Gyors tesztkészletek hús- és baromfitermék-szűréshez

LABORATÓRIUM

Gyors tesztkészletek hús- és baromfitermék-szűréshez
Az élelmiszer-eredetű baktériumok kimutatására szolgáló hagyományos mikrobiális módszerektől eltérően, amelyek tenyésztési közegben történő szaporodást, izolálást és biokémiai azonosítást alkalmaznak, a gyorsteszt készleteket úgy tervezték, hogy gyorsabbá, kényelmesebbé, érzékenyebbé és specifikusabbá tegyék a mikroorganizmusok detektálását és azonosítását.

Egyes gyors tesztkészletek biokémiai technikákat alkalmaznak a kimutatáshoz, de ma már sok antitest- és DNS-alapú teszt. Kevés kivételtől eltekintve az összes, az élelmiszerekben előforduló specifikus kórokozók kimutatására használt vizsgálat az elemzés előtt bizonyos növekedést igényel egy dúsító közegben. E készletek többsége eldobható eszközből áll, amely táptalajt vagy szubsztrátumokat tartalmaz, amelyeket kifejezetten egy baktériumcsoport vagy faj azonosítására terveztek. Néhány készlet kivételével, ahol az eredmények 4 óra alatt olvashatók, a legtöbb 18–24 órás inkubálást igényel.

Az Food and Drug Administration szerint az élelmiszer-eredetű kórokozók kimutatására szolgáló DNS-alapú vizsgálati formátumok szondákat, polimeráz láncreakciót (PCR) és bakteriofágokat használnak. A próbavizsgálatok megcélozzák a riboszomális RNS-t (rRNS), mivel a nagyobb mennyiségű bakteriális rRNS amplifikált célt szolgáltat és nagyobb érzékenységet ad a vizsgálatnak. A PCR-vizsgálat a DNS vagy primerek rövid fragmenseit használja, amelyeket egy meghatározott szekvenciához hibridizálnak, majd ezt termociklus segítségével enzimatikusan amplifikálják. A PCR segítségével a DNS egyetlen példánya milliószor, több órán belül amplifikálható, csökkentve a kulturális dúsítás szükségességét. Az ételmintákban található inhibitorok azonban megakadályozhatják a primerek megkötését és csökkenthetik az amplifikációs hatékonyságot, így az élelmiszer-tesztek során a tiszta tenyészetek PCR-jével elérhető extrém érzékenység gyakran csökken. Ezért az elemzés előtt még szükség van bizonyos kulturális gazdagításra. Egy fág és a bakteriális gazdaszervezet kölcsönhatását az élelmiszer-eredetű kórokozók vizsgálatainak kidolgozására is alkalmazták.

A gyorstesztek másik csoportja az antitest antigénhez való kötődésén alapul. Az FDA szerint ezek alkotják az élelmiszer-tesztelés során alkalmazott gyors módszerek legnagyobb csoportját. Az antitestvizsgálatokban sokféle formátumot alkalmaznak, beleértve a latex agglutinációt; a latex agglutináció módosítása, amelyet fordított passzív latex agglutinációnak neveznek; immundiffúzió; az enzimhez kapcsolt immunszorbens vizsgálat (ELISA); és az immunmágneses szétválasztás (IMS) technológiája.

Az ELISA a legelterjedtebb antitest-vizsgálati forma, amelyet az élelmiszerek kórokozóinak kimutatására használnak. Ebben a formátumban, amelyet általában „szendvics” vizsgálatként terveznek, egy szilárd mátrixhoz kötött antitestet használnak az antigén megkötésére a dúsító kultúrákból, és egy második enzimhez konjugált antitestet használnak a detektálásra. A mikrotiterlemezekben lévő kutak fala a leggyakrabban használt szilárd hordozó; de az ELISA-kat mérőpálcák, lapátok, membránok, pipetták vagy más szilárd mátrixok felhasználásával is tervezték.

Az IMS-ben mágneses részecskékhez vagy gyöngyökhöz kapcsolt antitesteket alkalmaznak a kórokozók meggátolására az elődúsító közegből. Az IMS analóg a szelektív dúsítással, de antibiotikumok vagy kemény reagensek használata helyett, amelyek stresszkárosodást okozhatnak, antitestet használnak az antigén megkötésére - ez sokkal enyhébb alternatíva. A befogott antigéneket széleszthetjük vagy további vizsgálatokkal tesztelhetjük.

Az immunprecipitáció vagy az immunokromatográfia egy másik antitestalapú vizsgálat, amely az otthoni terhességi tesztek számára kifejlesztett technológián alapul. Ez szintén „szendvicses” eljárás, de az enzimkonjugátumok helyett a detektáló antitest színes latex gyöngyökhöz vagy kolloid aranyhoz kapcsolódik. Csak 0,1 ml-es alikvotot használva a dúsítási mintát kamrák sorozatára vetjük át az eredmények elérése érdekében. Ezek a vizsgálatok rendkívül egyszerűek, nem igényelnek mosást vagy manipulációt, és a kulturális dúsítást követően 10 percen belül befejeződnek.

A DNS- és antitestalapú tesztek mellett számos más teszt is létezik, a speciális közegektől kezdve a hagyományos vizsgálatok egyszerű módosításáig, amelyek munka, idő és anyagok megtakarítását eredményezik. Egyesek például dehidratált közeget tartalmazó eldobható kartonokat használnak, ami kiküszöböli az agarlemezek szükségességét, ami megtakarítást jelent a tárolási, inkubációs és ártalmatlanítási eljárásokban. Mások speciális kromogén és fluorogén szubsztrátumokat építenek a táptalajba, hogy gyorsan kimutassák a tulajdonság enzimatikus aktivitását. Vannak olyan vizsgálatok is, amelyek mérik a bakteriális adenozin-trifoszfátot (ATP), amelyek (bár nem azonosítanak konkrét fajokat) felhasználhatók az összes baktérium jelenlétének gyors felszámolására.

Szabályozási aggályok
2000-ben az Egyesült Államok Mezőgazdasági Minisztériumának Élelmiszer-biztonsági és Ellenőrzési Szolgálata (FSIS) befejezte a kórokozók csökkentésére/veszélyelemzésére és a kritikus ellenőrzési pontokra (HACCP) vonatkozó szabályának végrehajtását, amelyet a Szövetségi Nyilvántartás Az előírások szerint minden hús- és baromfitelepnek ki kell dolgoznia és végre kell hajtania egy írásos tervet a higiéniai feladatok ellátására, valamint ki kell dolgoznia és végre kell hajtania egy HACCP-tervet, amely szisztematikusan kezeli a termékeivel kapcsolatos összes jelentős veszélyt. Ezenkívül minden vágóüzemnek rendszeresen tesztelnie kell a generikus anyagokat Escherichia coli hogy ellenőrizzék a székletfertőzés megelőzésére és csökkentésére vonatkozó eljárásaikat. A vágóhidak nyers termékei, valamint a húst és baromfit őrlő üzemek alá tartoznak Salmonella az FSIS által végzett tesztelés. Ezek az erőfeszítések a mikrobiális szennyeződés időbeli csökkentésére irányulnak.

2002 novemberében az FSIS a csökkentésről szóló irányelvet hajtott végre Listeria monocytogenes fogyasztásra kész hús- és baromfitermékekben. Az irányelv utasításokat tartalmaz az FSIS mintavételi és ellenőrzési lépéseiről annak biztosítására, hogy az üzem HACCP-tervei és a higiénés szabványos működési eljárások (SSOP) hatékonyan ellenőrizzék a L. monocytogenes fogyasztásra kész termékekben. Az FSIS elkezdte fogyasztásra kész termékek tesztelését L. monocytogenes 1987-ben, mert ez az egyetlen törzse Listeria ami következetesen összefügg az emberi betegséggel. Ugyanakkor az FSIS módosította mikrobiológiai vizsgálati programjának egyes szakaszait is E. coli O157: H7. Az FSIS-irányelv szakaszai, amelyek mentesítenek egyes vágóüzemeket az FSIS véletlenszerű alkalmazása alól E. coli O157: A H7 tesztelés megszűnik. Minden őrölt marhahús-növény az FSIS véletlenszerű ellenőrzési tesztprogram részévé válik.

Alkalmazások és előlegek
A gyorsteszt-készleteket minőség-ellenőrzési programokkal való használatra tervezték, hogy sok élelmiszer-mintát szűrjenek egy adott kórokozó vagy toxin jelenlétére. Az FDA szerint azonban Bakteriológiai elemzési kézikönyv (www.cfsan.fda.gov/

ebam/bam-toc.html), a gyors módszerrel kapott pozitív eredmény csak feltételezhetőnek tekinthető, és azt standard módszerekkel kell megerősíteni. A pozitív eredmény megerősítése több nappal meghosszabbíthatja az elemzést. A szűrővizsgálat azt mutatja, hogy egy minta potenciálisan pozitív-e egy kórokozóra. Ha egy minta negatív eredményt mutat, további elemzést nem végeznek. Ha a szűrővizsgálat potenciálisan pozitív eredményt mutat, további vizsgálatokat végeznek a szűrési eredmények megerősítésére.

A legtöbb gyors módszer néhány perc vagy néhány óra alatt elvégezhető, így gyorsabb, mint a hagyományos módszerek. Az élelmiszer-elemzés során azonban a gyors módszerek még mindig nem rendelkeznek elegendő érzékenységgel és specifitással a közvetlen teszteléshez, ezért az ételeket még elemzés előtt kultúrával kell gazdagítani. Noha a dúsítás korlátozza a vizsgálat sebességét, lényeges előnyökkel jár, például hígítja az inhibitorok hatását, lehetővé teszi az életképes és nem életképes sejtek megkülönböztetését, és lehetővé teszi a táplálék során esetlegesen előforduló sejtstressz vagy sérülés kijavítását. feldolgozás.

Számos vállalat kínál új termékeket a hús- és baromfivizsgálati területen.

• A BioControl, a Bellevue, Wash. Bemutatta az EHEC8 ™ rendszert, amely a E. coli O157: H7, amely a vállalat szerint a nyers marhahús teljes vizsgálati idejét 24 óráról kevesebbre, mint 9 órára csökkenti. Az új dúsítást azért fejlesztették ki, hogy segítsék a marhahúsfeldolgozókat az új FSIS irányelv betartásában E. coli O157: A marhahústermékek H7-szennyezése. Az új táptalaj jelentős előrelépés, mert a dúsítási időt az egyéb módszerekkel megkövetelt 16–24 óráról 9 órára rövidebbre rövidíti. Ez lehetővé teszi a termék legfeljebb két nappal korábban történő kiadását.

A rendszer egyetlen 8 órás dúsítást tartalmaz, a BioControl saját EHEC8 táptalajának felhasználásával, vagy a VIP® for EHEC tesztet, vagy az Assurance® EHEC EIA-t. Amellett, hogy a termék gyorsabban kerül piacra, az EHEC8 rendszer az AOAC hivatalos módszere az észlelésre E. coli O157: H7 nyers és főtt marhahúsban. A vállalat szerint az EHEC8 rendszert független laboratóriumok alaposan tesztelték és validálták az Egyesült Államokban és Kanadában kormányzati, valamint magánipart képviselő 30 laboratórium között végzett együttműködési tanulmány során. Az eredmények azt mutatták, hogy az EHEC8 táptalaj, vagy VIP-vel EHEC-hez, vagy Assurance EHEC EIA-hoz, egyenértékű volt az USDA/BAM referencia-tenyésztési eljárással.

A nyers vagy főtt marhahús EHEC8 rendszere gyors, rugalmas rendszer, amely egylépéses dúsításával és rövid átfutási idejével növeli a termelékenységet. A rendszer teljes, és nem szükséges drága antibiotikum vagy adalékanyag, ami nagyon költséghatékony.

• A Neogen Corp., Lansing, Mich., Kínálja Gene-Trak-ját Listeria monocytogenes Próba. A DNS-hibridizációs teszt alkalmaz L. monocytogenes- specifikus DNS-szondák és kolorimetriás detektálórendszer e faj kimutatására élelmiszer- és környezeti mintákban a húsleves tenyészet dúsítását követően. A minta negatívnak tekinthető a L. monocytogenes ha a kapott abszorbanciaérték kisebb vagy egyenlő a vizsgálat megállapított határértékével. A minta feltételezhetően pozitívnak tekinthető, ha a kapott abszorbanciaérték nagyobb, mint a vizsgálat megállapított határértéke.

A Neogen a Reveal® tesztet is kínálja E. coli O157: H7. A teszt állítólag lehetővé teszi a kórokozók mintáinak átvizsgálását, akár 8 órás mintadúsítás után is. A vizsgálat elvégzéséhez a dúsítási tenyészet 120 ml-es részét a vizsgálati eszköz kerek mintavevő nyílásába helyezzük, és egy specifikus antitesteket (anti-E. coli O157: H7) kolloid aranyrészecskékhez konjugálva. Ha antigének vannak jelen a mintában, azok kötődnek az arannyal konjugált antitestekhez. Ez az antigén-antitest komplexum elhagyja a reagens zónát, és átjut a nitrocellulóz membránon, amely anti-E zónát tartalmaz. coli O157: H7 antitest. Az arany-konjugátummal rendelkező immunkomplexum megragadódik és összegyűlik ebben a zónában, így látható vonal jelenik meg. Ez egy AOAC hivatalos módszer, amelyet az FSIS használ.

Qualicon Div. A DuPont (Wilmington, Del.) cég a BAX® rendszert kínálja fel a fogyasztásra kész termékek szűrésére L. monocytogenes. A szűrővizsgálat PCR-t használ a DNS amplifikálására. Ha egy mintában kórokozó van, a rendszer lemásolja a kórokozó DNS-ét, és elegendő DNS-t termel a kimutatáshoz. Ha amplifikáció történik, a mintát tovább elemezzük. Ha nem történik amplifikáció, akkor a mintán nem végeznek további vizsgálatokat. A vizsgálati eredmények megszerzéséhez szükséges idő lerövidítése és az analitikai minőség megőrzése érdekében folyamatban lévő értékelési eljárások részeként az FSIS 2002 áprilisában elfogadta ezt a tesztet a hús- és baromfiminták szűrésére. L. monocytogenes. Az ügynökség a rendszer értékelését tervezi Salmonella és E. coli O157: H7 mindhárom helyszíni laboratóriumában használható.

Következő generációs
Az FDA szerint a gyors tesztek összetett formátuma és az élelmiszerek tesztelésének nehézségei miatt a felhasználóknak körültekintően kell eljárniuk a gyors módszerek kiválasztásakor, és alaposan ki kell értékelniük ezeket a teszteket. A technológia tovább fejlődik, és a következő generációs vizsgálatok, például bioszenzorok és DNS-chipek, amelyek potenciálisan képesek az élelmiszerekben található több kórokozó közel valós idejű és on-line ellenőrzésére.

JAMES GIESE
Internet Editor