Molekuláris módszerek a béta- és gamma-papillomavírusok kimutatására: áttekintés

All Talents T Murahwa 1,2 *, Monalisa T Manhanzva 1,2 és Babill Stray-Pedersen 3

1 Orvosi laboratóriumi tanszék, Zimbabwe Egyetem Egészségtudományi Főiskola, Avondale, Harare, Zimbabwe

2 Fertőző Betegségek és Molekuláris Orvostudományi Intézet, Egészségtudományi Kar, Fokvárosi Egyetem, Orvosi Virológiai Osztály, Fokváros, Dél-Afrika

3 Klinikai Orvostudományi Intézet és Szülészeti és Nőgyógyászati Osztály, Rikshospitalet, Oslo, Egyetemi Kórház, Norvégia

* Levelező szerző: Alltalents T Murahwa
Orvosi laboratóriumi tudományok tanszék
Zimbabwe Egyetem Egészségtudományi Főiskola
Avondale, Harare
Zimbabwe
Tel: 00263-779-136342
Email: [e-mail védett]

Kapott dátum: 2016. június 27 .; Elfogadott dátum: 2016. július 08 .; Közzététel dátuma: 2016. július 13

Idézet: Murahwa AT, Manhanzva MT, Stray-Pedersen B (2016) Béta- és gamma-papillomavírusok kimutatásának molekuláris módszerei: áttekintés. J Infect Dis Ther 4: 289. doi: 10.4172/2332-0877.1000289

További kapcsolódó cikkekért látogasson el ide: Journal of Infectious Diseases & Therapy

Absztrakt

A béta és gamma humán papillomavírus (HPV) nemzetségekre vonatkozó bizonyítékok felhalmozódása megmutatja annak kapcsolatát a nem melanoma bőrrákokkal (NMSC). A HPV klinikai mintákban történő kimutatásának jelenlegi módszerei molekuláris alapúak. Számos molekuláris technika kifejlesztve a HPV diagnosztizálására; jobban összpontosítson a nyálkahártya HPV típusainak kimutatására. Korlátozott számú vizsgálati módszert fejlesztettek ki a bőr HPV-k kimutatására és genotípusának meghatározására. Ezek a vizsgálatok az eltérő érzékenységgel és specifitással rendelkező bőrelváltozásokba bekerült HPV-típusok egy részét detektálják. A HPV NMSC-ben való előfordulásáról ellentmondó szakirodalom az inkonzisztens diagnosztikai standardok eredménye. Ez az áttekintés a HPV-k kimutatására és genotipizálására rendelkezésre álló módszereket tárgyalja, különös tekintettel a bőr HPV-genotípusaira. Ez az információ biztosítja a kutatók számára az epidemiológiai felmérésekhez alkalmazható molekuláris módszerek releváns választásait. A végső cél automatizált, gyors és olcsóbb molekuláris megközelítés megalkotása az erőforrás-szegény beállításokhoz.

Kulcsszavak

Humán papillómavírus; Léziók; Bőrrák; Carcinoma

Bevezetés

A HPV messze a leggyakrabban érintett vírus emberi rosszindulatú daganatokban az összes HPV-nek tulajdonítható rák 5,2% -a fertőzés [1]. Az Egészségügyi Világszervezet (WHO) kimutatta, hogy körülbelül 9–13% (

A világ népességének 630 millió) rendelkezik HPV-fertőzéssel [2]. A HPV részvételét méhnyak-, pénisz-, szájüregi, nemi és gégerákban, valamint olyan bőrelváltozásokban, mint a bőr szemölcsök, laphámsejtes karcinómák (SCC) és a bazálissejtes karcinómák (BCC), részletesen dokumentálták [3].

A HPV-k a bőrben, a nyálkahártyán és a nemi szerveken jelen lévő kötelező intraepithelialis vírusok [4]. Replikálódnak a nyálkahártya felszíni rétegein és felhám ahol a sejtek differenciáltabbak [5]. Klinikailag a HPV-t a nyálkahártya és a bőr típusai közé sorolják. A nyálkahártyatípusok azok, amelyek többnyire a nyaki neopláziában érintettek, és a bőrtípusok a bőr szemölcsében és nem-melanóma bőr rákos megbetegedések.

A HPV-k a Papillomaviridae családból származnak, amely a mai napig 29 nemzetséget tartalmaz, amelyeket 189 papillomavírus-típus alkot. Százhúsz típus emberi papillómavírus, a fennmaradó 69 állat és madár papillomavírus [6,7]. A HPV-k kb. 8 kb méretű cirkuláris dsDNS vírusok, amelyek jellemzően 8 gént tartalmaznak [8]; mégpedig az E1-E7 gének, valamint az L1 és L2 gének.

A HPV genom három fő régióból áll, amelyeket a korai régió (E) kódol: E1, E2, E4, E5, E6, E7 fehérjék; és a késői régiót (L) kódolja: L1 és L2 fehérjéket; és a hosszú kontroll régió (LCR), más néven upstream szabályozó régió [9,10]. Az L1 régió a legkonzervatívabb régió a HPV genomban, és megőrzi integritását, miután a vírus DNS-t integrálja a gazdasejt genomjába [11-13]. A HPV osztályozása, differenciálása és molekuláris diagnózisa tehát kizárólag a nukleotidszekvencia variációin alapszik. genom.

Az alábbiakban bemutatjuk a módszerek értékelésének és az epidemiológiai vizsgálatoknak a válogatását, amelyeket kritikusan áttekintünk, hogy információkat nyújtsunk a különböző HPV-alkalmazásokban használható módszerek választásáról.

HPV kimutatási módszerek

A HPV-t nem növelték sikeresen sejttenyészetekben, és a szerológiai vizsgálatok korlátozott pontossággal rendelkeznek, mivel nem képes megkülönböztetni a jelenlegi és a korábbi fertőzéseket (HPV lab manual, 2009). A HPV specifikus nukleinsavak kimutatása továbbra is a legjobb módszer a HPV kimutatására klinikai mintákban. Számos molekuláris módszer áll rendelkezésre a HPV kimutatására, és kategorizálhatók amplifikációs és nem amplifikációs (vagy közvetlen hibridizációs vizsgálatok) technikákba. Az amplifikációs technikák további kategóriákba sorolhatók: jelerősítés és cél amplifikációs módszerek (HPV lab manual, 2009). Ezeknek a technikáknak a többségét azonban csak a nyálkahártya-HPV-kre alkalmazták. A bőr HPV laboratóriumi kimutatása még mindig nagyon fejletlen, a rendelkezésre álló néhány módszer nem fedi le az összes bőr HPV genotípust. A jelenlegi áttekintés röviden ismerteti a HPV kimutatására és genotipizálására rendelkezésre álló különféle molekuláris módszereket, különös tekintettel a bőr (béta és gamma) HPV típusokra.

Amplifikációs módszerek

A cél amplifikációs vizsgálatok a polimeráz láncreakciót (PCR) használják a nukleinsavak amplifikálására, és ezek a legszélesebb körben alkalmazott módszerek. A PCR-ek történhetnek típus-specifikus láncindítókkal az egyes HPV genotípusok amplifikálásához, vagy konszenzusos láncindítókkal, amelyeket a HPV genotípusok széles spektrumának amplifikálására terveztek [14]. A konszenzusos primereket általában a HPV genom konzervált régióinak, például az L1 nyitott leolvasási keret vagy az E1 régió azonosítására tervezik [15,16]. A GP5 +/6 + és MY09/11 primer párok a HPV konszenzusos PCR-ekben gyakran alkalmazott primerek. A PCR-ből előállított amplikonok az alábbiakban ismertetett módon különböző módon genotipizálhatók.

A restrikciós fragmens hosszának polimorfizmusa (RFLP): A PCR termék restrikciós fragmens hosszának polimorfizmusa (RFLP) detektálásával vizsgálható, restrikciós endonukleáz enzimek felhasználásával számos fragmens előállítására, amelyeket ezt követően gélelektroforézissel elemeznek [17-19]. Az RFLP módszer kevésbé nehézkes és olcsóbb, mint a szekvenálás. Megkülönböztetheti a magas és az alacsony kockázatú HPV-ket, valamint több fertőzést is felismerhet.

Fordított vonal blot (RLB): Alternatív megoldásként a PCR-termékeket elemezhetjük hibridizáció egy vagy több típusspecifikus oligonukleotidszondával rétegezve egy szűrőpapír padra vagy membráncsíkra (például fordított vonalú blot (RLB), lineáris tömb és INNO-Lipa), vagy egy mikrotiter falára kötve [20-22]. A hibridizációs technikák előnye, hogy specifikusak azoknak a HPV-típusoknak a kimutatására, amelyeknél a próbák a membráncsíkokra vannak rétegezve, és ezáltal lehetővé teszi több HPV-típus detektálását egyetlen menetben.

HPV genom szekvenálás: A HPV genotipizálásának másik módja az amplikonok közvetlen szekvenálása. A szekvenciákat ezután összehasonlítjuk a HPV adatbázis [23-24] referencia szekvenciáival. A szekvenálási technikák előrehaladása a Sanger-szekvenálástól, a piroszekvenálástól a legújabb következő generációs szekvenálásig (NGS) vagy a nagy teljesítményű szekvenálásig javult a sebesség, a kvantálás, a specificitás és az érzékenység. Az NGS-technológiák költségei azonban még mindig magasak, és az erőforrás-hiányos körülmények között nem valósíthatók meg.

Valós idejű PCR: A valós idejű PCR alkalmazása, amely egyszerre azonosítja és kvantifikálja (a vírusterhelés meghatározásának képessége révén) a specifikus HPV típusokat, rendkívül gyors és reprodukálható [25-27]. A valós idejű PCR másik előnye, hogy képes különféle nukleinsav-célpontokat multiplexelni.

Microarrays és DNS chipek: A mikrorajzok egy PCR termék chipre hibridizálását jelentik, és a hibridizált jelet egy DNS chip szkenneren olvassák le. A fő előny, hogy képes számos mintát egyidejűleg elemezni.

A jelerősítő vizsgálatok, a legszélesebb körben alkalmazott jelerősítő módszerek, nevezetesen a Digene hibrid rögzítési teszt 2 (HC2), és ez az egyetlen FDA által jóváhagyott HPV diagnosztikai teszt. Ez a módszer a megcélzott HPV-DNS hibridizációján alapul jelölt RNS-próbákkal és a hibridek ezt követő kötődésével/befogásával a mikrotiter üregekbe, majd detektálást antitest-szubsztrát rendszerrel [28-31]. A teszt azonban nem genotípus, de a HPV-ket alacsony vagy magas kockázatú típusokként csoportosítja; és emiatt széles körben alkalmazható az epidemiológiai vizsgálatokban. Hátránya, hogy a HC2 nem genotípusa. A HPV genotipizálása elengedhetetlen az egyes onkogén típusok azonosításában, ha jelentős klinikai beavatkozásokra van szükség.

Nem erősítési módszerek

A nem amplifikációs módszereket az elsők között alkalmazták a HPV diagnózisában a PCR megjelenése előtt. Ide tartozik a Southern-blot, az in situ hibridizáció (ISH) és a pont-hibridizáció. Mindezek a próbák tisztított, de nem amplifikált DNS-hez való specifikus kötődésén alapulnak egy gélen (Southern blotting) vagy az eredeti mintán, az ISH-n [32-35]. Korábban a dot blot módszer kereskedelmi készletként volt elérhető, de már nem használatos, nevezetesen a Virapap és Viratype készletek (Digene Corporation, Gaithersburg, USA). Az ISH továbbra is elérhető Kreatech kereskedelmi készlet formájában (Kreatech Biotechnology B.V, Amszterdam, Hollandia), és kutatási célokra használják. Összességében a nem amplifikációs technikák hátránya az alacsony érzékenység, ami azt jelenti, hogy nagy mennyiségű DNS-re van szükség a kimutatáshoz, és a felhasznált DNS-nek épnek kell lennie. Ezek a technikák szintén nehézkesek és időigényesek.

Kután HPV-specifikus módszerek

A HPV szerepe a nyaki karcinogenezisben szilárdan megalapozott. Ezért a diagnosztikai módszerek sürgősen elengedhetetlenné váltak [36]. Bizonyíték a HPV és a bőr társulásának támogatására elváltozások csak viszonylag nemrégiben állapították meg [37-39]. Ennek eredményeként késés mutatkozott a bőr HPV-k diagnosztikai technikáiban.

A legújabb osztályozás szerint a bőr HPV-k a béta és gamma közé tartoznak- papillomavírus nemzetségek [7], míg a nyálkahártya az alfa nemzetségből származik. Sőt, megfigyelték, hogy a bőr HPV-k filogenetikailag megkülönböztetik a nyálkahártya típusait [40], másrészt a bőr HPV-k megfertőzik a külső bőrt. A béta- és gamma-papillomavírusok epidermodysplasia verruciformis (EV) -vel kapcsolatos HPV-kből és filogenetikailag rokon bőr-HPV-kből állnak. Genotípusaik a HPV 4, 5, 8, 9, 12, 14, 15, 17, 19, 20, 21, 22, 2, 23, 24, 25, 36, 37, 38, 47, 48, 49, 50, 60 és 65.

Korábban meghatározták a béta- és gamma-HPV szerepét az NMSC-kben, de a diagnózist korlátozták a kimutatás és a tipizálás módszerei. A legtöbb rendelkezésre álló módszer a DNS konszenzusos PCR-rel történő amplifikációjára támaszkodik, amelyet szekvenálás követ [41-43]. A bőr HPV-k kimutatására választott minta egy bőrbiopszia, amelyet NMSC-gyanús gyanúban szenvedő betegeknél vettek fel. A begyűjtés után vagy pillanatszerűen lefagyasztják, vagy formalint rögzítik. A HPV DNS több kereskedelmi kit módszerrel nyerhető ki, a megfelelő gyártó utasításainak betartásával.

Konszenzusos primer PCR és hibridizációs módszerek

A béta- és gammakután PCR (BGC-PCR) [40] a konszenzusos primerekkel végzett HPV-amplifikáción alapul, hat átfedő előre és nyolc átfedő reverz primer keverékével. Mindkettő az L1 nyitott leolvasási keretet célozza meg, 72 bp-os amplimert generálva, a reverz primerek pedig mind biotinilezettek. Ebben az esetben az amplifikációt RLB próbák követik többféle béta- és gamma-HPV típushoz, amelyeket karboxil bevonatú nejlon membráncsíkra rögzítettek. PCR-termékeiket a membránba rétegzett oligonukleotid-próbákra merőlegesen alkalmazzák. A PCR-termékeket ezután hibridizálják a csíkkal, végül vizuális detektálásnak vetik alá őket. Következésképpen a vizuális detektálást a membrán anti-biotin konjugátumban történő inkubálásával és kemilumineszcencia detektálásával érjük el. Ez a vizsgálat 25 különféle HPV-t detektál, és a továbbfejlesztett változat hozzáadja a konzervált régió 75, 76, 80, 92, 93, 96 genotípusát [44]. Ennek a módszernek az az előnye, hogy 25 béta- és gamma-HPV típust genotipizál.

A BGC PCR másik variációját szintén PM-PCR reverz hibridizációs teszt (RHA) néven ismerték [Diassay, Hollandia] [45]. Ez a módszer ugyanazt az elvet használja, de csökkentett mennyiségű széles spektrumú primert használ, azaz két előre és hét hátramenetet, az E1 régiót megcélozva. Ennek eredményeként ez a variáció 117 bp-os amplimert generál, összehasonlítva a BGC-PCR 72 bp-os változatával; a specifitás megváltoztatása. A hibridizációs módszer ugyanaz, azonban a PM PCR RHA módszer oligopróbákat tartalmaz a HPV 75, 76, 80, 92, 93, 96 típusokhoz (csíkokra rétegezve), ellentétben a BCG PCR-rel, amely 4, 48, 50, 60, 65 HPV-típus. A PM-PCR-t tehát béta-papillomavírusokhoz tervezték, míg a BGC-PCR mindkét nemzetségre kiterjed.

Konszenzusos primer PCR és szekvenálási módszerek

Számos PCR-módszert fejlesztettek ki a bőr HPV-k számára, amelyek szekvenálást használnak genotipizálási módszerként. A „függő cseppek” PCR-technikája egyetlen csővel beágyazott PCR-eljáráson alapszik [46]. Az első PCR-reakcióelegy degenerált FAP59/64 primerekkel a HPV genom L1 régióját célozza meg, és egy csőbe helyezi, ahol a reakció folytatódik, míg a második kör PCR keveréke egy 25 ul-os csepp a függőleges első kör cső. Az első forduló után ugyanazt a csövet centrifugáljuk, és a függő csepp visszaesik a csőbe, ami elindítja a második kör PCR-jét. A keletkezett amplikonokat elválasztja elektroforézis majd klónozzuk, mielőtt a szekvenálás elvégezhető lenne. Végül a létrehozott szekvenciákat ezután összehasonlítjuk a releváns adatbázisban meglévő szekvenciákkal.

A függesztett csepp módszer korábbi változata egyetlen körös FAP PCR volt, amely degenerált PCR primerek párját (FAP59/64) használta a bőr HPV típusainak széles spektrumának felerősítésére. Ezt követi a klónozás és a szekvenálás a genotipizáláshoz [41]. Hátránya, hogy a szekvenálás nem képes kimutatni a többszörös fertőzés eseteit, és ez nagyon fáradságos is. További követelménye van, hogy a PCR-termékeket a közvetlen szekvenálás előtt klónozzák, hogy elkerüljék a következményeket többféle fertőzésben [41,43].

Multiplex PCR és új genotipizáló módszerek

A molekuláris technikák viszonylag új csoportja lehetővé teszi a béta- és gammanemzetségekben található szinte mind az 50 HPV-típus kimutatását. Az egyik ilyen a bőrelváltozásokban érintett gamma, béta, mu és nu nemzetségek 58 HPV-jének Bead alapú multiplex genotipizálása [47]. Ez a módszer FAP59/64 primerek keverékén alapul (azaz a függesztett csepp módszer) további 18 primerrel összekapcsolva, szintén az L1 régiót célozva, beágyazott PCR módszerrel [41], amely szintén felerősíti a bőrelváltozások. Biotinnal jelzett PCR-termékek hibridizálódnak a fluoreszcenciával jelzett Luminex gyöngyökhöz konjugált típusú specifikus oligonukleotid próbákkal, és az eredményeket Luminex analizátorban olvassuk.

A multiplex PCR módszer egy másik típusa HPV típusú specifikus primereket használ az E7 régió amplifikálásához array primer extension (APEX) módszerrel a genotipizáláshoz [48]. Az APEX vizsgálatok szén-6-on alapulnak oligonukleotidok, tárgylemezen rögzített fluoreszkáló festékkel jelölték [49]. Ezután a PCR amplikonokat a chipre helyezzük és inkubáljuk, hogy lehetővé váljon a hibridizáció, és a detektálást a fluoreszcencia intenzitásának mérésével érjük el. Új DNS-szekvenálási technikák, például NGS alkalmazását próbálják felhasználni a HPV kimutatására [50]. Ezek az új technológiák lehetővé teszik a gyors, pontos diagnosztizálást, az új HPV-típusok és -változatok kimutatását, valamint nagy epidemiológiai vizsgálatokban történő felhasználást [51]. Ezen újszerű módszerek között van a piacon a 454 pryosequencing módszer (amelyet a HPV genotipizálásában teszteltek) [52], az ion proton szekvenálási technológiák [53] és számos más NGS technológia; amelyek nagy áteresztőképességűek.

Vita

A módszerek megválasztása

A bőr HPV-módszereinek összehasonlítása

Asztal 1 bemutatja a béta- és gamma nemzetségekből származó, a bőr HPV-típusai számára rendelkezésre álló molekuláris módszerek választását, amelyek nélkülözhetetlenek a HPV-típusok kimutatásához minden típusú bőrelváltozásból.