Glükokortikoid és étrendi hatás a nyálkahártya mikrobiotájára kutya gyulladásos bélbetegségében

Szerepek Adatkúra, formális elemzés, vizsgálat, módszertan, vizualizáció

nyálkahártya

Állategészségügyi Klinikai Tudományok Tanszéke, Állatorvostudományi Főiskola, Iowa Állami Egyetem, Ames, Iowa, Amerikai Egyesült Államok

Szerepek Adatkúra, formális elemzés, vizsgálat, módszertan, írás - áttekintés és szerkesztés

Bio- és állatorvos-tudományi iskola, Camerino Egyetem, Macerata, Olaszország

Szerepek Adatmegőrzés, vizsgálat

Állatorvosi Klinikai Tudományok Tanszéke, Állatorvosi Főiskola, Iowa Állami Egyetem, Ames, Iowa, Amerikai Egyesült Államok

Iowa Állami Egyetem, Állatorvos-tudományi Főiskola, Orvosbiológiai Tudományok Tanszék, Ames, Iowa, Amerikai Egyesült Államok

Állategészségügyi diagnosztikai és tenyészállat-egészségügyi osztály, Állatorvosi Főiskola, Iowa Állami Egyetem, Ames, Iowa, Amerikai Egyesült Államok

Szerepek Adatkúra, formális elemzés

Állategészségügyi Patológiai Tagozat, Állatorvostudományi Főiskola, Iowa Állami Egyetem, Ames, Iowa, Amerikai Egyesült Államok

Állategészségügyi diagnosztikai és tenyészállat-egészségügyi osztály, Állatorvosi Főiskola, Iowa Állami Egyetem, Ames, Iowa, Amerikai Egyesült Államok

Szerepek írása - áttekintés és szerkesztés

Állatorvosi Klinikai Tudományok Tanszéke, Állatorvosi Főiskola, Iowa Állami Egyetem, Ames, Iowa, Amerikai Egyesült Államok

Szerepek ellenőrzése, megjelenítés, írás - áttekintés és szerkesztés

Iowa Állami Egyetem, Állatorvos-tudományi Főiskola, Orvosbiológiai Tudományok Tanszék, Ames, Iowa, Amerikai Egyesült Államok

Szerepek konceptualizálás, adatkezelés, hivatalos elemzés, finanszírozás megszerzése, vizsgálat, módszertan, projekt adminisztráció, felügyelet, írás - eredeti tervezet, írás - áttekintés és szerkesztés

Állatorvosi Klinikai Tudományok Tanszéke, Állatorvosi Főiskola, Iowa Állami Egyetem, Ames, Iowa, Amerikai Egyesült Államok

  • Todd Atherly,
  • Giacomo Rossi,
  • Robin White,
  • Yeon-Jung Seo,
  • Chong Wang,
  • Mark Ackermann,
  • Mary Breuer,
  • Karin Allenspach,
  • Jonathan P. Mochel,
  • Albert E. Jergens
  • Cikk
  • Szerzői
  • Metrikák
  • Hozzászólások
  • Média közvetítés
  • Peer Review

Ábrák

Absztrakt

Fluoreszcencia in situ hibridizáció (FISH)

A formalinnal rögzített ileális és vastagbél bélbiopsziás mintákat (3 μM vastag szövetrészeket) üveglapokra szereltük, és a FISH értékelte az előzőkben leírtak szerint. xilolon (3x10 perc), 100% alkoholon (2x5 perc), 95% etanolon (5 perc) és végül 70% etanolon (5 perc) keresztül. Ezután a tárgylemezeket ionmentes vízben szállítottuk a DNS-vizsgálati laboratóriumba, ahol a hibridizáció előtt levegőn szárítottuk. A Cy-3-mal vagy a FITC-vel (Life Sciences) jelölt FISH 5-szondákat DNS-mentes vízzel rekonstruáltuk, és 5 ng/μl munkakoncentrációra hígítottuk (1. táblázat).

Az Eub338 FITC-jelölt próbát alkalmaztuk a teljes baktériumszámhoz. Más elemzésekhez a Bifidobacteriumokat, a Faecalibacteriumokat, az Enterobacteriaceae-kat, a Lactobacillusokat és a Streptococcusokat megcélzó specifikus próbákat Cy-3-mal jelöltük, és az Eub338-FITC univerzális bakteriális próbával egyidejűleg alkalmaztuk. Ezt a próbacsoportot választottuk ki a specifikus baktériumcsoportok és az egyes baktériumfajok azonosítására, amelyek korábban relevánsnak bizonyultak a kutya IBD patogenezisében. [8, 9] A szöveti metszeteket 30 μl DNS-próba keverékben fürdettük hibridizációs kamrában. 54 ° C éjszakán át (12 óra). A mosást mosópufferrel (SDS nélküli hibridizációs puffer) végeztük, a tárgylemezeket steril vízzel öblítettük, majd levegőn száradtuk, és SlowFade Gold rögzítőközeggel (Life Technologies, Carlsbad, CA) és 25X25-1 fedőüveggel szereltük fel. (Fisher Scientific, Pittsburgh, Pennsylvania).

A próba-specifitást kísérleti vizsgálatokban erősítették meg a nem releváns nem-Eub338-FITC és Eub338-Cy-3 próbák kombinálásával, valamint a Bifidobacteria, Fecalibacteria, Enterobacteriaceae, Lactobacilli és Streptococci tiszta izolátumokkal végzett hibridizációs kísérletekkel a nem szelektív hibridizáció szűrésére.

A bélnyálkahártya baktériumok mennyiségi meghatározása

A bélbaktériumokat FISH és 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) festéssel tettük láthatóvá 60x Plan Apo olaj objektív alkalmazásával, opcionálisan 1,5x szorzó lencsével együtt Eclipse TE2000-E fluoreszcens mikroszkópon (Nikon Instruments Inc., Melville NY) és a MetaMorph szoftver (Nashville, TN) által vezérelt CoolSnap EZ kamerával (Photometrics, Tuscon, AZ) fényképezett. A kvantifikációt csak akkor hajtották végre, amikor a hibridizációs jelek erősek voltak, és morfológiailag egyértelműen megkülönböztethették az intakt baktériumokat akár 2-színű (univerzális és baktérium-specifikus FISH-próba), akár 3-színű (FISH-próbák és DAPI-festés) azonosítással.

Kutyánként legalább 4 különböző endoszkópos biopsziás mintát (2 ileális és 2 emelkedő és/vagy transzverz vastagbél biopsziát) értékeltek nyálkahártya baktériumtartalmuk szempontjából. A FISH analízishez szükséges bélszöveteket (az ileum és a vastagbél endoszkópos biopsziáit) üveglemezeken egyesítettük, hogy egyetlen kezelő könnyebben hibridizálódhasson és következetes legyen az értelmezés. Ily módon egyetlen tárgylemez tartalmazna mind ileális, mind vastagbél szöveteket (mindegyik szövet 3-5 mintája), amelyekben a kezelő különálló endoszkópos mintákban 10 egyedi baktériumszámlálást végezne. Míg a mennyiségi analízis érdekében gondot fordítottak az ileális versus vastagbél nyálkahártya-minták pontos megkülönböztetésére, e szövetek közötti egyértelmű megkülönböztetést nem mindig sikerült meghatározni. Ezért a nyálkahártya baktériumok számát minden állatnál rögzítettük a baktériumok kumulatív összmennyiségeként, amelyeket az ilealis/vastagbél bélszegmensekben észleltünk, a korábban leírtak szerint. [19]

A baktériumok mennyiségi meghatározását 10 reprezentatív mező/kutya esetében végleges megfigyelt nagyítással 600x vagy 900x végeztük. A tíz mezőbe 4 jól körülhatárolható nyálkahártya-rekeszben található baktériumok tartoztak: (1) a nyálkahártyán belüli baktériumok, (2) a felszíni hámhoz kötődő baktériumok, (3) a tapadó nyálkában elhelyezkedő baktériumok és (4) a szabadon található baktériumok nyálka.

Statisztikai analízis

A beiratkozott IBD kutyák mintaméretét a prospektív klinikai vizsgálatra szánt idő diktálta. Ebben az időszakban más kutyákon (n = 6) diagnosztizálták az IBD-t, de nem vették fel őket a tájékoztatott ügyfél beleegyezésének elmaradása vagy az ügyfelek képtelenek betartani a specifikus kezelési ajánlásokat.

A kontrollcsoport (egészséges kutyák) nyálkahártya baktériumait összehasonlítottuk a betegség csoportjával (IBD-s kutyák) a Wilcoxon rang-összeg (vagy Mann-Whitney) tesztek alkalmazásával. A baktériumok számának különbségeit a pre- és poszt-prednizon kezelés között Wilcoxon Sign-Rank teszt segítségével értékeltük. A TJP-ket expresszáló sejtek számának elemzéséhez Wilcoxon rangösszegű és párosított kétmintás t-teszteket végeztek, hogy statisztikailag szignifikáns különbségeket vizsgáljanak egészséges kutyák és IBD-s kutyák között a kezelés előtt, valamint a kezelés előtti és utáni számlálások között az IBD-ben. kutyák, ill. Az adatelemzéseket R statisztikai szoftver (3.5.2 verzió; The R Foundation for Statistical Computing, Bécs, Ausztria) segítségével végeztük. P-értékek 2. táblázat. A vizsgálati állatok klinikai jellemzői.

Egészséges és beteg kutyák nyálkahártyához kapcsolódó mikrobiotája a szabad és tapadó nyálkákban volt a legnagyobb (3. és 4. táblázat; S1 és S2 táblázat). A Bifidobacterium spp., A Faecalibacterium spp., A Lactobacillus spp., Az Enterobacteriaceae és a Streptococcus spp. Elleni próbákkal hibridizált baktériumok szubpopulációi. Nem volt szignifikáns különbség a különféle baktériumfajok számában és térbeli eloszlásában a nyálkahártyán belül (azaz a felületi hámhoz tapadva vagy a szövetekben belül invazív) sem HC-kutyák, sem IBD-s kutyák esetében. Hasonlóképpen, az Eub338-pozitív baktériumok teljes száma nem különbözött szignifikánsan az IBD-ben szenvedő kutyák diagnosztizálásakor vagy az orvosi kezelést követően, összehasonlítva a HC kutyákkal. Csak a Lactobacillusok növekedtek (

8-szoros, P 1. ábra. A háromszínű FISH prednizon és diétás terápiát követően azonosítja a nyálkahártya baktériumokat az IBD-s kutyák tapadó nyálka rekeszében.

Panelek A-C = ilealis szövetek és panelek D-F = vastagbél szövetek. A panel = Cy3-Faecali698 szonda; B panel = Cy3-Ebac szonda; C panel = Cy3-Strc493 szonda; D panel = Cy3-Bif164 szonda; E panel = Cy3-Ebac; F panel = FITC-Eub338 szonda. Az összes többi baktérium, amely kizárólag az univerzális szondával hibridizálódik, zöldnek tűnik. A DAPI-val festett bélnyálkahártya serlegsejtekkel kéknek tűnik. Minden kép 600-szoros nagyítással.

Különbségek (P 3. táblázat. Összes baktérium a FISH-on keresztül (az összes nyálkahártya-részen).

Az ileális és vastagbél AJP-k festési intenzitása és expressziós eloszlása ​​hasonló volt a korábbi vizsgálatokhoz. [16, 19] Az összes apikális junction fehérje IHC jelölése a hevesejtek apikális részén volt a legintenzívebb mind ilealis, mind vastagbél biopsziákban (3. ábra). . A megnövekedett AJP occludin expresszióban különbségeket figyeltek meg a bél hámgát fehérjéiben (

Ötszörös, P 3. ábra. AJP-k immunohisztokémiai expressziója IBD-s kutyák vastagbélbiopsziáiban prednizon és diétás terápia után.

A fehérje expresszióját a sejtszám és az AJP-k festési intenzitása alapján határoztuk meg a nyálkahártyán. Bal oldali panel = Claudin-2; középső panel = E-kadherin; jobb oldali panel = occludin. A kutya kohorszok AJP összehasonlítását lásd a 3. táblázatban.

Vita

Hidrolizált táplálékkal és orális prednizonnal kezelt IBD-s kutyák nyálkahártya mikrobiotáját remisszió indukciója céljából hosszanti irányban vizsgáltuk a FISH alkalmazásával. Ez a tanulmány egyedülálló, mert összehasonlítja a HC-kutyák nyálkahártyájának mikroflóráját az IBD-kutyák nyálkahártya-baktérium-populációival az étrend és a GC beadása előtt és után. Megállapítottuk, hogy az IBD-ben szenvedő kutyáknál a HC-kutyákhoz képest megnövekedett a Lactobacillusok száma. A nyálkahártya baktériumok összetételének és térbeli eloszlásának változását figyelték meg IBD kutyákban a GC után és az étrendi kezelés során, több Bifidobacterium spp., Faecalibacterium spp. és Streptococcus spp. a tapadó nyálka rekeszben található. A különböző epitheliális AJP-k nyálkahártya-expressziója az occludin és az E-cadherin megnövekedett szintje mellett változott, de az IBD-kutyák bélbiopsziájában prednizont és diétás terápiát követően csökkent zonulinszintet figyeltek meg.

Rengeteg klinikai bizonyíték utal a bél mikrobiota változásaira az IBD patogenezisében. [4, 6] A humán IBD betegek jellemző összetételi változásai közé tartozik a csökkent mikrobiális sokféleség és a feltételezett káros baktériumcsoportok (Enterobacteriaceae, beleértve az Escherichia coli) számának növekedése. [E. coli] és Fusobacterium spp.) A védőfajok, például a Lachnospiraceae, a Bifidobacterium spp., A Roseburia és a Faecalibacterium prausnitzii csökkenésével kombinálva. [5, 20, 21] Nagyon kevés adat ismerteti a kísérő állatok mikrobiomját a legtöbb adat a széklet elemzéséből származik. A jelentett mikrobiális elmozdulások kutyákban betegség körülményei között szerepel a Fusobacteria, Bacteroidetes és Clostridiales alacsonyabb mennyisége, de a duodenális citohúzásokban és a duodenális biopsziás mintákban nagyobb a proteinobaktériumok száma. [7, 22] Külön tanulmányokban a FISH technikák azonosították az invazív E. colit granulomatous colitisben szenvedő kutyák vastagbélbiopsziáiban [23, 24] és megnövekedett nyálkahártyával társult Enterobacteriaceae (E. coli) limfocita-plazmacytikus enterocolitisben szenvedő kutyák ileum/vastagbél biopsziáiban [9, 19].

A diétára és az antimikrobiális beavatkozásokra nem reagáló kutya krónikus enteropathiát idiopátiás IBD-nek nevezik, amelyet a nyálkahártya gyulladását mutató bélbiopsziás eredmények is megerősítenek. Ezekben az esetekben a kezeléshez általában immunszuppresszív gyógyszerek szükségesek, a legtöbb kezelési sémában gyakran alkalmaznak szisztémás GC-ket. [12] Külön randomizált, kontrollált vizsgálatok erős bizonyítékokkal szolgálnak az orális GC-k (pl. Prednizon, prednizolon és budezonid) indukciós terápiájaként IBD-ben szenvedő kutyák számára. [11, 25] Még más tanulmányok egy fokozatos megközelítést javasolnak, amely először prednizont használ, majd további szükség esetén immunszuppresszív szerek nem reagáló és súlyos klinikai betegségben szenvedő betegek számára. [26] Hasonló stratégiát alkalmaznak a humán IBD-ben is, ahol a szisztémás GC-ket első vonalbeli terápiaként alkalmazzák enyhe-közepesen súlyos Crohn-féle ileitis/colitis és súlyos ulceratív colitis remissziójának kiváltására. [27, 28]

Még további vizsgálatok értékelték a glükokortikoidok szerepét a krónikus enterocolitis bél mikrobiotájának átalakításában. Genetikailag fogékony colitis egérmodell alkalmazásával a dexametazon krónikus (28 napos) beadása kimutatta, hogy megváltoztatja a széklet mikrobiota összetételét (azaz megnövekedett Bifidobacterium spp. És Lactobacillus spp.), És elősegíti a Mucispirillum spp., A bél mikrobájának jelentős hiányát. a mucinra támaszkodva. [33] Egy kis, prospektív, randomizált klinikai vizsgálatban 19 aktív CD-vel újonnan diagnosztizált gyermeket kezeltek enterális táplálékkal (EN) vagy kortikoszteroidokkal (CS) a remisszió kiváltása érdekében. Míg mind az EN, mind a CS a klinikai remissziót indukálta a 8 hetes folyamatos kezelés után, az EN-vel kezelt betegeknél a széklet mikrobiota összetétele megváltozott a Ruminococcus baktériumok nagyobb arányában (a Clostridium spp-hez tartozó baktériumok nagyobb arányban), mint a CS-kezelt kohorsz. [34]

Egyetlen vizsgálatban a bélnyálkahártya mikrobiotáját értékelték idiopátiás IBD-ben vagy ételre reagáló hasmenésben (FRD) szenvedő kutyákban a kezelés előtt és után. [35] A duodenum és a vastagbél endoszkópos biopsziáját 24 kutyától (15 FRD, 9 IBD) nyertük, és ezeket a bakteriális 16S rRNS gén Illumina szekvenálásával értékeltük. Az IBD-ben szenvedő kutyákat eliminációs étrenddel és prednizolonnal (1 mg/kg naponta kétszer) kezelték 14 napig. Az eredmények nem mutattak ki szignifikáns különbségeket az IBD-vel rendelkező kutyák fajgazdagságában az FRD-vel szemben. A kezelés mikrobiota-összetételre gyakorolt ​​hatásának összehasonlításakor az FRD-vel rendelkező kutyák duodenumát Enterococcus spp., Corynebacterium spp. és a Proteobacteriumok előkezelése, míg a Bacteroides spp. az IBD kutyák vastagbélében a kezelés után bőségesen volt.

A FISH felhasználásával nyert eredményeink megerősítették a kiválasztott nyálkahártya baktériumok (azaz az összes baktérium és a jelen vizsgálatban használt 5 különböző oligonukleotid szonda által megcélzott baktériumok szubpopulációinak) térbeli eloszlásában bekövetkezett jelentős változásokat IBD-s és HC-kutyákban, valamint IBD-ben prednizont és diétás kezelést kapó kutyák. Ezek az adatok azt igazolják, hogy az IBD-ben szenvedő kutyáknak beadott glükokortikoidok megváltoztatják a nyálkahártya mikrobiota (azaz a megnövekedett Bifidobacteriumok, Faecalibacteriumok és Streptococcusok) eloszlását és összetételét az ileális és vastagbél szövetek tapadó nyálkájában, amelyek hozzájárulhatnak a remisszió kiváltásához. Jelentésünkhöz képest a mások által végzett korábbi kutyatanulmány legfőbb korlátai a következők: i) egészséges kontroll kutyacsoport hiánya; ii) a klinikai remisszió és a kezelési csoport válaszainak kritériumok leírásának elmulasztása a mikrobiális összetétel változásához viszonyítva; iii) az ilealis biopsziák elmaradása a mikrobiális kompozíciós elemzéshez, és iv) a 16S rRNS génszekvenálás alkalmazása, amely azonosíthatja a közösség sokféleségének széles elmozdulásait, de a mikrobiális közösség szerkezetéről nem ad információt, mint a FISH elemzés.

Nyilvánvaló, hogy a bélbaktériumok diszbiózisa az IBD egyik oka és következménye. Mivel az antibiotikumok és a probiotikumok csak szerény hatással vannak az IBD-ben szenvedő betegek kezelésére [4], sok klinikus ma már felülről lefelé terápiás megközelítést választ, biológiai és/vagy immunszuppresszív gyógyszerek, például glükokortikoidok alkalmazásával a klinikai remisszió kiváltására [26, 36, 37 ]. Csak néhány tanulmány bizonyítja, hogy a GC-k (vagy bármely más immunszuppresszív gyógyszer) kedvező hatást fejthetnek ki az IBD-ben érintett egyének székletmikrobiomjában (azaz megnövekedett Clostridia, Bifidobacteriumok és Lactobacillusok). Nincsenek olyan tanulmányok (a jelen jelentésen túl), amelyek leírnák, hogyan vagy miért változtatják meg a GC-k szelektíven a nyálkahártya mikrobiotáját az IBD-ben. Az is lehetséges, hogy a bél mikrobiómájának egyéb összetevőit (azaz gombákat és vírusokat) befolyásolja a GC beadása, és hozzájárulnak a rezidens baktériumok populációinak jó modulációjához, amint ez a tanulmány megfigyelhető. [4]