standardjaként. A méréseket 595 nm-en Shimadzu UV spektrofotométerrel végeztük.

2.5 Az MRJP1 tisztítása RJ-ből

Az RJ vízkivonatok átlagosan 46 mg/ml összes fehérjét tartalmaztak, amelyeknek 30% -át MRJP1-nek gondolják (Schmitzová et al., 1998), és így az extraktumok körülbelül 14 mg MRJP1-et tartalmaznak ml-enként. Ezért úgy döntöttünk, hogy az első kísérletben az MRJP1-et alkalmazzuk 500 μg/ml koncentrációban, amely megközelítőleg tükrözi a fehérje koncentrációját a 4% RJ vízkivonatokban.

2.6 Statisztika

A statisztikai elemzéseket a STATISTICA 8.0-val (StatSoft, Tulsa, OK, USA) végeztük. A cukorkontroll hatásának meghatározásához a baktériumok szaporodási görbéinek meredekségeit egyirányú varianciaanalízissel (ANOVA) hasonlítottuk össze, amelyet post hoc Scheffe-teszt követett, ha az adatok megfelelnek a normális eloszlás kritériumainak Kolmogorov – Smirnov vagy Kruskal – Wallis szerint. ANOVA, ha nincs normálisan elosztva. A három különböző RJ minta hatása a E. faecalis, B. pumilus, P. alvei és B. laterosporus elemeztük egy általános linearizált modell (GLM) (log link funkció és gamma eloszlás) felhasználásával transzformált adatokkal (növekedésgátlás + 0,06) a negatív adatpontok kiküszöbölése érdekében. Az 500 μg/ml MRJP1 EFB baktériumokra gyakorolt hatását a növekedési görbe lejtéseinek páros összehasonlításával határoztuk meg MRJP1-vel és anélkül a Mann – Whitney U teszt (MWU) segítségével. A dózis-válasz kísérleteket egyirányú ANOVA-val elemeztük, amelyet post hoc Scheffe teszt követett. A B. pumilus, E. coli, és P. fluorescens rendszerint elosztották, míg a E. faecalis transzformáltuk a következő egyenlet szerint f (x) = exp (x).

3 találat

3.1 Méhpempő-víz kivonatok fizikai-kémiai elemzése

A tiszta RJ-ben átlagosan talált cukormennyiségek hozzávetőlegesen felét 3,44% glükózzal visszanyerték a vízkivonatokban, szemben 6,83%, 2,98% fruktózzal, 5,85% és 0,45% szacharóztartalommal, szemben 1,09 tömeg% -kal (SI táblázat) ). Az extraktumok 4,62% összes fehérjét tartalmaztak, szemben az RJ-ben mért 11,71% -kal. A 10-HDA zsírsav csak marginális oldhatóságot mutatott vízben (0,23%, szemben az RJ 1,70% -ával). A kereskedelmi RJ minták értékeit (Pavel et al., 2014).

3.2 A méhpempő-víz kivonatok hatása a baktériumok szaporodására

Az RJ hatásának meghatározására a különböző baktériumtörzsek növekedésére a növekedési görbéket standard táptalajban rögzítettük, és kiegészítettük cukoroldattal vagy RJ vízkivonatokkal. A cukorszabályozás nem befolyásolta a E. faecalis (ANOVA, MS = 0,006, F = 3,842, o ≥ .080), fokozta a B. pumilus a legmagasabb cukorkoncentrációnál (Kruskal – Wallis ANOVA, H = 14,843, o ≤ .03); és az B. laterosporus (ANOVA, MS = 0,001, F = 7,527, o ≤ .02), és P. alvei az összes mért cukorkoncentrációnál (ANOVA, MS = 0,007, F = 13,292, o ≤ .02) (S2. Táblázat). Így a cukor baktériumok szaporodására gyakorolt erős gátló ozmotikus hatása a mézben (Erler és mtsai, 2014) nem alkalmazható az RJ vízkivonatok viszonylag alacsony cukorkoncentrációinál.

Az extraktumok mind a négy, az EFB-hez kapcsolódó baktérium növekedését lassították, csökkentve a meredekséget és koncentrációfüggő módon meghosszabbítva a növekedés késleltetési fázisát (S2. Táblázat). A mikroaerofil természet miatt M. plutonius növekedése alig volt kimutatható a pozitív kontrollban. Bármilyen koncentrációjú RJ vízkivonat hozzáadása teljesen megakadályozta a baktériumok szaporodását (S2. Táblázat). Mivel M. plutonius növekedést csak a pozitív kontrollban figyeltek meg más körülmények között (72 órán át tartó OD mérések rázás nélkül), mint a többi baktériumnál, ezt kizártuk a többi baktérium statisztikai elemzéséből, GLM alkalmazásával. A növekedésgátlást a cukorkontrollhoz képest a növekedési görbe meredeksége alapján határoztuk meg a log fázisokban (1. ábra). A baktériumfajok, az RJ vízkivonat százalékos aránya és a kettő közötti kölcsönhatás óriási hatást gyakorolt a baktériumok növekedésének gátlására (GLM; baktériumok: W = 366,228, df = 3, o

3.3 Az MRJP hatása1

Az MRJP1 (500 μg/ml) hozzáadása jelentősen csökkentette az összes mért baktériumnövekedési görbe meredekségét (2. ábra; MWU, Z ≥ 2,611, o ≤ .009) a növekedés teljesen gátolt P. alvei, B. laterosporus, és M. plutonius és növekedési gátlás a 0,67 ± 0,04 pozitív kontrollhoz képest E. faecalis és 0,69 ± 0,02 B. pumilus.

Annak megállapításához, hogy az MRJP1 hatása koncentrációfüggő-e, sorozatos hígítási kísérleteket hajtottak végre 500–15 μg MRJP1/ml tápközeggel a gyorsan növekvő gram-pozitív baktériumokkal E. faecalis és B. pumilus. Ezenkívül kísérleteket végeztek a gram-negatív fajokkal is Escherichia coli és Pseudomonas fluorescens. Bár ezek a baktériumok nem társulnak semmilyen méhbetegséghez, rávilágítanak az MRJP1 gram-negatív baktériumokra gyakorolt hatására általában. Míg a 15 és a 30 μg/ml nem volt hatással, a 60 μg/ml jelentősen lelassította mind a négy vizsgált baktériumfaj növekedését (ANOVA, MS = 0,03–0,37, F = 48,86–188,69; Scheffe teszt o ≤ 0,012) és 500 μg/ml relatív növekedési gátlást mutatott 0,61 (E. coli) és 0,80 (P. fluorescens) (3. ábra).

4. Megbeszélés

Míg a mézelő méh defenzinről kimutatták, hogy csak a gram-pozitív baktériumokra hat (Fujiwara et al., 1990), a 10-HDA gátolja mind a gram-negatív, mind a gram-pozitív baktériumokat, de csak viszonylag magas koncentrációban (minimális gátló koncentráció: 0,5–2) mg/ml gram-pozitív; gram-negatív baktériumok esetén nincs meghatározva) (Blum és mtsai, 1959; Garcia és mtsai, 2013; Yousefi és mtsai, 2012). Így a 2–10% RJ vízkivonatokban található viszonylag alacsony 10 ‐ HDA mennyiség (0,05–0,23 mg 10 ‐ HDA/ml) nem járul hozzá az antibiotikum hatásához ebben a vizsgálatban. Az MRJP1 jelentősen gátolni kezdi mindkét gram-típusú baktérium növekedését 60 μg/ml koncentráció mellett. Ez a koncentráció körülbelül 580-szor alacsonyabb, mint az MRJP1 koncentrációja a tiszta RJ-ben, mivel az átlagos fehérjetartalom 11,71%, az MRJP1 pedig 30% (

35 mg MRJP1/g RJ) (Pavel és mtsai, 2014; Schmitzová és mtsai, 1998).

Eredményeink azonban ellentétesek két másik jelentéssel, amelyek nem mutattak ki az MRJP1 antibakteriális hatását (Bucekova & Majtan, 2016; Feng et al., 2015). Bucekova és Majtan valóban az MRJP1 antibiotikus hatását tesztelték 47,5 μg/ml koncentrációig, jóval a kísérleteink során talált minimális 60 μg/ml gátló koncentráció alatt. Sajnos Feng et al. (2015) nem határoz meg MRJP1 koncentrációt. Ezenkívül mindkét tanulmány csak 18 vagy 24 órás inkubálás után számol be a végpontmérésekről (Bucekova & Majtan, 2016; Feng és mtsai, 2015), nem teszi lehetővé az időbeli növekedési dinamika elemzését. A 24/72 órás növekedési görbéket követve megmutatjuk, hogy az 500 μg/ml MRJP1 hozzáadása valóban lassítja a E. faecalis, B. pumilus, E. coli, és P. fluorescens a növekedési görbék meredekségének csökkentésével, de a végpont mérésekkel nem. Csak azok a baktériumok, amelyek normál közegben már gyenge növekedést mutattak (P. alvei, B. laterosporus és M. plutonius) nem kezdett növekedni 500 μg/ml MRJP1 jelenlétében a mért időtartam alatt.

Brudzynski és Sjaarda (2015) és Brudzynski et al. (2015) az MRJP1 antibakteriális hatását tapasztalta minimális gátló koncentrációval 5 és 33 μg/ml között, végpontmérésekkel. Ezekben a vizsgálatokban azonban a fehérjéket Concanavilin A affinitáskromatográfiával izolálták a mézből, amely nem tiszta MRJP1-hez vezet, hanem a glikozilezett fehérjék izolálásához. Az SDS ‐ PA gélek az MRJP1 mellett számos sávot mutattak (Brudzynski & Sjaarda, 2015). Ezért egyetértünk ezekkel a szerzőkkel abban, hogy a mézben lévő további fehérjék aktivitása hozzájárulhatott az antimikrobiális tulajdonságokhoz. Például az MRJP1 C-terminálisából származó rövid antimikrobiális peptidek (jelleinek) kimutatták, hogy alacsony koncentrációban (2,5–30 μg/ml) antibiotikumként működnek (Fontana és mtsai, 2004).

Tekintettel az RJ-ben található antibakteriális anyagok sokféleségére, lehetetlennek tűnhet, hogy a baktériumok egyáltalán provokálhatnak betegségeket RJ jelenlétében. Az RJ azonban nem mindig egyenlő és biztosan nem mindig elegendő mennyiségben kerül forgalomba. Ban ben M. plutonius‐fertőzött telepek, a legtöbb lárva elpusztul, ha a lárvák ápolóinak aránya megnő, és a táplálék-kocsonya mennyisége elégtelenné válik a fertőzött lárvák számára (Bailey, 1983). Így az EFB-fertőzés csak akkor okozhat lárvahalált, ha a kapott ételzselé mennyisége szokatlanul alacsony. A lárvák alultápláltsága és az antibakteriális anyagok alulreprezentációja egyaránt lehetővé teheti M. plutonius sejtek a bélben, hogy elérjék a kritikus mennyiséget, ami lárva pusztulást okoz.

Köszönetnyilvánítás

Köszönetet mondunk Silvio Erlernek az EFB törzsek biztosításáért és a kézirat első változatának eredményes megbeszéléséért. Hálásak vagyunk Robin M. Crewe-nak a nyelv szerkesztéséért.

Finanszírozási információk

Ezt a projektet a Német Kutatási Alapítvány (Deutsche Forschungsgemeinschaft - DFG, MO 373/32-1 támogatás az RFAM-nak) és egy ERASMUS + programcseretámogatás támogatta a TVV számára. A szponzoroknak nem volt szerepük a tanulmány tervezésében; az adatok gyűjtésében, elemzésében és értelmezésében; a jelentés megírásában és a cikk közzétételre történő benyújtásának határozatában.

Érdekkonfliktus

Kérjük, vegye figyelembe: A kiadó nem felelős a szerzők által szolgáltatott bármilyen kiegészítő információ tartalmáért vagy működéséért. Bármilyen kérdést (a hiányzó tartalom kivételével) a cikk megfelelő szerzőjéhez kell irányítani.