A hőstabil enterotoxin STb expressziója a tapadó Escherichia coli által nem elegendő súlyos hasmenés kialakulásához újszülött sertéseknél

Absztrakt

Az Escherichia coli hőstabil enterotoxin B (STb) szerepét az újszülött sertés hasmenésében, amelyet enterotoxigén E. coli okozott, összehasonlítottuk az adherens izogén törzsekkel STb-vel vagy anélkül. A klónozott STb gént (a pRAS1 plazmidban) egy nementerotoxigén törzsbe (226M) elektroporáltuk, amely az F41-adhezint expresszálja. A 226M pRAS1 törzs tapadt és expresszálta az STb-t in vivo, ami újszülött sertéseknél folyadék szekréciót okozott ligált ilealis hurokban. Noha a 226M pRAS1 törzs nagyon enyhe hasmenést okozott néhány orálisan beoltott újszülött sertésben, ezeknek a sertéseknek a súlyvesztése hasonló volt a STb nélküli szülői törzs okozta súlyvesztéssel. Megállapítottuk, hogy az STb nem járul hozzá jelentősen az enterotoxigén E. coli által okozott hasmenéshez újszülött sertéseknél.

Az enterotoxigén Escherichia coli (ETEC) törzsek hasmenést okoznak emberekben és állatokban a vékonybél megtelepedésével és a folyadék szekrécióját okozó enterotoxinok termelésével. A tapadást a pili, fimbriae vagy adhezin nevű fonalas felületi struktúrák közvetítik. A sertésekben hasmenést okozó ETEC törzsek számos adhezin típusú antigént expresszálnak, köztük a K88, K99, 987P és F41. Az E. coli enterotoxinok hőstabilitásuk alapján vannak osztályozva, és nagyjából hőre labilis enterotoxinokra (LTI és LTII) és hőstabil enterotoxinokra (STa és STb) vannak felosztva. Az E. coli STa enterotoxinokat tovább osztották STaP-re, amely a sertés ETEC törzseivel áll összefüggésben, és STaH-ra, amely megtalálható az emberi ETEC törzsekben. Adherencia és enterotoxin expresszió egyaránt szükséges ahhoz, hogy az ETEC törzsek hasmenést okozhassanak (18).

Az STb enterotoxin elterjedt a hasmenéses sertésektől izolált E. coli törzsekben, de ritkán található meg az emberektől vagy szarvasmarháktól izolált E. coli törzsekben (6, 7, 11–13). Beszámoltak az emberektől izolált STb-t expresszáló ETEC törzsekről, de ezek a törzsek nem jártak hasmenéssel (7). Sertés ETEC törzsekben az STb a legelterjedtebb enterotoxin; az STb + törzsek azonban gyakran expresszálnak egy másik enterotoxint, akár LT-t, akár STaP-t (13). Ezenkívül a csak STb + törzsek ritkán hibridizálódnak a sertés ETEC törzsek egyik ismert adhezinjának DNS-próbáival (3). Az E. coli törzseket, amelyek csak STb-t és más enterotoxint tartalmaznak, nem izoláltak a sertésekből, de ezekből a törzsekből gyakran hiányoznak az ismert adhezinek és nem patogének (1, 8). Így az STb specifikus szerepének megerősítését az ETEC törzsek által okozott sertés hasmenésében bonyolította más enterotoxin gének jelenléte vagy egy ismert ETEC adhezin hiánya a legtöbb izolátumban, amely csak STb-t expresszál.

Ebben a tanulmányban az STb szerepét vizsgáltuk újszülött sertéseknél az ETEC által közvetített hasmenésben. Összeállítottunk egy adherens törzset, amely csak STb-t és izogén kontrolltörzseket expresszált, amelyek rekombináns plazmidot, amely csak STaP-t kódol, vagy csak a klónozóvektort tartalmazza. Ezeket a törzseket megvizsgáltuk az enterotoxinok tapadásának és in vivo expressziójának a ligált ilealis hurokban. A törzsek patogenitását újszülött sertések orális beoltásával is megvizsgáltuk.

Törzsszerkezet.

A 226M törzset használtuk gazdaszervezetként a pBR322 vagy az STb (pRAS1) vagy az STaP (pCH4) kódoló rekombináns plazmidok számára. A 226M törzs az ETEC 431 törzs adherens, nemtoxigén mutánsa, amely elveszítette a K99-et és az STaP-t kódoló plazmidot, de megtartotta az F41 kromoszomális génjeit (2). A 226M törzs megtelepíti az ileumot, de nagyon enyhe hasmenést és minimális súlyvesztést okoz újszülött sertéseknél (2). A 234M törzset gazdaszervezetként is alkalmaztuk a pRAS1 számára. A 234M törzs a 431 törzs független mutánsa, amely elveszítette a K99-et kódoló géneket (törléssel), de megtartotta az STaP és F41 géneket (2). A 234M törzs, hasonlóan a vad típusú 431 törzshez, megtelepíti az ileumot, expresszálja az STaP-t, és súlyos hasmenést és jelentős súlyvesztést okoz újszülött sertéseknél (2). A 123. törzs egy nem toxikus, nem tapadó kontroll törzs, amelyet korábban leírtak (16, 20). Az 1790 törzs nem tapadó törzs, amely csak STb-t expresszál (20).

A pRAS1 plazmid pBR322, egy 1,1 kb méretű HindIII fragmens inzerttel, amely tartalmazza az STb gént, és korábban leírták (19). A pCH4 plazmid pBR322, egy 1,7 kb méretű PstI fragmenssel, amely a pRIT10036 (9, 14, 15) alklónozott STaP gént tartalmazza. Az STaP gént tartalmazó 1,7 kb méretű PstI fragmenst először a pUC18-ba klónoztuk, majd BamHI-HindIII fragmensként szubklónoztuk a pBR322-be.

Az izolált plazmid DNS-t elektroporáltuk a 226M vagy 234M törzsbe, egy génpulzert és impulzusszabályozót (Bio-Rad Laboratories, Hercules, Kaliforniában) 2500 V, 25 μF kapacitású és 200 Ω ellenállású értékre állítva. Ampicillint (100 μg/ml) használtunk a transzformánsok szelektálására, és ampicillin-rezisztens telepeket szkríneltünk az enterotoxin STb (pRAS1) vagy STaP (pCH4) gént hordozó rekombináns plazmidokra specifikus DNS-próbákkal végzett kolóniablot-hibridizációval (13–15). ).

In vivo enterotoxin expresszió és tapadás.

ASZTAL 1

Hasmenés, súlyváltozás és kolonizáció előfordulása újszülött sertésekben különböző törzsekkel történő orális oltást követően

StrainNo. sertésből hasmenéses sertések átlagos tömegszázalékos változása (± SEM) a Log CFU b TSBTSB + AmpAdherence c

226M F41 + Tox -	12.	4	–6,9 (± 1,2)	8.65	ÉN d	11.
226M pBR322	6.	1	−4,9 (± 0,9)	7.24	7.15	4
226 millió pRAS1 (STb +)	12.	5.	–9,2 (± 1,3)	8.44	8.33	11.
226M pCH4 (STaP +)	8.	8.	−24,0 (± 0,9)	6.83	6.54	1
234 millió (STaP +)	4	4	−21,9 (± 1,5)	8.93	ÉN d	4
234M (STaP +, pRAS1 STb +)	4	4	–21,5 (± 2,8)	8.52	8.44	4

Az újszülött sertéseket is 234M (STaP +) és 234M pRAS1 (STaP + és STb +) izogén törzsekkel oltották be annak megállapítására, hogy mindkét toxin együttesen nagyobb hatást gyakorol-e oltott újszülött sertésekben, mint bármelyik toxin önmagában. Az 1. táblázat 1. táblázatának eredményei azt mutatják, hogy nem volt különbség a 234M okozta hasmenés vagy súlyvesztés súlyosságában klónozott STb génnel vagy anélkül.

Megállapítottuk, hogy a klónozott STb gén nem járult hozzá jelentősen az adherens E. coli törzsek okozta hasmenéshez újszülött sertéseknél. STB izogén törzsekkel beoltott malacok és STb nélküli izogén törzsekkel beoltott malacok esetében nem volt különbség a hasmenés előfordulásában vagy súlyosságában. A 226M pRAS1 (STb +) törzs nagyon enyhe hasmenést okozott súlyvesztéssel, amely hasonló volt a nontoxigén 226M szülőtörzs vagy a csak a pBR322 vektort tartalmazó + 226M törzs okozta súlyos hasmenést és súlyvesztést, hasonló ahhoz, mint amit a a vad típusú szülő 431 (2) törzs. A 226M pCH4 törzs azonban nem kolonizált, valamint a 226M törzs vagy a 226M pRAS1 törzs. A csökkent gyarmatosítás oka nem ismert. Valamennyi törzs hasonlóan tapadt az újszülött sertéseknél készített ligált ilealis hurkokban, ami arra utal, hogy különbözhetnek a baktériumok szaporodási sebességei azokban a sertésekben, amelyeket orálisan beoltottak különböző klónozott enterotoxin géneket tartalmazó 226M törzsbe.

A 226M törzsbe bejuttatott pRAS1 (STb) és pCH4 (STaP) plazmidok in vivo viszonylag stabilak voltak. Az ampicillinnel és anélkül táptalajra terített 226 M pRAS1-gyel beoltott malacok 10 cm-es ileum-mintáiban a baktériumok száma hasonló volt (1. táblázat). Ezen lemezek egyes telepeit szintén hibridizáltuk STb DNS-próbával. Bár az oltott sertések között volt némi eltérés, a telepek több mint 90% -a megtartotta az STb gént (az adatokat nem közöljük).

Nagyon meglepő volt, hogy az STb-t expresszáló, tapadó, pRAS1-t tartalmazó 226M törzs nem okozott súlyos hasmenést és súlyvesztést újszülött sertéseknél. Számos korábbi tanulmány kimutatta az STb kapcsolatát hasmenéses sertésektől izolált E. colival (áttekintve az 5. referenciában). A csak STb-törzsekről azonban nagyon kevés jelentés áll rendelkezésre. Moon és mtsai. (12) egy K99 + STb + törzsről számolt be, amely hasmenést okozott újszülött sertéseknél, de később kiderült, hogy ez a törzs expresszálja az STaP-t is (3).

Eredményeink azt mutatják, hogy egy csak STb-t expresszáló tapadó törzs folyadék szekréciót okozott az újszülött sertések ileajában, de nem világos, hogy ez az STb + törzs miért nem növelte a hasmenés súlyosságát orálisan beoltott újszülött sertéseknél. Lehetséges, hogy az STb által okozott szekréció rövidebb időtartamú vagy kisebb, mint az STa által okozott szekréció. Az is lehetséges, hogy az STb lassabban hat, mint az STa, ha folyadékfelhalmozódást okoz, ami végül hasmenéshez vezet. Ezen érdekes lehetőségek megerősítése további kísérleteket igényel. Eredményeink azonban azt mutatják, hogy 6 órás posztinokulációval a 226 M pRAS1-gyel (STb +) beoltott ligált ilealis hurkok jelentős folyadékfelhalmozódást mutattak. Nem világos, hogy a folyadék felhalmozódása miért nem eredményezett hasmenést és jelentős súlycsökkenést az orális provokációt követő 18 órában ugyanazzal a törzzsel. Talán az STb által okozott váladék újból felszívódik a vékonybélben vagy a vastagbélben, míg az STa-váladék nem szívódik fel újra.

Ezekben a kísérletekben konkrétan csak az STb szerepét vizsgáltuk újszülött sertéseknél az ETEC hasmenésben. Lehetséges, hogy az STb szerepet játszik az ETEC okozta hasmenésben idősebb, elválasztott sertéseknél. Az idősebb sertések ellenállnak a 431 szülő törzs tapadásának, amely K99 és F41 adhezint expresszál (16). Ezért az ebben a vizsgálatban használt F41 + törzs, a 226M nem használható fel az STb szerepének meghatározására az elválasztott sertéseknél az ETEC törzsek által okozott hasmenésben. Annak megállapításához, hogy az STb hozzájárul-e az elválasztott sertésekben hasmenést okozó ETEC-törzsekhez, olyan izogén törzsek létrehozását kell megkövetelni, amelyek ugyan hasonlóak az itt leírtakhoz, de az idősebb sertéseket telepítik.