α ‐ laktalbumin: szerkezet és funkció

Az Orosz Tudományos Akadémia Biológiai Műszerészeti Intézete, 142292 Pushchino, Moszkva régió, Oroszország

Kémiai Tanszék, Ohio Állami Egyetem, Columbus, OH 43210, USA

Az Orosz Tudományos Akadémia Biológiai Műszerészeti Intézete, 142292 Pushchino, Moszkva régió, Oroszország

Kémiai Tanszék, Ohio Állami Egyetem, Columbus, OH 43210, USA

Absztrakt

A kicsi tejfehérje, az α-laktalbumin (α-LA), a laktóz-szintáz egyik alkotóeleme, egy egyszerű modell, a Ca 2+ kötő fehérje, amely nem tartozik az EF-kéz fehérjéihez, és az olvadt gömböcskék klasszikus példája. Erős Ca 2+ kötőhellyel rendelkezik, amely megköti az Mg 2+, Mn 2+, Na + és K +, valamint számos különálló Zn 2+ kötő helyet. A kationok kötése a Ca 2+ helyhez növeli a fehérje stabilitását a hő és a különféle denaturáló szerek hatása ellen, míg a Zn 2+ kötődése a Ca 2+ terhelt fehérjéhez csökkenti annak stabilitását. Az α-LA működéséhez kölcsönhatásokra van szükség membránokkal, fehérjékkel, peptidekkel és kis molekulatömegű szubsztrátokkal és termékekkel. Kimutatták, hogy ezeket a kölcsönhatásokat a fémkationok megkötése modulálja. Nemrégiben azt találták, hogy az α-LA néhány hajtogatható variánsa baktériumölő aktivitást mutat, és néhányuk tumorsejtek apoptózisát okozza.

1. Bemutatkozás

Másodszor, az α-LA egyetlen erős Ca 2+ kötőhellyel rendelkezik [2, 3], és ezért gyakran használják egyszerű, modellként alkalmazható Ca 2+ kötő fehérjeként. Nagyon kényelmes a fehérje és a fehérjék, peptidek, membránok és kis molekulatömegű szerves vegyületek kölcsönhatásainak kalciumkötő hatásainak tanulmányozásához, amelyek gyakran élettani jelentőséggel bírnak.

Harmadszor, az α-LA-nek több, részben hajtogatott köztes állapota van, amelyeket sok fehérjehajtási problémák iránt érdeklődő kutató tanulmányoz. Nagyon vonzó a közbenső olvadt gömbszerű állapotok tulajdonságainak és szerkezetének vizsgálata szempontjából, mivel savas pH mellett és magas hőmérsékleten apo-állapotban az α-LA a klasszikus „olvadt gömb” [3-5]. .

Negyedszer, a közelmúltban kiderült, hogy az α-LA egyes formái apoptózist indukálhatnak a tumorsejtekben [6, 7], ami arra utal, hogy ez a fehérje számos fontos biológiai funkciót képes ellátni.

2 Elsődleges, másodlagos és harmadlagos szerkezet

3 A kationkötő helyek elhelyezkedése

Az α ‐ LA egyik legérdekesebb tulajdonsága, hogy képes fémkationokat megkötni. Nem tartozik az EF-kéz fehérjecsaládjába. A fehérjének egyetlen erős kalciumkötő helye van, amelyet oxigén ligandumok képeznek három Asp-maradék (82, 87 és 88) karboxilcsoportjából és a peptid gerincének két karbonilcsoportjából (79 és 84) két spirál közötti hurokban. A hurok két maradékkal kevesebb, mint a tipikus EF-kézi Ca 2+ kötő domén. Ezenkívül egy vagy két vízmolekula vesz részt a Ca 2+ közvetlen koordinálásában. Összességében az oxigén ligandumok torzított ötszögletű bipiramidális struktúrát képeznek. A közelmúltban röntgen-kristályográfiával másodlagos kalciumkötő helyet találtak az emberi α-LA 7,9 Å-ben, az elsődleges erős kalciumkötő helytől távol [12]. Négy csoport vesz részt a Ca 2+ koordinációjában ezen a helyen egy tetraéderes elrendezésben (Thr-38, Gln-39, Asp-83 és a Leu-81 karbonil-oxigénje). Ez a másodlagos hely az α-LA molekula felszíne közelében helyezkedik el.

4 Kalcium által kiváltott konformációs változások

A Ca 2+ α-LA-hez való kötődése a szerkezet és a funkció markáns változását okozza, főleg a harmadlagos, de nem másodlagos struktúrában, ami jól látható mind a fluoreszcencia [3, 19], mind a CD [20] adatokból. A kalciumkötés mind a triptofán fluoreszcencia kék eltolódását, mind a fluoreszcencia kvantumhozam csökkenését eredményezi. Az időben felbontott fluoreszcencia mérések azt mutatták, hogy a Ca 2+ által kiváltott hatások az összes kibocsátó triptofán maradék (négy szarvasmarha α-LA és három humán α-LA, 1. ábra) környezetében bekövetkező változások következményei [21]. A kifejezett fluoreszcencia-változások a Ca 2+ asszociációs állandó pontos monitoraként használhatók, amely nagyon nagy, és általában nem értékelhető közvetlen Ca 2+ -titrációk alapján, de pontosabban kiszámítható a Ca 2+ -terhelt α- LA erős Ca 2+ kelátképzővel [3] .

5 Egyensúlyi és kinetikus fémionok kötőállandók

A kalcium mellett az α-LA más fiziológiailag jelentős kationokat is megköt, például Mg 2+, Mn 2+, Na + és K +, amelyek versenybe szállhatnak a Ca 2+ -val ugyanazért a kötési helyért [19, 22]. Hasonló, bár kisebb szerkezeti változásokat indukálnak az α-LA-ban. Az 1. táblázat összehasonlító kötési állandókat sorol fel ezekhez a kationokhoz [19, 23]. Úgy tűnik, hogy ezek a kationok kötődnek a kalciumkötő helyhez.

Kation	Társulási állandók (M −1)
37 ° C	20 ° C
Ca 2+	2 × 10 7	3 × 10 8
Mn 2+	3 × 10 8
Mg 2+	211 ± 20; 46 ± 10	2000 ± 100; 200 ± 20
Na +	36 ± 10	100 ± 10
K +	6 ± 3	8 ± 3

Az 1. táblázatban megjegyezzük, hogy a magnézium két kötőállandót sorol fel, mivel úgy tűnik, hogy az α-LA másodlagos kötőhelyekkel rendelkezik ezen kation számára. Az Mg 2+, Na + és K + ionok kötési állandóinak értékei meglehetősen alacsonyak, de figyelembe véve a sejtben lévő magas koncentrációikat, feltételezhetjük, hogy in vivo sikeresen versenyezhetnek a Ca 2+ ionokkal.

A natív α-LA 72–100 maradékainak megfelelő szintetikus peptid tartalmazza a Ca 2+ kötőhurkot, mellette egy spirál, amely az α-domén 86–98 maradékát és a β-domén 310 hélixét tartalmazza. Ha a Cys-73, Cys-77 és Cys-91 helyébe alaninok lépnek, az nagyon gyengén kötődik a Ca 2+ -hoz (10 2 M −1) [24]. Másrészről, a natív diszulfidkötés kialakulása a Cys-73 és a Cys-91 között nem növeli a vízben a Ca 2+ iránti affinitását, hanem 50% trifluor-etanolban.

A leállított fluoreszcencia áramlásmérések szerint az α-LA Ca 2+ és Mg 2+ komplexeinek disszociációs sebességi állandóinak értékei gyakorlatilag megegyeznek és 0,006 és 1 s -1 között vannak a 10 és 40 ° C közötti hőmérsékleti tartományban [ 25]. A Ca 2+ és az Mg 2+ asszociációs sebességi állandói ebben a hőmérsékleti tartományban 10 6 –10 7 és 10 1 –10 2 M -1 s –1 között vannak. Érdekes, hogy a Ca 2+ –α-LA komplex asszociációs sebességi állandója majdnem 1-2 nagyságrenddel alacsonyabb, mint a diffúzióval vezérelt határ, ami meglehetősen szokatlan a kalciumkötő fehérjék esetében. Ennek egyik lehetséges oka az S – S híd megléte lehet, amely összeköti a Ca 2+ kötőhurok végeit az α-LA-ban.

6 Fehérje stabilitás

A kation kötődése az erős kalciumhelyhez növeli az α-LA stabilitását. A differenciális pásztázó kalorimetriás (DSC) adatokból a Ca 2+ megkötése a termikus átmenetet több mint 40 ° C-kal tolja magasabb hőmérsékletekre [26, 27]. Az Mg 2+, Na + és K + kötődése szintén növeli a fehérje stabilitását. Minél erősebben kötődik egy ion a fehérjéhez, annál hangsúlyosabb a hőátmenet eltolódása.

Meglepő módon a Zn 2+ ionok kötődése a Ca 2+ -terhelésű α-LA-hoz csökkenti a hőstabilitást, aggregációt okoz és növeli annak hajlamát a proteáz emésztésre [13, 28]. A kalciumterhelésű α-LA termikus átmenete szobahőmérsékleten, nagy cinkkoncentráció mellett történik (Zn: fehérje mólarány kb. 100). Összességében az eredmények azt is megmutatták, hogy az α-LA részben kibontott és részben aggregált állapotban van magas [Zn 2+] jelenlétében.

Kalciumionok hiányában, de a magnézium-, a nátrium- és a káliumionok fiziológiás koncentrációinak jelenlétében az α-LA-ban a termikus átmenet a 30–45 ° C közötti tartományban történik [29]. Ez összefüggésben lehet az emlőmirigyben az α-LA stabilitás és működés bizonyos hőmérsékleti szabályozásával.

A fémkationok megkötése szintén növeli az α-LA stabilitását denaturáló szerek, például karbamid vagy guanidin-hidroklorid hatásával szemben [19]. Itt a denaturációs görbék fontos jellemzői a megkülönböztetett, köztes olvadt gömbszerű állapotok, amelyek középső denaturáló koncentrációknál keletkeznek.

Figyelemre méltó, hogy a kalcium megkötése stabilizálja az α-LA-t a nyomással szemben, amelyet a nyomás 200 MPa-os növekedése követ, ahol denaturáció történik [30]. Érdekes módon a kalciumkötés nagyobb mértékben növeli a kalciumkötő hurok nyomásstabilitását, mint a teljes α-LA másodlagos szerkezet nyomásstabilitása.

Nagyon fontos kiemelni, hogy az denaturációs átmenet az α-LA-ban (hőmérséklet, nyomás, denaturálószer-koncentráció) a fémion koncentrációjától (különösen a kalciumion koncentrációjától) függ. Így az olyan értékek, mint a denaturációs hőmérséklet vagy a karbamid vagy a guanidin-hidroklorid denaturáló koncentrációja, viszonylag értelmetlenek az α-LA szempontjából anélkül, hogy meghatároznák a fémion-tartalmat (oldószerkoncentrációkat).

Kuwajima et al. [31, 32] az apo-α-LA újratekeredésének kinetikáját tanulmányozta leállított pH-értékű ugrási kísérletekkel. A fehérje szabadon feltekeredő kinetikájának egyszerű egyetlen exponenciális jellege van. Kimutatták, hogy a Chaperone GroEL késlelteti az apo-α-LA újratekeredését azáltal, hogy kölcsönhatásba lép a fehérje olvadt gömb állapotával. A GroEL és az α-LA korai összecsukható közbensője közötti kötési állandó 10 M M -1 nagyságrendű .

A szarvasmarha α-LA utólagos visszahajtása 6 M GuHCl-denaturált állapotából [33] azt jelzi, hogy a fehérje négy ép diszulfidkötésével való hajtogatása megfelel a fehérje hajtogatásának egyik korlátozó esetének, amelyben a gyors összeesik egy natív jellegű gömbbé. A hajtást natív oldalsó lánc-érintkezők keresése követi, amelyek lehetővé teszik a hatékony átalakítást a szorosan tömörített natív struktúrára.

7 Az N-terminális mutánsok hatása a fehérje tulajdonságaira

Mivel megkezdtük az α-LA különféle mutáns formáinak tanulmányozását, azonnal nyilvánvaló volt, hogy a vad típusú rekombináns szarvasmarha α-LA, amely N-terminális Met hozzáadásával különbözik a tejben izolált natív fehérjétől, hozzáférhetőbb triptofán maradványokkal rendelkezik, alacsonyabb hőstabilitás és csökkent kalcium affinitás a natív fehérjéhez képest [34]. Az N-terminális Met enzimatikus eltávolítása helyreállítja az α-LA natív tulajdonságait. Összességében a fluoreszcencia, a körkörös dikroizmus és a DSC eredmények azt mutatták, hogy a rekombináns vad típusú α-LA kalciumion hiányában „olvadt gömbszerű” állapotban van. A delta-E1 (vagy E1M) mutáns, ahol a natív szekvencia Glu-1 maradéka genetikailag szubsztituált, N-terminális metionint hagyva a helyén a bakteriális expresszió után, csaknem egy nagyságrenddel nagyobb affinitást mutat a kalciumhoz és a magasabb hőstabilitást. (kalcium hiányában és jelenlétében egyaránt), mint a tejben izolált natív fehérje.

Az egyetlen mutáció hatása az α-LA N-terminálisában sok okból nagyon érdekes. A szarvasmarha α-LA-ban lévő töltött Glu-1 a fehérje felületén helyezkedik el, és nem jár nyilvánvalóan hozzájárul a tercier struktúra kialakulásához (pl. Sóhidak, hidrogénkötések egyes fehérjecsoportokkal). Ugyanakkor töltve csoportként hozzájárul a fehérje elektrosztatikus kölcsönhatásainak egyensúlyához. Ezenkívül hidrofil maradékként erősen kölcsönhatásba lép a vízzel, ezért valószínűleg hajlamos kibontakozni a fehérje szerkezetét. Met hozzáadása az N-véghez még rosszabbá teszi a helyzetet, és átmenetét idézi elő az olvadt gömbszerű konformációba. A Glu ‐ 1 eltávolítása megszünteti ezt a tendenciát, ezért valószínűleg a mutáns fehérje stabilabbá válik. Talán a szarvasmarha α-LA-jában található Glu ‐ 1 maradék valamilyen kritikus régióban található, amely lehetővé teszi a fehérje szerkezetének átállítását a nagyon merevről az olvadt gömbszerűre.

8 Savátmenet

9 Olvadt gömb állapot

10 Kis molekulatömegű szerves vegyületek és peptidek megkötése

Az α-LA kölcsönhatásba lép különféle kis molekulatömegű szerves vegyületekkel, és ezeket a kölcsönhatásokat kationkötés modulálja. Például az α-LA megköti az UDP-galaktózt, a laktózszintáz reakció szubsztrátumát, valamint az UDP-t és az UTP-t [13, 29]. A kötési paraméterek a fehérje állapotától függenek, de az UDP-galaktóz legerősebb kötési állandója a 10 3–10 4 M – 1 tartományba esik. .

Az α-LA megköti a melittint, a méhméreg rövid peptidjét [42], amelyet gyakran használnak a kalmodulin cél-fehérjéjeként. Ellentétben a többi kalciumkötő fehérjével, például a kalmodulinnal vagy a troponin C-vel, az α-LA csak a hiány kalciumionok. Az Apo ‐ α ‐ LA megköti a melittint az 5 × 107 M –1 kötési állandóval. A megkötés megváltoztatja a melittin konformációt az oldatban lévő véletlen tekercsből az apo-α-LA bináris komplexus spirális szerkezetébe.

Az α-LA zsírsavkötő helyek több osztályával rendelkezik. Megköti az 5-doxil-sztearinsavat (DSA, spin-jelölt zsírsavanalóg, C22H42NO4), a sztearinsavat és a palmitinsavat. A kötési paraméterek a fehérje állapotától függenek. A DSA látszólagos kötődési állandói a 10 4 és 10 6 M -1 közötti tartományban vannak [43] .

11 Kölcsönhatások membránrendszerekkel

Az α-LA kölcsönhatásba lép a lipidmembránokkal is [44-49]. Az α-LA és DMPC, DPPC vagy lecitin vezikulumok keverékének Sephadex G-200 kromatográfiájával kiderül, hogy a fehérje jelentős része kötődik a vezikulákhoz, ahol utólag lehet tanulmányozni a fehérje bizonyos fizikai tulajdonságait ebben az állapotban. A vezikulához kötött α-LA belső fluoreszcenciája két hőátmenetre érzékeny: Az első a lipid vezikulák gél-folyadék kristály átmenete; a második a fehérje denaturációjából ered. A fluoreszcencia maximális pozíciója azt sugallja, hogy alacsony hőmérsékleten a triptofán hozzáférhetősége nő a fehérje-hólyag asszociáció után. A proteinátmenet felett a triptofánok jelentősen kölcsönhatásba lépnek a vezikulák apoláris fázisával. A kioltási kísérletek arra is utalnak, hogy a triptofán hozzáférhetősége nő a fehérje-hólyag asszociáció után. A liposzómához kötött α-LA termikus denaturációja a fehérje fémhez kötött állapotától függ [44, 45] .

2-es pH-értéknél, ahol a fehérje gyorsan beilleszkedik a kétrétegbe, az izolált vezikula – α-LA komplex különálló fluoreszcencia termikus átmenetet mutat, összhangban egy részben beillesztett fehérjével, amelynek valamilyen tercier szerkezete van, és kooperatívan bontakozik ki [44]. Ez ellentétben áll az oldat savas α-LA állapotának viselkedésével.

Ezek az eredmények egy olyan modellt javasolnak, ahol a konformáció korlátozott tágulása következik be a membrán társulása esetén semleges pH-n, fiziológiás hőmérsékleten, az oldószer és a külső oltóanyagok triptofán-expozíciójának egyidejű növekedésével. Az adatok rávilágíthatnak az α-LA in vivo működésére és mechanizmusára, mivel kölcsönhatásba lépnek a galaktozil-transzferázzal a Golgi lumen membránfelületein.

12 Az α ‐ LA funkciói

Régóta ismert, hogy az α-LA a laktóz-szintáz [1] alkotóeleme: csak szubsztrátok jelenlétében komplexálódik a galaktozil-transzferázzal, és módosítja annak specifitását. Ennek ellenére a fémkationok szerepe a laktózszintáz működésében még mindig nem egyértelmű. Az egyik szubsztrát, amely a galaktozil-transzferázhoz, az UDP-galaktózhoz kötődik, az α-LA-hez is kötődik, de meglehetősen alacsony affinitással [13, 29]. Nem ismert, hogy ennek a kötődésnek van-e fiziológiai jelentősége vagy sem. A laktózszintázhoz az optimális működéshez Mn 2+ -ionokra van szükség, és mind a galaktozil-transzferáz, mind az α-LA meglehetősen szorosan megköti az Mn 2+ -ot.

Meglepő módon a kalcium kötése az α-LA-hoz a laktózszintézisben még mindig nem egyértelmű. Másrészt megtudtuk, hogy a Zn 2+ az α-LA-hez kötődve modulálhatja a laktózszintáz funkciót, és ez fiziológiailag jelentős lehet [48]. A cink kötődése az α-LA-hoz megváltoztatja a látszólagos Michaelis-állandót is K m (kb.) és V max. laktózszintáz. Ezek a hatások a mangán koncentrációjától is függenek [48]: A Zn 2+ mindkettőben csökkenést vált ki K m (kb.) és V max az Mn 2+ esetében, ami a laktózszintáz aktivitás látszólagos növekedését, majd csökkenését eredményezi Mn 2+ koncentrációknál a GT első Mn 2+ kötőhelyének telítettsége alatt. Magas Mn 2+ koncentrációk esetén a Zn 2+ csökkenti a laktóz szintáz aktivitását.

Pelligrini és mtsai. [49] megállapította, hogy az a-LA proteolitikus emésztése tripszinnel és kimotripszinnel három baktericid tulajdonságú peptidet eredményez. A polipeptidek többnyire aktívak a Gram-pozitív baktériumok ellen, ami az α-LA lehetséges antimikrobiális funkciójára utal, miután endopeptidázok részlegesen emésztették. Hakansson és mtsai. [50] egy α-LA hajtogatási variánst mutatott ki, amely baktériumölő hatással rendelkezik az antibiotikumokkal szemben rezisztens és antibiotikumokra fogékony Streptococcus pneumoniae. Az a-LA aktív formáját anioncsere és gélkromatográfia kombinációjával tisztítottuk a kazeinből. Érdekes, hogy a natív α-LA ioncserélő kromatográfiával aktív baktériumölő formává alakulhat át emberi tej kazeinből származó kofaktor jelenlétében, amelyet C18: 1 zsírsavként jellemeznek. Mint fentebb bemutattuk, az α-LA zsírsavkötő helyek több osztályával rendelkezik [43] .

Kit és mtsai. [52] kimutatta, hogy az emberi tejből származó oligonukleotidok mind az α-LA citosztatikus, mind citotoxikus hatásait blokkolják. Azt is megállapították, hogy mind a monomer, mind a multimer α-LA különböző hosszúságú oligonukleotidokat köt meg [53]. Azt javasolták, hogy az oligonukleotidok kiválasztódjanak az emlősejtekből, és hogy az α-LA és az endogén oligonukleotidok az emlőmirigy sejtjeinek fiziológiai állapotának szabályozási tényezőként szolgálhatnak. Ezenkívül az oligonukleotidok képesek voltak szabályozni a tej citotoxikus potenciálját.