Kockázatos vállalkozás? Az élőhely és a társadalmi viselkedés hatással van a bőr és a bél mikrobiómáira a karibi tisztító gobikban

Raquel Xavier

1 CIBIO/InBIO, Centro de Investigação em Biodiversidade e Recursos Genéticos da Universidade do Porto, Porto, Portugália

Mazzei Renata

2 Laboratoire d'Eco-Ethologie, Institut de Biologie, Université de Neuchâtel, Neuchâtel, Svájc

Marcos Pérez-Losada

1 CIBIO/InBIO, Centro de Investigação em Biodiversidade e Recursos Genéticos da Universidade do Porto, Porto, Portugália

3 Számítási Biológiai Intézet, Epidemiológiai és Biostatisztikai Tanszék, Milken Institute Közegészségügyi Iskola, The George Washington University, Ashburn, VA, Egyesült Államok

Daniela Rosado

1 CIBIO/InBIO, Centro de Investigação em Biodiversidade e Recursos Genéticos da Universidade do Porto, Porto, Portugália

Joana L. Santos

1 CIBIO/InBIO, Centro de Investigação em Biodiversidade e Recursos Genéticos da Universidade do Porto, Porto, Portugália

Ana Veríssimo

1 CIBIO/InBIO, Centro de Investigação em Biodiversidade e Recursos Genéticos da Universidade do Porto, Porto, Portugália

Marta C. Soares

1 CIBIO/InBIO, Centro de Investigação em Biodiversidade e Recursos Genéticos da Universidade do Porto, Porto, Portugália

Társított adatok

Absztrakt

Az Elacatinus prochilos széles sávú tisztító gobnak két alternatív ökotípusa van: szivacslakók, akik nagy csoportokban élnek, és főleg fonálféreg-parazitákkal táplálkoznak; és koralllakók, akik kis csoportokban vagy magányban élnek és takarítóként viselkednek. A trópusi halak bőrére és bélmikrobiomáira összpontosító legújabb tanulmányok azt mutatták, hogy a mikrobiális közösségeket főként az étrend és a gazdafajok befolyásolják. Összehasonlítjuk itt a karibi széles csíkú tisztító goby E. prochilos alternatív ökotípusait (tisztító és nem tisztító szerek) Barbadosból, és becsüljük meg, hogy az élőhelyek eltérő használata és viselkedése (tisztítás vagy nem tisztítás) különböző baktériumokban fordul elő profilok a két ökotípus között. Jelentős különbségeket találtunk a különböző ökotípusokhoz tartozó bőr- és bélmikrobiomák alfa- és béta-változatosságában. Fontos, hogy a kötelező tisztítószerek bőr mikrobiómája nagyobb mintán belüli változatosságot mutatott, és a potenciális hal-kórokozók jelentősen nagyobb előfordulását mutatta. Hasonlóképpen, a potenciális kórokozók a kötelező tisztítószerek belében is gyakoribbak voltak. Javasoljuk, hogy az élőhelyek használata, az étrend, de a takarítás során a potenciális beteg ügyfélkörrel való közvetlen kapcsolat is okozhatja ezeket a szokásokat.

Bevezetés

Itt összehasonlítjuk a barbadiádi E. prochilos alternatív ökotípusainak (szivacs- vagy koralllakó) baktériumközösségeit, amelyek két különböző lokalitásban (biológiai replikátumban) vettek mintát, annak hipotézisének tesztelésére, hogy az eltérő élőhelyhasználat és viselkedés különböző baktériumprofilokhoz vezetnek a két ökotípusban. Pontosabban azt feltételezzük, hogy a tisztítószerek mikrobiómáját potenciális kórokozók gazdagítják a beteg kliensekkel való gyakori kapcsolat miatt. E cél elérése érdekében párosítani fogjuk a baktérium 16S rRNS gén V4 régiójának nagy áteresztőképességű szekvenálását amplikonszekvencia variáns analízissel.

Anyagok és metódusok

Mintagyűjtés és DNS kivonás

Adatok és statisztikai elemzések

A nyers FASTQ fájlokat a Quantitative Insights Into Microbial Ecology 2 (QIIME2; release 2018.4) platform segítségével elemezték. A tiszta szekvenciákat a Silva (132) referencia-adatbázishoz (Quast és mtsai., 2012) illesztettük a DADA2 csővezetékkel (Callahan és mtsai, 2016). A mintákat ritkítottuk a minimális olvasási számig, és elkészítettünk két jellemző táblázatot, amelyek amplicon szekvencia variánsokat (ASV) tartalmaznak a bőrből és a belből. A mag mikrobiomját megvizsgáltuk a bőr és a bél tekintetében, figyelembe véve az egyes szövetekből származó minták 100% -ában jelen lévő ASV értékeket. Az egyes szövetek leggyakoribb ASV-jaihoz (a reprezentatív szekvenciák> 1% -a) egy hőtérképet készítettünk a QIIME2 -p-normalize opcióval, amely normalizálja a jellemző táblázatot egy 1 álszám hozzáadásával, és a log10 frekvenciát használja a phylum és a nemzetség szintjei.

A baktériumok taxonómiai alfa-változatosságát (intra-minta) Shannon, Fisher, Faith filogenetikai sokféleségének (PD), Evenness és Simpson indexeinek felhasználásával számítottuk ki, az R csomag phyloseq megvalósításával (McMurdie és Holmes, 2013). A fajok béta-változatosságát (inter-minta) Bray – Curtis és filogenetikus Unifrac (súlyozatlan és súlyozott) távolságok alkalmazásával becsültük meg. A minták közötti eltérést fő koordinátanalízissel (PCoA) értékeltük.

Az alfa-diverzitás különbségeit az élőhely és a lokalitás között lineáris modellanalízissel végeztük, és a modell hatásait 1000 reziduális randomizáció alkalmazásával értékeltük permutációs eljárásban az R csomag RRPP segítségével (Collyer et al., 2015). A béta-diverzitásbeli különbségeket a lokalitás és az élőhely között értékeltük permutációs varianciaanalízissel (1000 permutáció), a vegán R csomag adonis funkciójában megvalósítva. Az ökotípusok közötti közösségi összetételbeli különbségeket lineáris regressziós modellekkel teszteltük a leggyakoribb taxonok esetében (> 1% reprezentatív szekvenciákkal).

Eredmények

Rendszertani összetétel és a mag baktériumközösségei az E. prochilos-ban

Összesen 954 109 nyers leolvasást generáltunk (537 084 a bőrre és 417 025 a bélre), mintánként minimum 8991 és legfeljebb 39 640 olvasással. Ezek a szekvenciák 1155 egyedi ASV-nek felelnek meg, amelyekből 662, illetve 579-et találtak az E. prochilos bőrében, illetve bélében.

A 25 baktérium-phylából huszonkettőt detektáltunk a bőrben, de csak ötöt képviselt a szekvenciák több mint 1% -a (1. ábra és S1 kiegészítő táblázat). A proteinobaktériumok (a szekvenciák 80% -a), a Bacteroidetes (7,1%) és a firicutes (2,2%) tagjai minden egyednél előfordultak (S1 kiegészítő táblázat), így képezték a bőr alapvető baktériumközösségeit. A Tenericutes tagjai (a szekvenciák 1,6% -a) csak koralllakókban fordultak elő (de 11 egyedből csak 6 esetben) (1. ábra és S1 kiegészítő táblázat). Tizenegy család uralta a bőr alapvető baktériumközösségeit, közülük a Pseudomonadaceae (a szekvenciák kb. 18,5% -a) és a Beijerinckiaceae (kb. 47,2%) a leggyakoribb (S1 kiegészítő táblázat). A nemzetség szintjén 10 azonosított nemzetség volt jelen a szekvenciák> 1% -ában, a methylobacterium (a szekvenciák 41,8% -a), a Pseudomonas (18,5%) és a Janthinobacterium (1,5%) alkotta a mag mikrobiomját (1. ábra). Érdemes megjegyezni, hogy a Photobacterium és Vibrio nemzetségből származó potenciális kórokozók gyakoribbak voltak a koralllakókban, az első nemzetség csak ebben az ökotípusban fordult elő (1. ábra és S1 kiegészítő táblázat).

Hőtérkép, amely a két ökotípus bőrmikrobiomjának törzs- és nemzetségi szintjén azonosított ASV-k abszolút rengetegségét ábrázolja.

Tizenkilenc phylát detektáltak a bélben, de csak hatot jelentett a szekvenciák több mint 1% -a (2. ábra és S2 kiegészítő táblázat). Csak a proteobaktériumokhoz tartozó ASV-ket (a szekvenciák 68% -át) találtuk minden mintában szereplő egyedben (2. ábra és S2 kiegészítő táblázat). A bélben jelenlévő alapvető baktériumközösségeket csak Beijerinckiaceae alkotta, amelyek a szekvenciák 50% -át tették ki (2. ábra és S2 kiegészítő táblázat). Hét nemzetséget tekintettek bőségesnek a bélben (2. ábra és S2 kiegészítő táblázat), és ezek közül csak a Methylobacterium (Beijerinckiaceae) (a szekvenciák kb. 50% -a) volt jelen minden egyednél. Csakúgy, mint a bőrben, a Photobacterium és a Vibrio potenciális kórokozóinak nagyobb volt a előfordulása a koralllakókban (2. ábra).

Hőtérkép, amely a két ökotípus bélmikrobiómájához tartozó törzsek és nemzetségek szintjén azonosított ASV abszolút rengetegségét ábrázolja.

Baktériumok sokféleségének elemzése

A bőr mikrobioma alfa-változatossága szignifikánsan különbözött az ökotípusok között, a koralllakók Shannon (F = 13,786, p = 0,002), Simpson (F = 20,162, p = 0,001) és Evenness ( F = 17,807, p = 0,001) indexek (lásd a 3. ábrát és az S3, S4 kiegészítő táblázatokat). A lokalitás vagy a lokalitás ∗ ökotípus interakciós kifejezés nem volt hatással az alfa mikrobiális sokféleségére. Jelentős különbségeket találtunk a béta-változatosságban az ökotípusok között is a filogenetikus Unifrac súlyozott (R2 = 0,224 és p = 0,005) és a Bray – Curtis (R2 = 0,098 és p = 0,007) távolságok (S3 kiegészítő táblázat és 4A ábra) segítségével. Hasonlóképpen, a mintavételi helyek a béta-változatosságban is szignifikáns különbségeket mutattak a Bray – Curtis távolságban (R 2 = 0,087, p = 0,018) (S3 kiegészítő táblázat és 4A ábra).

Dobozdiagramok, amelyek a bőr és a bél mikrobiomjának alfa-diverzitási indexeinek átlagértékeit és szórásait ábrázolják helyenként és ökotípusonként.

(A) PCoA ábrák, amelyek a súlyozott és súlyozatlan Unifrac távolságokat és a bőr mikrobiomjának Bray-Curtis távolságait ábrázolják; és (B) A PCoA diagramok súlyozott és súlyozatlan Unifrac távolságokat és Bray-Curtis távolságokat ábrázolnak a bélmikrobiom számára.

Az átlagos taxon arányok elemzése szignifikáns különbségeket mutatott a Vibrionaceae (F-statisztika = 6,057, p = 0,023) és a Beijerinckiaceae (F-statisztika = 19,34, p 3. ábra és S3, S4 kiegészítő táblázatok) mennyiségében. A béta-diverzitás elemzése azonban szignifikáns különbségeket tárt fel az ökotípusok (R 2 = 0,125, p = 0,038) és a ec ökotípus lokalitása között a tesztelt három távolság egyikén (filogenetikus Unifrac súlyozott) (R 2 = 0,116; p = 0,037) ( Kiegészítő S3 táblázat és 4B ábra). Az átlagos taxon arányok elemzése szignifikáns különbségeket mutatott az Ureaplasma (Mycoplasmataceae, Tenericutes) ökotípusai között (F-statisztika = 6.105; p = 0.022), amely szinte kizárta a koralllakó ökotípust (S1. Kiegészítő táblázat).

Vita

Jelen tanulmány leírja az E. prochilos bőrének és bélének alapvető baktériumközösségeit, valamint Barbadoson két alternatív ökotípus (tisztítószerek és nem tisztítószerek) közötti különbségeket. Összességében elmondható, hogy a koralllakók kötelező tisztítóinak bőrmikrobiomája következetesen nagyobb mintán belüli változatosságot mutatott, és a potenciális hal-kórokozók szignifikánsan magasabb prevalenciáját mutatta, ami megerősíti kezdeti hipotéziseinket.

Rendszertani összetétel és a mag baktériumközösségei az E. prochilos-ban

Az E. prochilos bőrmagmikrobiomája változatosabb volt, mint a bélé, az előbbi a Proteobacteriumok, Bacteroidetesek és Firmicutes részekből állt, míg utóbbi csak a főként a Methylobacterium nemzetség (Beijerinckiaceae) fehérjebaktériumait tartalmazta. Az itt közölt baktériumprofilok az E. prochilos bőr- és bélmikrobiomáihoz hasonlóak, mint amelyeket korábban más teleosztatoknál publikáltak (pl. McDonald et al., 2012; Larsen et al., 2014; Lokesh és Kiron, 2016; Carda-Diéguez et al., 2017; Rosado et al., 2019), beleértve a többi korallzátonyi halat is (Chiarello et al., 2018).

A bakteriális sokféleség különbségei az E. prochilos ökotípusok között

A szivacslakókkal összehasonlítva a koralllakók tisztítóinak bőrmikrobiomája jelentősen gazdagodott a Vibrionaceae-szal (több mint hatszorosával), egy baktériumcsaláddal, amelyről ismert, hogy több hal-kórokozót is magában foglal (áttekintést lásd például Austin, 2011-ben). Ezen a családon belül a Vibrio és Photobacterium ASV-k nagyobb gyakorisággal fordultak elő a tisztább ökotípusban. Ez a két nemzetség köztudottan számos kórokozót hordoz magában, amelyek világszerte képesek megfertőzni a halakat, beleértve a trópusi fajokat is (Landsberg, 1995; Panek, 2005; Gomez-Gil et al., 2007). Valóban, a Vibrio bősége szignifikánsan magasabb volt a koralllakók bőrében. Ez alátámasztja azon kezdeti feltételezésünket, miszerint a kórokozók átterjedése előfordulhat beteg betegektől.

A bélben talált taxonkülönbségek finomabbak voltak. A bél leggyakoribb taxonjai közül csak egy, az Ureaplasma-hoz tartozó ASV változott jelentősen az ökotípusok között. Mindazonáltal a mintavételi hely és az ökotípus közötti kölcsönhatás hatással volt a béta-változatosságra (Súlyozott Unifrac). Ez némileg meglepő, mivel számos tanulmány kimutatta, hogy az étrendnek jelentős hatása van a halak bél mikrobiómájának összetételére (lásd Tarnecki et al., 2017; Egerton et al., 2018 áttekintéseit).

Következtetés

E vizsgálat eredményei azt mutatták, hogy az E. prochilos két alternatív ökotípusának bőr baktériumközösségei megkülönböztethetők 16S rRNS génszekvenciák alkalmazásával, még a csak egymástól 10 m távolságra elfogott halak között is. Ezenkívül a korallokban lakó gobok (tisztítószerek) bőr mikrobiómája nagyobb baktériumok sokféleségét rejti magában, köztük a potenciális hal-kórokozók (pl. Vibrio és Photobacterium) lényegesen nagyobb arányát. Javasoljuk, hogy az élőhelyhasználat, az étrend és a társadalmi szerepvállalás a potenciális beteg kliensekkel való gyakori fizikai érintkezés miatt jelentős eltérésekhez vezethet a patogén baktériumok sokféleségében és bőségében az E. prochilos tisztább és nem tisztább ökotípusai között.

Etikai nyilatkozat

Ezt a tanulmányt a parti övezet-kezelési egység (CZMU) barbadosi ajánlásainak megfelelően végezték el. A protokollt a környezetvédelmi miniszter jóváhagyta a CZUM nevében (engedély hivatkozási száma: CZ01/9/9).

Szerző közreműködései

RX, MS és RM tervezte a munkát. RM összegyűjtötte a halakat. RX és JS végezték a laboratóriumi munkát. Az RX, MP-L és DR elvégezte az adatok elemzését. Minden szerző hozzájárult a kézirat megírásához.

Összeférhetetlenségi nyilatkozat

A szerzők kijelentik, hogy a kutatást bármilyen kereskedelmi vagy pénzügyi kapcsolat hiányában végezték, amely potenciális összeférhetetlenségként értelmezhető.

Köszönetnyilvánítás

Köszönjük J. Germainnek, S. Tide-nek, H. Valles-nak, L. Waterman-nek és R. Bshary-nak a logisztikai támogatást és segítséget a gobok gyűjteményében, valamint S. Cardosót a kézirat-formátumban nyújtott segítségért. Ezúton is köszönjük a Bellairs Kutatóintézet munkatársainak a logisztikai támogatást.

Lábjegyzetek

Finanszírozás. Az RX, az MS, az MP-L, az AV és a DR támogatást jelenleg az FCT támogatta a Programa Operacional Potencial Humano - Quadro de Referência Estratégico Nacional keretében az Európai Szociális Alapból és a portugál Ministério da Educação e Ciência forrásból (tagállam: SFRH/BPD/109433/2015; RX: IF/00359/2015; AV: SFRH/BPD/77487/2011; DR: SFRH/BD/117943/2016). Az RM-t a Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico do Brazil (CNPq) ösztöndíja támogatta. A kutatást az Európai Regionális Fejlesztési Alap (ERFA) támogatta a COMPETE programon keresztül és a nemzeti alapok az FCT - Tudomány és Technológia Alapítványon keresztül (PTDC/MAR-BIO/0902/2014 - POCI-01-0145- FEDER-016550 projektek; és PTDC/BIA-MIC/27995/2017- POCI-01-0145-FEDER-027995).