Micellásan szolubilizált xantohumol terápiás alkalmazása az elhízás, a cukorbetegség és az alkoholmentes zsírmáj betegség nyugati típusú étrend által kiváltott egérmodelljében

Abdo Mahli

1 Biokémiai Intézet (Emil-Fischer Zentrum), Friedrich-Alexander Egyetem Erlangen-Nürnberg, Fahrstr. 17, D-91054 Erlangen, Németország; [email protected] (A.M.); [email protected] (T.S.); [email protected] (K.F.)

Tatjana Seitz

Kim Freese

Jan Frank

2 Táplálkozástudományi Intézet, Hohenheimi Egyetem, Garbenstr. 28, D-70599 Stuttgart, Németország; [email protected]

Ralf Weiskirchen

3 Molekuláris Pathobiokémiai Intézet, Kísérleti génterápia és klinikai kémia (IFMPEGKC), RWTH Aacheni Egyetemi Kórház, D-52074 Aachen, Németország; ed.nehcaaku@nehcriksiewr

Mona Abdel-Tawab

4 Német gyógyszerészek központi laboratóriuma, Carl-Mannich-Str. 20, D-65760 Eschborn, Németország; [email protected]

Dariush Behnam

5 AQUANOVA AG, Birkenweg 8-10, D-64295 Darmstadt, Németország; [email protected]

Claus Hellerbrand

Absztrakt

1. Bemutatkozás

A „metabolikus szindróma” kifejezés az elhízással járó társbetegségek egyidejű előfordulására utal. Az inzulinrezisztencia mellett, amelynek eredménye a 2-es típusú diabetes mellitus (T2DM), a dyslipidaemia és a magas vérnyomás a metabolikus szindróma alkotóeleme. Sőt, szinte minden esetben az elhízás jelentős lipid felhalmozódással jár a májban. A máj steatosisának ezt a formáját nem alkoholos zsírmáj betegségként (NAFLD) definiálják, és ma a metabolikus szindróma máj megnyilvánulásának tekintik. A NAFLD a kóros állapotok széles skáláját öleli fel. A hepatocelluláris lipidfelhalmozódás a NAFLD első kóros lépése. Az egyszerű steatosis gyulladással (alkoholmentes) steatohepatitiszé (NASH) válhat. Fejlett formájában a NASH-ot necro-gyulladás és progresszív fibrózis jellemzi [1]. Ez utóbbi cirrhosissá válhat. Ma a NAFLD-t a nyugati országokban a leggyakoribb májbetegségnek ismerik el [2].

Az egyes kóros NAFLD lépések a metabolikus szindróma következményei és kiváltói. Ezzel a metabolikus szindróma (alkotórészeinek) javítása szintén javítja a NAFLD-t.

Jelenleg nem állnak rendelkezésre hatékony stratégiák a NAFLD kezelésére. A betegek többsége nem reagál jól a testsúlycsökkentő beavatkozásokra [3]. Az olyan sebészeti beavatkozások, mint a gyomor bypass vagy a gyomor leépítése (bariatrikus műtét) a leghatékonyabb intézkedések a tartós fogyáshoz [4], amelyek szintén pozitívan befolyásolják a NAFLD fejlődését és progresszióját [5]. Az invazivitás és a költségek fényében azonban ezek a műtéti beavatkozások csak kórosan elhízott egyének kisebb részére alkalmazhatók. Másrészt a T2DM farmakológiai terápiái (például szulfonilureával, metforminnal vagy GLP-1 agonistákkal) gyakran csak részben hatékonyak és súlyos mellékhatásoktól szenvednek [6]. Ezért nagy a klinikai igény új farmakológiai terápiás megközelítésekre a fenntartható, biztonságos fogyás és a metabolikus szindróma (a tünetek) hosszú távú javítására.

A xantohumol (3 '- [3,3-dimetil-allil] -2', 4 ', 4-trihidroxi-6'-metoxi-halkonon) a női virágzatok (komlótobozok) fő prenilezett kalkonja, kis mennyiségben jelen van a sörben [ 7]. A xantohumol számos egészségkárosító hatásáról beszámoltak, például kemopreventív és gyulladáscsökkentő tevékenységekről (áttekintve [8]). Újabban kimutatták, hogy a xantohumol csökkenti az adipogenezist, és javítja a lipid- és glükóz-anyagcserét a hiperlipidémia, az elhízás és a T2DM egérmodelljeiben [9,10,11]. Sőt, korábban megmutattuk, hogy a xanthohumol gátolja a májgyulladást és a fibrózist a NAFLD egérmodelljeiben [12]. Továbbá mi és mások azt tapasztaltuk, hogy a xantohumol gátolja a májgyulladást és a fibrózist a metabolikus szindrómához nem kapcsolódó hepatocelluláris károsodás modelljeiben is [13,14,15]. Ez azt jelzi, hogy a xantohumol közvetlenül gátolja a máj gyulladásos és fibrogén mechanizmusait (sejtek).

Figyelemre méltó, hogy ezekben a vizsgálatokban az XN-t a kísérlet kezdetétől fogva adták be, vagyis egy obesogén vagy NAFLD-indukáló étrend bevezetésével egyidejűleg, amely szimulálja a betegségek megelőzését. Ez azonban nem tükrözi az elhízott betegek helyzetét, akik a javító beavatkozások megkezdésekor már egészségügyi állapotban szenvednek. Továbbá, és ígéretes egészségügyi hatásai ellenére, az XN terápiás alkalmazását korlátozhatja a gyenge orális biohasznosulás [16].

Jelen tanulmányunkban a xantohumol (s-XN) micellás szolubilizációjának hatását kívántuk elemezni az étrend okozta elhízás, a cukorbetegség és a NAFLD preklinikai egérmodelljében [17]. Korábbi tanulmányok alapján, amelyek sikeresen alkalmazták más polifenolok micelláris szolubilizációját orális biohasznosulásuk fokozása érdekében [18,19,20,21], napi 2,5 mg/testtömeg-kg-os dózist választottunk, vagyis több mint 10-szer alacsonyabb a hatékonynál a korábbi in vivo vizsgálatokban jelentett dózisok. Összehasonlításképpen ugyanazt a dózisú xantohumolt alkalmaztuk natív formájában (n-XN). A legtöbb korábbi vizsgálattól eltérően a xanthohumolt nem a chow-ban (keverésbe) adták be, hanem napi szájon át történő szoptatással a pontos adagolás garantálása érdekében. Ezenkívül az egereket elhízás- és NAFLD-indukáló Western-típusú étrenddel (WTD) táplálták már 3 héttel a xanthohumol beadásának megkezdése előtt, hogy megelőzés helyett a terápiás beavatkozást szimulálják.

2. Anyagok és módszerek

2.1. Vegyszerek

A micelláris Xantho-Flav-szolubilizátumot (EW0192/B, 10% v/v; s-XN) és a natív xantohumol kivonatot (92% m/m; n-XN) az AQUANOVA AG (Darmstadt, Németország) biztosította. A natív xantohumol oldásához metil-hidroxi-propil-cellulóz (MHPC, 0,2%, Methocel E4M Premium CR, Hypromellose 2910 USP, Fagron Inc., St. Paul, MN, USA) vizes oldatát készítettük.

2.2. Állatok és állatmodell

Nyolc hetes hím C57BL/6 egerek (Charles River Laboratories; Sulzfeld, Németország). Az egereket 22 ° C-os, szabályozott helyiségben helyeztük el, 12 órás világos-sötét ciklus alatt, szabad hozzáféréssel az élelemhez és a vízhez. A lakhatási és állatkísérleteket az Európai Unió (EU) nemzeti és nemzetközi irányelvei szerint, a helyi önkormányzat megfelelő engedélyével hajtották végre (55.2-2532-2-196). 1 hetes akklimatizáció után az egereket négy csoportra osztottuk (csoportonként 6 egér); az egereket három hétig standard táplálékkal (kontroll) vagy Western típusú étrenddel (WTD) etették. A szokásos étrend 4,9% nyersrostot, 6,4% nyershamut, 19% nyersfehérjét, 3,3% zsírt és 58% szénhidrátot tartalmazott (szacharóz 4,7% és keményítő 36,5%); A WTD-t disznózsírral (15%), marhahús faggyúval (15%), palmitinsavval (4%), sztearinsavval (4%), koleszterinnel (0,2%) és szacharózzal (30%) dúsították [17]. Mindkét rágcsáló étrendet Ssniff (Soest, Németország) készítette.

Ezt követően a WTD-vel táplált egereket naponta további 8 hétig n-XN vagy s-XN vagy vivőanyaggal (VH) kezeltük orális szondánként. Összesen 11 hetes kontroll vagy WTD-etetés után az egereket feláldoztuk, és májszövet- és vérmintákat gyűjtöttünk további elemzés céljából.

2.3. Intraperitoneális glükóz tolerancia teszt (ipGTT)

7 hetes orális n-XN vagy s-XN beadása után az ipGTT-t a korábban leírt módon hajtottuk végre [22]. Röviden, 12 órás éhezés után az egereknek intraperitoneálisan injekcióztak glükózt (50% w/v oldat, 3 mg (glükóz)/g testtömeg). A vércukor-koncentrációt a farokvénából vett mintákban mértük (éhomi glükóz) és 30, 60, 90 és 120 perccel a glükóz beadása után Accutrend glükométerrel (Roche, Mannheim, Németország).

2.4. Celluláris lipidtartalom elemzése

A máj lipidjeit kivontuk, és a triglicerid szinteket a GPO-triglicerid készlet segítségével (Sigma, Deisenhofen, Németország) számszerűsítettük a leírtak szerint [23, 24].

2.5. RNS expressziós elemzés

A májszövetekből az RNS izolálását és a reverz transzkripciót a leírtak szerint hajtottuk végre [25]. A kvantitatív valós idejű PCR-t LightCycler technológiával (Roche) [26] és a következő primerpárokkal végeztük: egér kollagén I (előre: 5′-CTG TTC CAG GCA ATC CAC GA -3 ′; hátramenet: 5′-ATC AGC TGG AGT TTC CGT GC-3 ′, egér cxcl1 (előre: 5′-ACC GAA GTC ATA GCC ACA CTC-3 ′; hátramenet: 5′-CTC CGT TAC TTG GGG ACA CC-3 ′), egér mcp1 ( előre: 5′-TGC AGG TCC CTG TCA TGC TTC-3 ′; hátramenet: 5′-TGG ACC CAT TCC TTC TTG GGG T-3 ′, és egér α-SMA (előre: 5′-CCA GCC ATC TTT CAT) TGG GAT-3 '; fordított: 5'-CCC CTG ACA GGA CGT TGT TA-3'). A normalizáláshoz a 18s rRNS-ből származó cDNS amplifikációját (előre: 5'-AAA CGG CTA CCA CAT CCA AG-3 '; fordított: 5'-CCT CCA ATG GAT CCT CGT TA-3') használtuk.

2.6. (Immuno) szövettani elemzések

A szövettani elemzésekhez az egér májszövet mintáit 24 órán át szobahőmérsékleten 4% -os formalinban rögzítettük, fokozatos etanollal dehidratáltuk és paraffinba ágyazottuk. A szöveti metszeteket (5 um vastagságú) para-xinmentesítettük xilollal, és haematoxilinnel és eozinnal festettük. Az immunhisztokémiai festést anti-CD3 C7930 antitest (1: 500; Sigma-Aldrich) alkalmazásával hajtottuk végre, a leírtak szerint [27]. A CD3-pozitív hepatociták számát minden szakaszon 4 véletlenszerűen kiválasztott területen számláltuk. Az a-SMA máj immunhisztokémiai festését a leírás szerint hajtottuk végre [17].

2.7. Az XN HPLC elemzése szérummintákban

A xantohumolt a korábbiakban leírtak szerint elemeztük [7], kis módosításokkal annak érdekében, hogy nagyobb mennyiségű szérumot lehessen használni az analitikák alacsony vérkoncentrációja miatt. Röviden, a szérummintákat két példányban 6–5 sósavval 4,5–5,0 értékre állítottuk be. Az oxidáció megakadályozása érdekében aszkorbinsavat (12,5 μl 10% -os aszkorbinsavat tartalmazott vízben; tömeg/térfogat) adtunk hozzá. A szérumot (1,5 ml) inkubáltuk Helix pomatia 25 μl H-1 típusú β-glükuronidázzal (3 mg/100 µl 0,1 M nátrium-acetát pufferben, pH 4,5; Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Schnelldorf, Németország) sötétben, 37 ° C-on 1 órán át, enyhe rázással (

100 fordulat/perc). A mintákat kétszer extraháltuk 4 ml etil-acetáttal 20 percig vertikális rotátoron végzett keverés közben. A mintákat 590 percig 490 ° C-on centrifugáltuk 5 ° C-on, keverés közben, és összesen 7,2 ml felülúszót nyertünk ki. Az egyesített felülúszókat 10 mbar nyomáson szárazra pároljuk RVC 2-33 IR centrifugális párologtatóval (Martin Christ Gefriertrockungsanlagen GmbH, Osterode am Harz, Németország). A szárított maradékokat 100 µl metanolban oldjuk, és kétszer keverjük össze örvényben, közben 10 percig szobahőmérsékleten pihentetjük, és 10 µL-t injektálunk a HPLC-be.

A xantohumolt JASCO HPLC rendszeren (LC Net II ADC, AS-2059-SF Plus, PU-2080 Plus, CO-2060 Plus, DG-2080-53, LG-2080-02 intelligens oszlopos termosztát, DG-2080-02 és fotodióda tömb detektoron) kromatografáltuk. Kinetex PFP oszloppal (Kinetex PFP, 100 Å pórusméret, 250 × 4,6 mm (hossz × átmérő), 5 μm részecskeméret; 5 μm részecskeméret; Phenomenex) felszerelt, 35 ° C-on tartott PDA MD-2018; JASCO, Groβ-Umstadt, Németország) . A mozgó A fázist (ioncserélt víz 5% hangyasavval) és a mobil B fázist (acetonitrilt 10% ioncserélt vízzel és 5% hangyasavval) 1,0 ml/perc áramlási sebességgel juttattuk el többlépcsős gradiens módszerrel (0 perc 0% B, 1 perc 30% B, 4 perc 30% B, 12 perc 75% B, 14 perc 100% B, 20 perc 30% B). Az eluenst fotodióda tömb detektálásával követtük 292 nm-en, a 220-850 nm tartományban kapott spektrummal. A csúcsokat rögzítettük és integráltuk a ChromNav 1.19.1 (JASCO) verziójával, és számszerűsítettük úgy, hogy a csúcsterületeket összehasonlítottuk a hiteles külső szabványokkal.