Gélelektroforézis

A gélelektroforézist leggyakrabban olyan fehérjék és nukleinsavak elválasztására és tisztítására használják, amelyek mérete, töltése vagy konformációja különbözik.

sciencedirect

Kapcsolódó kifejezések:

  • Enzim
  • Fehérje
  • Fenotípus
  • Mutáció
  • DNS
  • RNS
  • Polimeráz láncreakció
  • Allele

Letöltés PDF formátumban

Erről az oldalról

Gélelektroforézis

Absztrakt

Az elektroforézis olyan technika, amely lehetővé teszi a töltött molekulák szétválasztását és elemzését egy elektromos mezőben. A gélelektroforézist leggyakrabban olyan fehérjék és nukleinsavak szétválasztására és tisztítására használják, amelyek méretükben, töltésükben vagy konformációjukban különböznek. A gél poliakrilamidból vagy agarózból áll. Az agaróz alkalmas néhány száz bázispártól körülbelül 20 kb nagyságú DNS-fragmensek szétválasztására. A poliakrilamid előnyös a fehérjék és a kisebb DNS-fragmensek esetében. A DNS mobilitása meghatározott elektroforetikus körülmények között állandó. Ezeket a körülményeket az elektromos paraméterek (áram és feszültség) és olyan tényezők jellemzik, mint a puffer összetétele, az agaróz koncentrációja és a hőmérséklet.

Az RNS szerkezetének, kölcsönhatásainak és hajtogatásának biofizikai, kémiai és funkcionális próbái: A. rész

Durga M. Chadalavada, Philip C. Bevilacqua, in Methods in Enzymology, 2009

A gélelektroforézis a nukleinsav-biokémiában mindenütt jelen lévő elválasztási technika. A denaturáló gélelektroforézis a nukleinsavakat a hossz alapján választja el, míg a natív gélelektroforézis a forma és a hosszúság alapján különíti el a nukleinsavakat. A hőmérséklet-gradiens gélelektroforézis (TGGE), amelyben a hőmérsékleti gradiens jelen van a gélen, egyesíti a denaturáló és a natív gélelektroforézis előnyeit azáltal, hogy alacsony hőmérsékleten natív gélszerű tulajdonságokkal rendelkezik, és magas hőmérsékleten denaturáló gélszerű tulajdonságokkal rendelkezik. Itt írjuk le a merőleges és párhuzamos TGGE technikáit és azok néhány alkalmazását. A kombinatorikus könyvtárakból a stabil és instabil RNS és DNS szekvenciákat a TGGE-SELEX segítségével izoláljuk, míg az RNS harmadlagos motívumának termodinamikai jellemzését merőleges TGGE-olvadásokkal végezzük. A módszerek szemléltetésére konkrét példákat választanak az irodalomból. A TGGE hatékony biofizikai megközelítést kínál az RNS és a DNS elemzéséhez, amely kiegészíti a hagyományos módszereket.

ELEKTROFORÉZIS | Fehérjék

Fizikokémiai jellemzés

Glikánok elemzése; Poliszacharid funkcionális tulajdonságai

2.12.2.3 Kapilláris gél elektroforézis

A kapilláris gélelektroforézis (CGE) a födém-gél elektroforézis CE-változata, és biológiai makromolekulák, például oligonukleotidok, DNS-fragmensek és fehérjék méretalapú elválasztására szolgál. A CGE-ben térhálós vagy nem térhálós szitálási mátrixokat alkalmazunk. A térhálósított gélek meghatározott pórusszerkezettel és -mérettel rendelkeznek. A lineáris polimer hálózatok által létrehozott, nem térhálósított fizikai gélek dinamikus pórusszerkezettel rendelkeznek, és a térhálósított gélekhez képest sokkal nagyobb rugalmassággal rendelkeznek. Az elválasztást úgy hajtjuk végre, hogy a kapilláris szitáló mátrixszal, például térhálósított poliakrilamiddal vagy lineáris polietilénglikol és hidroxi-metil-cellulóz oldatokkal töltjük meg. A CGE fő előnye a lemez-gél elektroforézissel szemben a gélmátrix anyagok szélesebb körének használata, online detektálás, továbbfejlesztett mennyiségi meghatározás és automatizálás.

Novotny csoportja lineáris poliszacharidok elemzéséről számolt be, amelyek redukáló végeit fluoreszcensen 8-amino-pirén-1,3,6-triszulfonáttal (APTS) jelölték, LPA-val bevont kapillárisok és LIF detektálás alkalmazásával. Sikerült a hialuronsav oligomerjeinek kiindulási felbontása a 390 polimerizációs fokig (80 kDa molekulatömeg) 5% LPA alkalmazásával 12,5 mM Tris pufferben (pH 3,0). 34 Kakehi-csoport beszámolt az (α2-8) -kötéses N-acetil-neuraminsav és a hialuronsav polimerjeinek finom felbontásáról 0,1 M Tris – 0,25 M borát (pH 8,5) felhasználásával, 70% polietilénglikolt 10% koncentrációban. 35 Az elválasztási körülmények optimalizálása során azt tapasztalták, hogy az ilyen poliszacharidok kicsi oligomerjei nagyobb oligomerként viselkedtek, és a későbbi vándorlási időkben megfigyelhetők voltak, és megvitatták az oligomerek molekulamérete és biológiai aktivitása közötti kapcsolatot.

KADMIUM

Gélelektroforézis lézeres ablációval a fehérjék kadmiumspecifikációjára

A gélelektroforézis jól ismert elválasztási technika komplex közegekben, például fehérjékben. A klasszikus detektálási módok (beleértve a festékfestést, az antiszérummal végzett immunreakciót és az autoradiográfiát) azonban nem teszik lehetővé a fém-fehérje komplexek kimutatását. A kémiai specifikációval összefüggésben egy új kötőjeles technika, a lézeres abláció, az induktívan kapcsolt plazma tömegspektrometria (LA – ICP-MS), gélelektroforézissel kombinálva, a fehérjék fémkomplexációs vizsgálatainak feltörekvő és hatékony eszközeként jelenik meg, amely többelemes információkat ad a korábban elválasztott metalloproteinekhez kötött fémekről.

Miután a fehérje elválasztása egy- vagy kétdimenziós elektroforézissel történt, a géleket megszárítottuk, és közvetlenül LA – ICP-MS-nek vetettük alá a fémeloszlás detektálása, feltérképezése és mennyiségi meghatározása céljából az egyes foltokban (vegyületek). Röviden, a minta egy foltját a lézer ablálja, és az ablatált gócot folyamatos gázáram, általában argon juttatja a plazmába. Ezután az ICP-MS megadja az ablált helyen található fehérje multielemes összetételét. Erről a módszerről már beszámoltak a baktériumkivonatokból származó MT-k és más Cd-kötő fehérjék Cd-speciációjáról. A Cd-stressz körülmények között tenyésztett sejtekből származó gélek fémfehérje-mintázatai nagyon gyorsan összehasonlíthatók a nem stresszes tenyészetekkel az MT-k fémek általi indukciójának vizsgálatához.

Elektroforetikus megközelítések a mintagyűjtéshez és a nukleinsavak elemzéséhez való előkészítéshez

Absztrakt:

A gélelektroforézis évtizedek óta szerves része a molekuláris biológiai laboratóriumoknak, hasznosnak találta a nukleinsavak elemzésében, szétválasztásában, molekuláris tervezésében és tisztításában. Tovább finomítják, és a kialakulóban lévő technológiák lehetővé teszik a gélben lévő DNS és RNS finom szabályozását. Ezen technológiák egyike, a SCODAphoresis, még kiválóbb elválasztást biztosít a szokásos inhibitoroktól, például a talaj huminsavaktól, lehetővé téve a DNS kivonását és elemzését a korábban kivonhatatlan mintamátrixokból. A nukleinsavak elektroforetikus mintaválasztása továbbra is fontos része lesz a minta-válasz munkafolyamatnak, tisztább analitokat biztosítva a downstream vizsgálatokhoz, például a klinikai diagnosztikához, a polimeráz láncreakcióhoz (PCR) és a szekvenáláshoz.

Molekuláris biológia és géntechnika

A DNS szétválasztása

A gélelektroforézis technikái méret szerint különítik el a DNS-molekulákat. Kis, pórusméretű, 43-45 számú poliakrilamid-gélt használnak egyszálú, 500 nukleotidnál rövidebb (10–500 nukleotid méretű tartományban lévő) DNS-fragmensek szétválasztására, amelyek méretükben alig különböznek egyetlen nukleotidtól. Közepes pórusméretű agarózgélt használnak a kétszálú DNS-molekula frakcionálására (300 és 10 000 nukleotidpár közötti tartományban). A poliakrilamid-gélben és az agaróz-gél elektroforézisben lévő DNS-sávok láthatatlanok, hacsak a DNS-t etidium-bromiddal nem festik, vagy a 32P radioizotóppal jelölik az elektroforézis elvégzése előtt. Az agarózgél-elektroforézis egyik változata, az impulzus-mező agaróz-gélelektroforézis, rendkívül hosszú DNS-molekulákat választ el. Ezt a technikát alkalmazták 16 különböző Saccharomyces cerevisiae kromoszóma szétválasztására, amelyek nagysága 220 000 és 2,5 millió nukleotidpár között változik.

Elválasztási módszerek

4.2 Kapilláris gél elektroforézis

A kapilláris gél elektroforézis [55, 56] (CGE) nagyon hasonló a CZE-hez. A fő különbség az, hogy a CGE-ben az oszlop géllel van töltve, ami befolyásolja az analitok mozgását. Ennek megfelelően az elválasztást nemcsak az ionokra ható elektroforetikus erő, hanem az analit molekulák mérete is meghatározza. Az oszlop belsejében jelenlévő gél hatása hasonló hatású, mint a méretkizárásos kromatográfia (lásd korábban). Tipikus alkalmazás a fehérjék elválasztása egy kapillárisban, amelyet poliakrilamid-gél és nátrium-dodecil-szulfát (SDS) tölt meg. Az SDS jelenléte elősegíti a fehérjék elektroforetikus mobilitását, mivel méretükkel arányosan bevonja a felületüket. Következésképpen a molekulaszerkezet kevéssé befolyásolja a mobilitást, ezért a makromolekulák molekuláris tömegüknek megfelelően vándorolnak. Ez a technika nagyon hasonlít az SDS-PAGE-hoz.

Sejtkárosodás, sejtos válaszok a sérülésre és a sejtek halála

Sejt nekrózis

A nekrózis a sejthalál egy olyan formája, amely általában számos összefüggő parenchimasejt pusztulását eredményezi, és egy egész szövetet vagy szervet érinthet. Az érelzáródás következtében kialakuló iszkémiás nekrózis a klinikailag leggyakrabban előforduló nekrózis. Az iszkémiás nekrózis általában a koagulációs (koagulatív) nekrózis morfológiai mintázatát eredményezi. Koagulatív nekrózis esetén a sejtek nem mennek át egy energiától függő, hangszerelt folyamaton, amely sejtdarabot eredményez. Inkább az energia kimerülése az iongradiensek lebontását eredményezi a sejtmembránokon, ami kezdetben nátrium és víz beáramlását (sejtduzzanat) okozza, és végül azt eredményezi, hogy a kalcium a sejt citoplazmájába kerül a külső környezetből és a mitokondriumból (amelyben oxidatív foszforiláció történik). hipoxia miatt megszűnt). Ezek a változások gyorsan visszafordíthatatlan sérüléshez vezethetnek a magas metabolikus igényű sejtekben, míg más sejttípusok jobban ellenállnak az iszkémiás károsodásoknak. A szövetekkel szembeni nagyobb metabolikus igények (magas replikációs ráta, esszenciális kontraktilis funkció) hajlamosak felgyorsítani a sejtkárosodást és elősegíteni a nekrózist.

Egyes nekrotikus sejtekben a mag összezsugorodhat (piknózis), mielőtt eltűnik (kariolízis). A nekrózis egyes formáiban a karilízis piknózis nélkül történik. A nekrózis mindig markáns akut gyulladással jár (szemben az apoptózissal), és túlnyomórészt neutrofil infiltrátumot vált ki. A gyulladásos sejtekből származó lebontó enzimek megemésztik a nekrotikus szövetet, és előkészítik a gyógyulás vagy helyreállítás helyét (1-22. Ábra). A felesleges gyulladásos sejtenzimek jelenléte további vagy eltúlzott szövetpusztuláshoz vezethet, amely nagyobb, mint az eredeti sértés.

Gélelektroforézis

A gélelektroforézis olyan analitikai technika, amely lehetővé teszi a DNS és más makromolekulák méretbeli elválasztását.

A gélelektroforézishez egy DNS-mintát töltünk a gélmátrix (általában agaróz vagy akrilamid) egyik végébe, amely egyenletes pórusméretet biztosít, amelyen keresztül a DNS-molekulák mozoghatnak. Állandó elektromos tér alkalmazása a DNS-fragmensek (mindegyiknek egyenletes, erős negatív töltéssel rendelkezik) vándorlását eredményezi a katód felé. Ahogy haladnak a gélen, a hosszabb fragmensek késleltetettebbek, mint a rövidebbek, és migrációs sebességük arányos a DNS-fragmens hosszának logaritmusával. Ez a kapcsolat a DNS-méretek egy tartományán belül fennáll, és hasznos elválasztás érhető el néhány nukleotid hosszúságú, legfeljebb 25 000 nukleotidig terjedő DNS-fragmensei számára, különböző koncentrációjú gélek felhasználásával.

A molekulatömeg-standardok biztosítják a gél kalibrálását és a molekulatömeg becslését.

A nagyobb DNS-molekulákat impulzusmezővel végzett elektroforézissel lehet elválasztani, amely különböző elválasztási elveket alkalmaz.