Nitro-zsírsavképződés és anyagcsere

Gregory R. Buchan

1 Farmakológiai és Kémiai Biológiai Tanszék, Pittsburghi Egyetem, Pittsburgh, PA 15261, USA

Gustavo Bonacci

2. CIBICI - CONICET, Departamento de Bioquímica Clínica Facultad de Ciencias Químicas (U.N.C.) Haya de la Torre y Medina Allende Ciudad Universitaria, Córdoba C.P. Szám: X5000HUA, República Argentina

Marco Fazzari

1 Farmakológiai és Kémiai Biológiai Tanszék, Pittsburghi Egyetem, Pittsburgh, PA 15261, USA

3. Fondazione Ri.MED, Via Bandiera 11, 90133 Palermo, Olaszország

Sonia Salvatore

1 Farmakológiai és Kémiai Biológiai Tanszék, Pittsburghi Egyetem, Pittsburgh, PA 15261, USA

Stacy Gelhaus Wendell

1 Farmakológiai és Kémiai Biológiai Tanszék, Pittsburghi Egyetem, Pittsburgh, PA 15261, USA

4. Klinikai Translational Science Institute, Pittsburghi Egyetem, Pittsburgh, PA 15261, USA

Absztrakt

A nitrosavsavak (NO2-FA) a redox jelátviteli utak pleiotrop modulátorai. Hatásukat a gyulladásos jelátvitelre nagyon részletesen tanulmányozták sejt-, állat- és klinikai modellekben, elsősorban exogén módon beadott nitro-oleinsav alkalmazásával. Bár sokat tudunk jelzésükről, az endogén NO2-FA képződés és anyagcsere viszonylag kevéssé ismert. Ez az áttekintés a jelenleg kialakult mechanizmusok ismertetésével, az endogén NO2-FA szint étrendi modulációjával, valamint az NO2FA és a megfelelő metabolitok metabolizmusának és kimutatásának útjaival kapcsolatban ismert.

Nitro-zsírsavképződés és anyagcsere

A nitrogén-oxid (• NO) metabolizmusa és a nitrogén-oxidok patofiziológiai körülmények között történő termelése nitrozáló (R-NO) és nitráló (R-NO2) fajokat eredményez, amelyek fehérjékkel, telítetlen zsírsavakkal és tioltartalmú kis molekulákkal, például glutationnal ( GSH) (1–4). A telítetlen zsírsavak nitrogén-dioxiddal (• NO2) történő nitrálása elektrofil, bioaktív lipideket hoz létre, amelyek kovalens Michael addíciós adalékokat képeznek nukleofil aminosavakkal, elsősorban ciszteinnel, amelyek megtalálhatók a transzkripciós szabályozó fehérjékben és az anyagcserében, a sejtjelzésben és a redox homeosztázisban szerepet játszó enzimekben. (5,6). Az NO2-FA utáni transzlációs módosítás (PTM) kimutatta, hogy mély funkcionális változásokhoz vezet (7,8). Emiatt az elmúlt évtizedben egyre nagyobb érdeklődés mutatkozott a nitro-zsírsavak (NO2-FA) pleiotróp jelzése iránt számos betegségmodellben, ami jelentős növekedést eredményezett a kialakulásukhoz vezető reaktív utak megértésében valamint adszorpciójuk, anyagcseréjük és pontos elemzésük bonyolultsága (5). Ez az áttekintés összefoglalja, mit tudtunk eddig az elektrofil NO2-FA in vitro és in vivo képződéséről és metabolizmusáról.

Zsírsavak nitrálása

(A) NO2-FA képződés bisz-allil-telítetlen zsírsavakból. (B) Konjugált linolsav nitrálása. A csillag a reaktív elektrofil szénatomokat jelöli.

Endogén nitro-zsírsavképződés állatmodellekben

NO nitrációs és nitrozációs reakcióban.

(A) NO2-től - oxidáció • NO2 formává, majd reakció • NO (B) vagy közvetlen nukleofil szubsztitúcióval.

Ezek a megállapítások semleges pH-n válnak relevánssá, ahol az NO2 nem képes HNO2-t létrehozni, és a nitráló és nitrozáló anyagok képződése a fémkatalízis következménye lehet. A cLA nitrálását az LPS intra-peritonealis injekcióval kiváltott akut peritonitis egérmodelljében írták le és izotóposan jelölt 15 N 18 O2 -. Ebben a tanulmányban az NO2-cLA-t endogén módon előállított 14 • NO2 képezte, de a 15 N 18 O2 beadása - az izotópok (15 N 18 O-16 O-cLA, 14 N 18 O-16 O-cLA és 15 N 16 O-16 O-cLA), jelezve, hogy az endogén módon keletkezett • NO reagál 15 N 18 O 2 -val - symN2O3-t képez in vivo (23). Ez az eredmény rávilágít az NO2 •/• NO2/• NO rendszer új szerepére, mint az NO2-FA és a nitrozáló intermedierek prekurzorának, függetlenül a pH-tól és a fémközpontok jelenlététől, a symN2O3 képződése és sztochasztikus homolízise révén. Az állati modellekben a nitroalkén képződésének mélyebb megismerése elősegíti az NO2-FA klinikai fejlődését, különösen az elődeik étrend-kiegészítőinek (pl. CLA és NO2 -/NO3 -) felhasználásával az endogén képződés ösztönzésére és jelátviteli potenciáljuk felkeltésére. (3,5).

NO2-FA képződés emberben

A nitrát (NO3 -), a nitrit (NO2 -) és a zsírsavak, például az olajsav (OA, 18: 1), a konjugált linolsav (cLA, 18: 2) és a linolénsav (cLnA, 18: 3) találhatók étrendi forrásokban, beleértve zöldségek, magvak és olajok, hús és tejtermékek. Az NO3 - és az NO2 további metabolizálása több nitrogén-oxidot eredményez, beleértve a nitrogén-dioxidot is (• NO2). A • NO2 által nitrálásra leginkább érzékeny zsírsavak konjugált diénszerkezettel rendelkeznek. Az étrendben való bősége miatt a cLA a domináns endogén zsírsav, amelyet nitrálva NO2-cLA képződik.

Az étrend is a cLA fő forrása, ahol elsősorban a tejtermékekben és a húsban található meg, és eredetileg az elhízásra, a testösszetételre, az inzulinérzékenységre gyakorolt metabolikus hatásai és a kardiovaszkuláris események csökkent kockázatával való összefüggése miatt ismerték el (34 A cLA az LA mikrobiom által elősegített izomerizációjának terméke cLA-ként emberekben és állatokban (35), valamint a bendőben Δ9-deszaturáz aktivitású baktériumok is vannak, amelyek képesek a vakcinát (transz-olajsav) cLA -vá metabolizálni (36). A túlsúlyos étrendi izomer a 9-cisz, 11-transz-cLA, míg a napraforgóolajból készült kereskedelmi készítmények 9-cisz, 11-transz és 10-transz, 12-cisz-cLA keverékét tartalmazzák (34). Több tanulmány megerősítette, hogy a cLA az elsődleges endogén zsírsav, amelyet az LA2-nél 5 nagyságrenddel magasabb nitrogénezéssel nitrálni kell, hogy NO2-cLA képződjön (17). Az NO2-cLA bazális metabolikus körülmények között képződik emberben és rágcsálókban. Ezenkívül az étrendi bevitel vagy a kiegészítés beadása növelheti az NO2-cLA szintet, valószínűleg a fent leírt nitrációs mechanizmusok miatt (18,37). A konjugált linolénsav (cLna, punicinsav, 18: 3) nitrálása is előfordul, és ez a gránátalma elsődleges zsírsavja (

72%); a cLna azonban sokkal alacsonyabb szinten szívódik fel az étrendben, mint a cLA (38) (3. ábra).

Annak érdekében, hogy jobban megértsük, hogy az étrend hogyan járul hozzá az NO2-cLA képződéséhez és a jelátvitelhez, egy kísérleti tanulmány orális 15 N-jelzett Na 15 NO3 - (1 g) és Na 15 NO2 - (20 mg) adagolását (1. kísérlet) és cLA-val (3) kezeli. g, 2. kísérlet) egészséges önkénteseken végeztük (18,39). Az önkénteseket randomizálták NO3 - vagy NO2 - csoportba (1. kísérlet) és a

Ebben a tanulmányban a klinikai válaszokat vizsgálták, hogy feltárják az étrendi lipid hatását a nitrogén-oxid anyagcserére és a kardiovaszkuláris válaszokra. A 15 NO3 - és 15 NO2 - étrend-kiegészítése támogatja a 15 • NO képződést 15 NO-deoxihemoglobin komplex elektroparamágneses rezonancia spektroszkópiás detektálásával mérve. 15 • Az NO-képződés csökkentette a szisztolés és az átlagos artériás vérnyomást, és gátolta a thrombocyta-funkciót az 1. kísérletben. A cLA együttes alkalmazása a 2. kísérletben csökkentette a plazma NO3 - és NO2 - szintjét, csökkentette a 15 • NO-deoxyhemoglobin képződését, NO2 - a a thrombocyta-aktiváció és az NO2 értágító tulajdonságai - miközben fokozza a 15 NO2-cLA képződését. Így az étrend-kiegészítő, a cLA együttes beadása jelentősen átirányítja az NO2 -/• NO-nak tulajdonított szívreakciókat alternatív útvonalakra (39).

Az endogén NO2-cLA képződés felfedezése emberben bazális körülmények között, valamint annak megnövekedett képződése és jelátvitele gyulladás és metabolikus stressz során kibővíti a NO jelátvitel farmakokinetikáját és hatókörét a guanilát-cikláz-függő cGMP-termelésen túl. Bár az NO2-cLA képződésének és szignalizációjának mechanizmusait in vitro és állatmodellekben, és bizonyos mértékig most emberben is vizsgálták, még mindig sok mindent nem tudunk. További vizsgálatok indokoltak annak megvizsgálására, hogy az étrend, az prekurzor kiegészítés és a mikrobiom hogyan befolyásolja az NO2-cLA képződést és a jelátvitelt, összehasonlítva az előre kialakított NO2-FA adásával, mint az NO3 -/NO2 - + cLA és NO2 kémiai és útvonal célpontjai -cLA nagymértékben változni fog.

NO2-FA metabolizmus és eloszlás

Az NO2-FA képződése, anyagcseréje, eloszlása és kiválasztása olyan metabolikus hálózatot tartalmaz, amely képes szabályozni ezen molekulák egyensúlyi állapotát és jelátviteli aktivitását mind bazális, mind kóros körülmények között (4. ábra). Az NO2-FA és a metabolitok kimutatása és mérése eleve kihívást jelent, mivel reverzibilis kovalens adduktokat képeznek a fehérjékben található nukleofil aminosavakkal és tiol tartalmú molekulákban, például GSH-ban. Ráadásul zsírsavfajként megkötik a hordozófehérjék, például az albumin (40) zsírsavmegkötő zsebeit, és részt vesznek a normális lipid anyagcserében és transzportban, miközben telítettségen, β-oxidáción mennek keresztül, és komplex lipidekké észtereződnek (41–44). Anyagcseréjük teljes ismeretére lesz szükség ahhoz, hogy teljes mértékben megértsék szerepüket különböző gyulladásos betegségek új terápiás szereként, és a legújabb tanulmányok kezdik feltárni farmakokinetikai profiljukat.

Az NO2-FA reverzibilis kovalens adduktokat képez reaktív tiolokkal, és beépülhet komplex lipidekbe is. Az NO2-FA szabad fajait és metabolitjait kimutatják a plazmában, a szövetekben és a vizeletben. Az NO2-FA-t a prosztaglandin-reduktáz nem-elektrofil nitroalkánokká redukálja, és mind a nitroalkánok, mind az alkének β-oxidáción mennek keresztül. A vizeletben dikarbonsavakat találtunk, amelyek ω oxidációval jöttek létre, valamint taurint és GSH-t tartalmazó konjugátumokat.

A többi zsírsavhoz hasonlóan a telítettség és a β-oxidáció termékeit, valamint az NO2-FA-Koenzim A konjugátumokat (NO2-FA-CoA) detektálták és jól jellemezték LC-MS/MS (44). Számos PK-tanulmány az NO2-OA-t használta az NO2-FA mintaként, mivel egy kettős kötés van, így könnyebben jellemezhető az anyagcsere; bár egyre több bizonyíték utal arra, hogy az NO2-cLA metabolizmus nagyon hasonló mintát követ. Az NO2-OA anyagcseréjéből származó domináns szabad zsírsavfajok a nitrostearinsav (NO2-SA) (44). Az NO2-SA egy nem elektrofil nitroalkán, amelyet az NO2-OA elektrofil kettős kötésének prosztaglandin-reduktáz 1 (PTGR1) telítettsége képez (45). Az NO2-OA és az NO2-SA számos β-oxidációs fordulaton megy keresztül, így dinor (C16), tetranor (C14) és hexanor (C12) fajok képződnek. Hasonló metabolitokat írtak le az NO2-cLA esetében, és ezeket a fajokat állatmodellekben, valamint az emberi plazmában és vizeletben alap körülmények között és kiegészítés után detektálták (37). Egyéb oxidált és nitrált termékeket (pl. Nitro-nitrát, hidroxil-NO2-FA) különféle vizsgálatok során figyeltek meg, de részletesen nem tárták fel őket (46–48) (4. ábra).

Egy nemrégiben készült tanulmány még részletesebb jelentést adott az NO2-FA metabolizmusáról, és felfedezte a taurin és a szulfo-adduktokat, valamint az ω-oxidációs termékeket, amit a redukált és elektrofil NO2-FA dikarbonsav-metabolitjai bizonyítanak (49). Ezen termékek közül sok megtalálható mind rágcsálókban, mind emberekben. Az NO2-FA könnyen képez adduktokat a GSH-val, és ezeket az adduktumokat multi-drogrezisztencia transzporterek exportálják a sejtekből (50,51), és a GSH adduktív metabolitjait a vizeletben detektálják, mint N-acetilcisztein és cisztein NO2-FA adduktjait (37,49). ). Ezek a termékek egyensúlyban vannak a szabad NO2-FA-val és a vizeletben található megfelelő metabolitokkal, és higany-kloriddal történő tiolreakcióval könnyen kiszoríthatók, nagyságrenddel növelve a szabad NO2-FA-készletet (4. ábra) (4. ábra).

Az NO2-FA metabolizmusának és eloszlásának bonyodalmai lassan feloldódnak, mivel beszámoltak arról, hogy az NO2-FA beépül a komplex lipidekbe a sejtekben és in vivo (4. ábra). Az NO2-FA-tartalmú trigliceridek (TG) képződését a TG in vitro savas gyomoremésztése, valamint az adipociták és a patkányplazma NO2-OA-pótlása után elemezték (41), míg az endogén módon képződött NO2-FA és nitrooxidált tartalmú foszfolipidek izolált szív mitokondriumokban és kardiomioblasztokban mutattak ki 1-es típusú diabetes mellitus állatmodellben (48). Ezek az adatok azt mutatják, hogy NO2-FA-tartalmú komplex lipidek képződhetnek a gyomor emésztése és a gyulladásos állapotok után.

18 × nagyobb arányban MG + DG vs. TG. Az NO2-cLA profilja hasonló volt az NO2-OA-hoz; az általános észterezés azonban 10-20% -kal alacsonyabb volt. Összességében alacsonyabb szintű beépülés volt a foszfolipidekbe, mint a glicerin-lipidek (41). Ezek az adatok azt mutatják, hogy az NO2-FA és metabolitjai eloszlanak és beépülnek a komplex lipidekbe, amelyek a lipáz hidrolízise után elektrofil fajokat képesek felszabadítani, és lipoproteinekként a távoli szövetekbe juttathatják el, ezáltal modulálva a sejtek homeosztázisát és a szöveti jelátvitelt.

Következtetések és jövőbeli tanulmányok

Az in vivo zsírsav-nitrálás mechanizmusai továbbra sem tisztázottak; az utóbbi években azonban jelentős előrelépések történtek a nitrálásban szerepet játszó molekuláris közbenső anyagok, molekuláris célpontjai és az ezekből származó reakciótermékek tisztázása érdekében. A cLA mint elsődleges endogén NO2-FA megerősítése, a szabad endogén NO2-OA helyes mérése, valamint az NO2-FA komplex lipidekbe való beépülésének új elemzései segítették az NO2-FA képződés általános képének kialakítását, és jobb betekintést nyújtottak a e pleiotróp gyulladáscsökkentő terápiák farmakokinetikája és farmakodinamikája. A vizelettel kiválasztott radioaktivitás és metabolitok elemzése azt mutatta, hogy a 10-NO2-OA 24 órán belül nagymértékben felszívódik és gyorsan metabolizálódik (49). Az NO2-FA bélfelszívódására és a máj (első passzus) metabolizmusának értékelésére összpontosító jövőbeni vizsgálatokra van szükség, mivel meg kell oldaniuk az NO2-OA biológiai hozzáférhetőségéről szóló kezdeti jelentések közötti eltéréseket (

6%) (nem publikált adatok) és a [14 C] -NO2-OA patkányvizsgálatban jelentett vizelet 35% -os helyreállítása (49). Előfordulhat, hogy az NO2-FA jelentős része komplex lipidekben tárolódik és eloszlik a különböző szövetekben. Ezek a tanulmányok az új NO2-FA metabolitok további jellemzésével és a következő generációs NO2-FA származékok (54) terápiás vizsgálatával tovább bővítik ismereteinket a terápiás jelátviteli molekulák ezen pleiotróp osztályának kialakulásáról és anyagcseréjéről.

Fénypontok

A nitrogén-zsírsav (NO2-FA) képződése nagymértékben függ a környezeti tényezőktől, beleértve a pH-t, az oxigénfeszültséget és a reaktív anyagok jelenlétét.

Az NO2-cLA a leggyakoribb, endogén NO2-FA.

Az NO2-cLA az anyagcsere során és gyulladásos stressz körülményei között keletkezik.

Az NO2-FA abszolút mérését bonyolítja a fehérje hozzáadása, az anyagcsere (redukció, β-oxidáció, konjugáció) és a komplex lipidekbe való beépülés.

Köszönetnyilvánítás.

Ezt a munkát az alábbi források finanszírozták: R21AI122071 (SGW), F31HL142171 (GJB), Fondazione Ri.Med, Olaszország (MAF) és Fondo para la Investigación Cientifica y Tecnológica (FONCyT) és Prestamo BID Proyetcto de Investigación en C Tecnologia (PICT) támogatás 2013-3288 (GB).

Lábjegyzetek

Kiadói nyilatkozat: Ez egy szerkesztetlen kézirat PDF-fájlja, amelyet kiadásra elfogadtak. Ügyfeleink számára nyújtott szolgáltatásként a kéziratnak ezt a korai változatát biztosítjuk. A kézirat átmásolásán, szedésén és a kapott bizonyíték felülvizsgálatán átesik, mielőtt a végleges formában megjelenne. Felhívjuk figyelmét, hogy a gyártási folyamat során olyan hibákat fedezhetnek fel, amelyek befolyásolhatják a tartalmat, és a naplóra vonatkozó minden jogi felelősségvállalás vonatkozik.

Érdeklődési nyilatkozat. Az SGW elismeri a Complexa, Inc. pénzügyi érdekeltségét.