Kitinázok a baktériumoktól az emberig: tulajdonságok, alkalmazások és jövőbeli perspektívák

1 Élettudományi és Biotechnológiai Kar, Dél-ázsiai Egyetem, New Delhi 110021, India

Absztrakt

A kitin a cellulóz után a természetben a második leggazdagabb poliszacharid, számos gomba sejtfalában, rovarok exoskeletonjában és rákfélék héjában található. A kitin a baktériumos kitinázok jelenléte miatt a felhalmozódása ellenére sem halmozódik fel a környezetben. Ezek az enzimek képesek lebontani a gombák sejtfalakban jelenlévő kitint, valamint a rovarok exoskeletonjait. Megmutatták, hogy potenciális ágensek lehetnek a különféle patogén gombák és rovarkártevők által okozott növénybetegségek biológiai védekezésében, és így a kémiai növényvédő szerek alternatívájaként használhatók. Folyamatosan nőtt a kitinszármazékok iránti kereslet, amelyet kitinázok hatására kaptak kitinpolimerre különféle ipari, klinikai és gyógyszerészeti célokra. Ezért ez az áttekintés a kitinázok tulajdonságaira és alkalmazására összpontosít, kezdve a baktériumoktól, majd gombáktól, rovaroktól, növényektől és gerincesektől. A kitináz tervezése irányított laboratóriumi evolúció és racionális megközelítések alkalmazásával a jobb katalitikus aktivitás érdekében a költséghatékony terepi alkalmazásokban is.

1. Bemutatkozás

2. A kitin szerkezete és funkciói

A kitin elsősorban az exoskeleton kialakulásában segít, mint az ízeltlábúakban és egyes gombafajokban; ezenkívül számos faj kitinje sok fehérjéhez kapcsolódik, amelyek meghatározzák, hogy az exoskeleton merev, puha vagy rugalmas lesz-e. Nem fehérje részekkel, például kalcium-karbonáttal is társul, amely a garnélarákban, a rákban és a homárban alkotja a szerkezetet. A kitin és kapcsolódó anyagai kiterjedt alkalmazással rendelkeznek a gyógyszerszállítás területén: sebgyógyítás, élelmi rost és szennyvízkezelés [6]. A kitin védő előnyöket nyújt azáltal, hogy ízeltlábúakban és gombákban exoskeletont képez.

3. A kitinázok osztályozása és katalitikus mechanizmusa

A különböző organizmusokból származó kitinázok aminosav-hasonlósága alapján öt osztályba sorolták őket, és a glikozil-hidrolázok 18., 19. és 20. családjába sorolták [11]. A 18. család vírusok, baktériumok, gombák, állatok és bizonyos növényi kitinázok kitinázait tartalmazza. Számos konzervált aminosav ismétlésből és egy 8 szál párhuzamos enzimmagból áll β lapokat, létrehozva egy hordót lefelé α hélixek, amelyek viszont gyűrűt képeznek kifelé (2. ábra) [12]. A 19. családba néhány növényi kitináz és Streptomyces kitinázok [13]. A 18. és 19. család nem osztja az aminosav-szekvenciákat, és teljesen más a 3D-s felépítésük, ezért állítólag különböző ősöktől fejlődtek ki. A 20. családba baktériumok, bizonyos gombák és emberek N-acetil-glükózaminidázai tartoznak.

4. A kitinázok szerepe különböző organizmusokban

Főként az organizmusoknak három különböző célra van szükségük ezekre a kitinolitikus enzimekre. a) az organizmusok kemény kitinréteggel rendelkeznek, és a fejlődési fázisokban kitinázok expresszálódnak, hogy elősegítsék exoskeletonjuk átalakítását, a test méretének és alakjának fenntartása és támogatása érdekében. b) Azok a szervezetek, amelyek más kitintartalmú szervezeteket fogyasztanak tápanyagforrásként, expresszálják a kitinázokat, hogy az oldhatatlan kitinpolimert felszívódó metabolitokká emésztsék, ami energiát ad. (c) A kitinnel bevont mikroorganizmusok által fertőzésre hajlamos szervezetek kitinázokat fejeznek ki, hogy lebontják a fertőző kórokozók védőpajzsát, ezáltal immunitást biztosítva. A kitinázok baktériumok, gombák, rovarok, növények és gerincesek különböző formáit és specifikus funkcióit az alábbiakban ismertetjük átfogó értékelés céljából.

4.1. Baktériumok

A baktériumok elsősorban kitinázokat termelnek annak érdekében, hogy nitrogént és szenet tápláljanak tápanyagok vagy prekurzorok és parazitizmus forrásaként [14, 15]. Ezeket a kitin lebontására és energiaforrásként történő felhasználására használják [16]. A kitinázok fontos szerepet játszanak a baktériumok patogenezisében, ahol a gazda kitint tartalmaz [17]. Serratia marcescens, az egyik legjobban vizsgált kitinolitikus baktériumról számoltak be, hogy főként négyféle kitinázt termelnek: ChiA, ChiB, ChiC és CBP21 (kitint kötő fehérje). Mindhárom kitináz a glikozil-hidrolázok 18. családjába tartozik (β/α) 8 TIM-hordós katalitikus domén, hozzávetőlegesen hat cukor-alhelyzettel [18]. A ChiA-nak és a ChiB-nek multimoduláris szervezete van, vagyis van egy N-terminális kitinmegkötő modulja, amelynek fibronektin-szerű hajtása van a ChiA-ban, vagy egy C-terminális CBM5 modul. A kitinázokban található CBM modulok távoli kapcsolatban állnak egymással, és a konzervált exponált triptofán maradványok jelenléte jellemzi őket, amelyek kölcsönhatásba lépnek a szubsztráttal [19]. Ennek a doménnek a jelenléte növeli a szubsztrát kötődési affinitását, valamint a kitin hidrolízisének hatékonyságát, különösen a kitin kristályosabb formáinak esetében [20].

4.2. Gombák

Az entomopatogén gombák fő szerepet játszhatnak biovezérlő szerként a rovarok és kártevők elleni védekezésben. A kitinázok túlexpresszálása és módosítása ezekben a gombákban növelte hatékonyságukat biokontroll-szerként [27]. A kitinázt termelő fonálféreg-parazita gombákat biokontroll-szerként alkalmazzák növényi és állati fertőző fonálférgek petéinek és lárváinak megcélzásával [28]. A kitináz és a kitint kötő fehérjék szintén alkalmazhatók invazív gombás fertőzés kimutatására immunszuppresszált betegeknél [29].

A gomba sejtfalához kapcsolódó kitinázok szerepet játszanak a fonalas gombák sporulációjában. Ezt kimitináz inhibitorok, demetilallozamidin és alloszamidin alkalmazásával mutatták ki, ami gátolja a hifák fragmentációjának arthroconidiumokká való gátlását. Trichoderma a különböző kitinolitikus gombák között talajon átterjedő gombás kórokozók esetén biokontroll-szereknek tekintették. Kitinázok és β-1,3-glükanázok Talaromyces flavus és Trichoderma sp. megtisztították és jellemezték. Hartl és csoport részletes betekintést engedett számos más típusú gomba-kitináz sokféleségébe, mechanisztikus tulajdonságaiba és biotechnológiai potenciáljába [2].

4.3. Rovarok

Minden rovar-kitináz a GH18 családba tartozik. A szekvencia-hasonlóság alapján a rovar-kitinázokat nyolc csoportra osztják, amelyek molekulatömegük 40 kDa és 85 kDa között változik, és pH-értékük optimális [30]. A teljes szerkezet három doménből áll: a katalitikus régióból, a prolin, glutamát, szerin és treonin aminosavakban dúsított régióból és egy ciszteinben gazdag régióból. Az utóbbi két domén azonban nem szükséges a kitináz aktivitáshoz. A rovar-kitinázok ciszteinben gazdag C-terminális kitint kötő doménje lehorgonyozta a szubsztrátot [2, 30].

A rovar-kitinázok részt vesznek a kutikularéteg kisebb oligoszacharidokká történő lebontásában az új kutikulák szintéziséhez használt kutikulák hidrolizálásával és véletlenszerű lebontásával. Ily módon ezekre a kitinázokra szükség van a régi kutikula részleges lebontásához és az új szintéziséhez. Ezen enzimek expresszióját szigorú ellenőrzés alatt kell tartani, hogy elkerüljük az idő előtti expozíciót, amely növekedésgátláshoz vezethet [31]. E cél elérése érdekében a rovar specifikus kitinázokat termel, amelyek az idő folyamán a metamorfózis különböző szakaszaiban különböző módon expresszálódnak [32]. A beszámolók szerint a kitinázok egyes rovarok mérgében és nyálmirigyében is jelen vannak. Ezekben az esetekben a kitinázok szerepe a gazdanövény lebontása lehet.

4.4. Növények

A növényi kitinázokat aminosav-szekvenciájuk alapján 7 osztályba sorolták, amelyek mindegyike eltérő szerkezettel rendelkezik [33]. A növényi kitináz III. És V. osztálya a GH18 családba, míg az öt többi osztály a GH19 családba tartozik [34]. A növényi kitinázok általában endokitinázok és kisebb a molekulatömegük a rovar-kitinázokhoz képest. Sok növény folyamatosan expresszálja a kitinázokat gumóban, szárban és gyökérben. Növényekben patogenezissel összefüggő fehérjékként működnek, vagyis szintetizálódnak a fitopatogén támadások elleni önvédelemre válaszul, és ezekről a kitinázokról beszámoltak abban az időben is, hogy részt vesznek a növények létfontosságú fiziológiai folyamataiban, például az embriogenezisben és az etilénképződésben [12]. A kitinázról ismert, hogy fontos szerepet játszik a kitintartalmú kórokozók, például gombák és rovarok elleni védekezésben. Intenzív kutatást végeznek olyan transzgenikus növények kifejlesztésére, amelyek túlzott mértékben expresszálják a kitinázok különböző kombinációit, valamint egyéb, a patogenezissel kapcsolatos fehérjéket [35].

A kitinázokról ismert, hogy magas környezeti stressz körülmények között, például hidegben és aszályban is kifejeződnek [8]. A növényi kitinázok egy részéről kiderül, hogy jégszerkezeti hajlamot mutat, ami azt jelenti, hogy jégkristályokhoz kötődnek, csökkentve növekedésüket, ezzel segítve a hideg stressz állapotát [36]. A III. Osztályú kitinázok némelyike fontos szerepet játszik a kalcium tárolásában, anélkül, hogy nagyobb hatással lenne katalitikus aktivitására. A növényi kitinázok szerkezetét és katalitikus funkcióit, valamint a növényélettanban betöltött szerepüket Sahai és Manocha [8] és Grover [37] figyelemre méltóan felülvizsgálták.

4.5. Gerincesek

5. A kitinázok alkalmazása

A kitinázoknak számos terepi alkalmazása van. A kitinázok előtérbe kerülnek a hulladékgazdálkodás, a mezőgazdaság kártevőirtása és az emberi egészségügy területén alkalmazott biotechnológia területén, amelyeket a 3. ábra összefoglalt és az alábbiakban részletesen tárgyalunk.