FGDF motívumokat tartalmazó vírusos és sejtes fehérjék megkötik a G3BP-t a stresszgranulátum-képződés blokkolásához

Mikrobiológiai, Daganat- és Sejtbiológiai Osztály, Karolinska Institutet, Stockholm, Svédország

fgdf

Affiation Science for Life laboratórium, Orvostudományi Kar, Solna, Karolinska Institutet, Stockholm, Svédország

Mikrobiológiai, Daganat- és Sejtbiológiai Osztály, Karolinska Institutet, Stockholm, Svédország

Affiation Science for Life laboratórium, Orvostudományi Kar, Solna, Karolinska Institutet, Stockholm, Svédország

A reumatológia, az immunológia és az allergia tagsági osztálya, Brigham and Women's Hospital, Boston, Massachusetts, Amerikai Egyesült Államok

Partneri tudomány az életért laboratórium, Orvostudományi Kar, Solna, Karolinska Institutet, Stockholm, Svédország

Mikrobiológiai, Daganat- és Sejtbiológiai Osztály, Karolinska Institutet, Stockholm, Svédország

  • Marc D. Panas,
  • Tim Schulte,
  • Bastian Thaa,
  • Tatiana Sandalova,
  • Nancy Kedersha,
  • Adnane Achour,
  • Gerald M. McInerney

Ábrák

Absztrakt

A Ras-GAP SH3 domént kötő fehérjék (G3BP) alapvető szabályozói a stresszgranulák (SG), a fehérjék citoszolos aggregátumainak és az RNS-nek a képződésében, amelyek sejtes stressz, például vírusfertőzés hatására indukálódnak. Számos vírus, köztük a Semliki Forest vírus (SFV), a G3BP megcélzásával blokkolja az SG indukcióját. Ebben a munkában bemutatjuk, hogy az SFV nsP3 G3BP-kötő motívuma két FGDF motívumból áll, amelyekben mind a fenilalanin, mind a glicin maradék elengedhetetlen a kötéshez. Ezenkívül megmutatjuk, hogy az USP10 sejtes G3BP-kötő partner kötését egy FGDF motívum is közvetíti. A wt USP10 túlexpressziója, de nem olyan mutáns, amelyből hiányzik az FGDF-motívum, blokkolja az SG összeállítást. Továbbá azonosítottuk az FGDF által közvetített G3BP kötőhelyet a herpes simplex vírus (HSV) fehérje ICP8-ban, és megmutattuk, hogy az ICP8 G3BP-hez való kötődése szintén gátolja az SG képződését, ami a HSV ICP8 új funkciója. Bemutatjuk egy FGDF-tartalmú peptidhez kötött G3BP háromdimenziós szerkezetének modelljét, amely valószínűleg sok fehérje által a G3BP megcélzásához kapcsolódó kötési módot képvisel.

Szerző összefoglalása

A stresszgranulátum (SG) a fehérjék és a transzlációval elhallgattatott mRNS dinamikus aggregátuma, amely a sejtekben különféle stresszhelyzetek, például vírusfertőzés során képződik. Úgy gondolják, hogy az SG vírusellenes, és sok vírus ellenintézkedést fejlesztett ki kialakulásuk megakadályozása érdekében, gyakran megcélozva az esszenciális SG fehérjét, a G3BP-t. Itt megmutatjuk, hogy számos, egyébként nem rokon vírusos és sejtes fehérje mind megköti a G3BP-t az FGDF szekvencia motívummal, és ezáltal elnyomja az SG képződést: az óvilág alfavírusának Semliki Forest vírusának nem strukturális fehérje 3 (nsP3) (a kialakulóban lévő, magas patogenitású Chikungunya vírus); a herpes simplex vírus ICP8 fehérje; és ezen felül az USP10 sejtfehérje (SG komponens és protein deubikvitináz, amely stabilizálja például a p53 tumorszuppresszort). Ebben a munkában bemutatjuk és validáljuk az FGDF-et tartalmazó peptidhez kötött G3BP háromdimenziós szerkezetének modelljét is. Az FGDF által közvetített G3BP kötődés vonzó célpontot jelent a különböző vírusfertőzések számos terápiás beavatkozása során, és szabályozhatja az USP10 p53-stabilizáló funkcióját rákos megbetegedésekben is.

Idézet: Panas MD, Schulte T, Thaa B, Sandalova T, Kedersha N, Achour A és mtsai. (2015) FGDF motívumokat tartalmazó vírusos és sejtes fehérjék megkötik a G3BP-t a stresszgranulátum-képződés blokkolásához. PLoS Pathog 11 (2): e1004659. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1004659

Szerkesztő: Mark T. Heise, Észak-Karolinai Egyetem, Chapel Hill, EGYESÜLT ÁLLAMOK

Fogadott: 2014. szeptember 20 .; Elfogadott: 2015. január 6 .; Közzétett: 2015. február 6

Adatok elérhetősége: Minden releváns adat megtalálható a dokumentumban és a kiegészítő információkat tartalmazó fájlokban.

Finanszírozás: Ezt a kutatást Cancerfonden (Svéd Rákellenes Társaság) projekt-támogatás (CF 2012/789) támogatta a GMM számára. A finanszírozóknak nem volt szerepük a tanulmányok tervezésében, adatgyűjtésben és elemzésben, a közzétételre vonatkozó döntésben vagy a kézirat elkészítésében.

Versenyző érdeklődési körök: A szerzők kijelentették, hogy nincsenek versengő érdekek.

Bevezetés

Az SG-ket számos vírusfertőzés indukálja, és a vírusok számos ellenintézkedést fejlesztettek ki, amelyek gyakran a G3BP-t célozták meg [18]. A poli-vírusfertőzésben az SG összeszerelést a Q325 és G326 maradékok közötti G3BP hasítása gátolja az NTF2-szerű és RRM doméneket elválasztó 3C vírusos proteáz [19] segítségével, és összetételesen elkülönülő SG-k képződéséhez vezet, amelyekből hiányzik a G3BP [20]. Egyes vírusok esetében a G3BP a vírusfehérje felhalmozódásának gócaiba kerül, és fontos lehet a vírus életciklusának hatékony befejezéséhez. A vaccinia vírussal (VV) fertőzött sejtekben a G3BP toborozódik a citoplazmatikus vírusgyárakba [21]. Ugyanakkor arról is beszámoltak, hogy vírusellenes szerepet játszik a VV fertőzésben [22]. Hasonlóképpen, a G3BP szerepet játszik a hepatitis C vírus (HCV) replikációs komplexének potenciális összetevőjeként [23], és fontos szerepet játszhat a vírus összeállításában [24]. Mi és mások kimutattuk, hogy a G3BP NTF2-szerű domént közvetlenül összekötik az L/ITFGDFD ismétlődő motívumok az Óvilág alfavírusainak nem strukturális fehérje (nsP) 3 C-terminusaiban, beleértve a Semliki Forest vírust (SFV) és a chikungunya vírus (CHIKV) [25–28]. A G3BP későbbi szekvenálása a vírusfehérje-akkumuláció gócaiba a fertőzött sejteket képessé teszi az SG-k összeállítására, annak ellenére, hogy tartósan magas az eIF2α foszforiláció szintje [28,29].

Ebben a munkában a G3BP-kötő motívum jellemzőinek pontos meghatározását tűztük ki célul az Óvilág nsP3 alfavírusában. Megállapítottuk, hogy a magmegkötési motívum két fenilalanin-csoportból áll, amelyeket elválaszt egy glicin és egy aszpartát-csoport (FGDF). E maradékok bármelyikének mutációja megakadályozta a G3BP-1 vagy a G3BP-2 kötődését. FGDF motívumokat is találunk az USP10 N-terminálisánál és a herpes simplex vírus (HSV) -1 protein ICP8 C-terminálisánál, és megerősítettük, hogy ezek a motívumok hasonlóan kötik a G3BP-t és blokkolják az SG indukcióját. Végül elkészítettük a G3BP/FGDF peptid kölcsönhatás molekuláris modelljét, és hely-irányú mutagenezissel validáltuk a modellt. Ezek az eredmények feltárják azt a mechanizmust, amellyel legalább két patogén vírus megcélozza a G3BP-t. Ezenkívül molekuláris alapot nyújtanak az USP10 aktivitás szabályozásához a gátló USP10/G3BP komplex összeállításával.

Eredmények

Az SFV nsP3-ban lévő G3BP-kötő domén az FGDF magmegkötő motívumát tartalmazza

(A) pEGFP-C1, pEGFP-nsP3-31-wt, -T2A, -F3A, -G4A, -D5A, -F6A vagy -D7A C-terminális szekvenciák. Az alaninmutációk félkövéren vannak feltüntetve. (B) A BHK sejteket áltranszfektáltuk (M) vagy transzfektáltuk pEGFP-nsP3-31-wt, -T2A, -F3A, -G4A, -D5A, -F6A vagy -D7A vagy pEGFP-C1. A sejtlizátumokat 16 órával a transzfekció után készítettük, és anti-GFP vagy G3BP-1 antiszérummal immunprecipitáltuk, SDS – PAGE-vel elválasztottuk és nitrocellulózra vittük át. Az összes lizátum és IP blotját vizsgáltuk G3BP-1, GFP vagy aktin esetében.

Az SFV-F3A nem választja el a G3BP-t, erősebb SG-választ vált ki és gyengül a szövetkultúrában

(A) A BHK sejteket MOI 10-nél SFV-wt vagy SFV-F3A-val fertőztük meg. 8 hpi-nél sejtlizátumokat készítettünk, és G3BP-1 antiszérummal immunprecipitáltuk, és SDS – PAGE-vel elválasztottuk őket. A lizátumokat és IP-ket vizsgáltuk az nsP3, G3BP-1 vagy aktin szempontjából. (B) A MEF-sejteket SFV-wt vagy SFV-F3A-val fertőztük MOI 1-nél. 8 hpi-nél sejteket rögzítettünk, és nsP3-ra (zöld), G3BP-1-re (piros) és TIA-1-re (kék) festettünk. Rúd 20 μm. (C) A MEF-sejteket gúnyosan megfertőztük vagy megfertőztük SFV-wt vagy SFV-F3A-val 50 MOI-n 7 órán át, 1 órás Pat A-val (100 nM) történő kezelés vagy álkezelés előtt. A sejteket fixáltuk és festettük a G3BP-1, TIA-1 és nsP3-ra. Kezelésenként ötven sejtet SG + értékként vagy nem G3BP-1 és TIA-1 kolokalizáció alapján értékeltünk. Az adatokat öt független kísérlet átlagának ± SD-ként adjuk meg. Nyitott rudak, gúnyos kezeléssel; zárt oszlopok, Pat A. Párosítatlan tanuló t-tesztje, ** p 3. ábra. Az USP10 konzervált FGDF motívumon keresztül köti a G3BP-t.

Ezután biofizikai in vitro mérésekkel igyekeztünk megerősíteni az nsP3: G3BP 2: 1 sztöchiometriáját. Izotermális titráló kalorimetriát (ITC) alkalmaztunk az affinitás, a sztöchiometria és a termodinamikai aláírás közötti kölcsönhatásra az emberi G3BP-1 tisztított NTF2-szerű doménje, E. coli-ban expresszálva (G3BP-NTF2), és a peptideket átfogó 449 maradékok között –473 SFV nsP3 (nsP3-25), amely két FGDF motívumot tartalmaz. Az nsP3-25 injekciója egy G3BP-NTF2 fehérje oldatba koncentrációfüggő exoterm hőváltozásokat eredményezett (4C. Ábra, felső panel). Az integrált hőváltozások megkötő izotermáját egyszerű, egy az egyhez kötődési modell alkalmazásával illesztettük, 7 nM affinitási értéket, valamint 2,4 G3BP kötőhelyet eredményezve nsP3-25 peptidmolekulánként (4C. Ábra, alsó panel). Ez azt jelzi, hogy egy peptid hatékonyan megköti két G3BP molekulát. Az interakciós affinitás 16-szor erősebb volt, mint a korábban meghatározott, 115 μM-os affinitásérték egy hasonló G3BP-NTF2 fragmens és egy DSGFSFGSK peptid közötti kölcsönhatás esetén [33]. Egy kontroll peptid injekciója, amelyben mindkét FGDF motívumot AGDA-ra cserélték (nsP3-25-mut), csak az injekcióval kapcsolatos hőingadozásokat eredményezett a kiindulási szinten (4D. Ábra).

Két G3BP molekula kapcsolódását minden nsP3-25 peptidhez analitikus méretkizárásos kromatográfiás (SEC) elemzéssel is alátámasztottuk. A kristályszerkezetek és a SEC elemzés alapján ismert, hogy a patkány és az emberi G3BP NTF2-szerű doménjei homo-dimereket képeznek [33]. Önmagában a G3BP-NTF2-et 30 kDa látszólagos molekulatömeggel eluálták, kissé alacsonyabbak a dimer számított molekulatömegénél (36 kDa), míg a G3BP előzetes inkubálása az nsP3-25 peptid tízszeres moláris feleslegével elmozdította a eluálási csúcs, amely megfelel egy 60 kDa komplex képződésének (4E. ábra). Figyelembe véve az ITC-ből származó G3BP-NTF2: nsP3-25 kölcsönhatás 2: 1 arányát (4C. Ábra), azt javasoljuk, hogy a kialakult 60 kDa komplex négy G3BP-NTF2 molekulát (két dimer) és két nsP3- 25 peptid. Nem volt bizonyíték magasabb rendű oligomerekre.

Az FGDF motívum glicin-maradéka lehetővé teszi mindkét fenilalanin-maradék megfelelő elhelyezkedését egy hidrofób barázdában a G3BP NTF2-szerű doménon belül

A G3BP-1 apo formájú és a nukleoporin (Nup) -eredetű DSGFSFGSK peptiddel komplexált NTF2-szerű doménjének kristályszerkezeteit nemrégiben határozták meg [33], feltárva, hogy a ligandum hosszú konformációban kiterjedt konformációban kötődik és mély barázda a G3BP felületén (S6A ábra). A peptidkötő hely amfipatikus; míg a horony alapja erősen hidrofób, a fehérje hasadékát borító mindkét fal és a pozitív töltésű N-terminális poláros, több bázikus maradékkal (R32, K5, K123). A peptid mindkét fenilalanin-maradéka a hidrofób barázdán belül jól körülhatárolható zsebek felé nyúlik ki. Míg a Nup-eredetű peptid F4 maradékának oldallánca egy mély zsebbe van temetve, amelyet az F15, F33 és F124 G3BP-1 maradványok alkotnak, az F6 maradék oldallánca a G3BP-1 által alkotott sekélyebb zsebben helyezkedik el. F124, V11 és L10 maradékok [33].

(A) G3BP-NTF2 (PDB ID: 4FCM) modellezett LTFGDFDE peptiddel (sárga pálcikák). A fehérjét az elektrosztatikus potenciál szerint színezett felületként mutatjuk be (piros: savas, kék: bázikus). (B) A peptid és a G3BP-NTF2 kölcsönhatásának részletei. A G3BP-NTF2 a rajzfilm ábrán látható. Az N-terminális 11 aminosavakat, valamint a peptidkötő hornyot szegélyező számos maradékot szürke pálcikákként jelenítjük meg. Az LTFGDFDE peptid sárga pálcikákként jelenik meg, a peptid aminosavmaradékok vörös színnel és vastag betűvel vannak jelölve. A szövegben említett G3BP-1 maradványok fekete színnel vannak jelölve.

Helyre irányított mutagenezis a G3BP FGDF peptidkötő hasadékában

(A) A G3BP-F33W mutáns (felső panel) és a G3BP-F124W mutáns (alsó panel) sematikus ábrázolása a modellezett LTFGDFDE peptiddel. Az LTFGDFDE peptid pálcikákban jelenik meg sárga szénatomokkal. A mutált triptofán maradványok bíborvörös színnel vannak feltüntetve. (B) A HEK293T sejteket áltranszfektáltuk vagy együtt transzfektáltuk pEBB/PP-SFV-nsP3 (pnsP3) és pEGFP-C1, pEGFP-G3BP-wt, -F33W vagy -F124W elemekkel. A sejtlizátumokat 24 órával a transzfekció után készítettük, anti-GFP-vel immunprecipitáltuk és SDS – PAGE-vel elválasztottuk. A lizátumokat és az IP-ket sztreptavidin-HRP (nsP3), GFP vagy aktin alkalmazásával vizsgáltuk. (C) A HEK293T sejteket áltranszfektáltuk vagy transzfektáltuk pEGFP-C1, pEGFP-G3BP-wt, -F33W vagy -F124W alkalmazásával. A sejtlizátumokat 24 órával a transzfekció után készítettük, GFP antiszérummal immunprecipitáltuk és SDS – PAGE-vel elválasztottuk. Lizátumokat és IP-ket vizsgáltunk az USP10, GFP vagy aktin szempontjából. (D) A G3BP1-Δ1–11 sematikus ábrázolása a modellezett LTFGDFDE peptiddel. Az LTFGDFDE peptid pálcikákban jelenik meg sárga szénatomokkal. (E) A HEK293T sejteket áltranszfektáltuk vagy transzfektáltuk pEGFP-C1, pEGFP-G3BP1-wt vagy -Δ1-11. A sejtlizátumokat 24 órával a transzfekció után készítettük, és anti-GFP-vel immunprecipitáltuk, és SDS – PAGE-vel elválasztottuk őket. Lizátumokat és IP-ket vizsgáltunk az USP10, GFP vagy aktin szempontjából.

A G3BP szélső N-terminálisa (1–11. Aminosavak) a hidrofób zseb nagy részét képezi az F6 peptidmaradék elhelyezéséhez, és tartalmaz egy lizinmaradékot (K5), amely esetleg kölcsönhatásba lép a savas maradékok negatív töltéseivel a FGDF motívum. A modell azt jósolja, hogy a G3BP csonka változata (Δ1–11) nem lesz képes megkötni a peptidet (6D. Ábra). Ennek értékeléséhez 293T sejteket transzfektáltunk pEGFP-C1, pEGFP-G3BP-wt vagy pEGFP-G3BP-∆1–11, és immunprecipitációval analizáltunk anti-GFP-vel és immunoblotolással az USP10, GFP vagy aktin esetében (6E ábra). Az endogén USP10 az EGFP-G3BP-wt-vel koprecipitálódott, az EGFP-G3BP-∆1-11-kel nem. Összességében a 6. ábra eredményei erősen alátámasztják a G3BP/FGDF komplex strukturális modelljét.

A HSV-1 ICP8-ban található FGDF motívum megköti a G3BP-t és gátolja az SG-ket