A női patkányok brómozott égésgátlók környezetileg releváns keverékének való kitettsége a petefészket célozza meg, befolyásolva a folliculogenezist és a szteroidogenezist Akadémiai kutatási cikk a "Biológiai tudományok"

A biológiai tudományok tudományos cikkének hasonló témái, tudományos cikk szerzője - P. L. C. Lefevre, R. G. Berger, S. R. Ernest, D. W. Gaertner, D. F. K. Rawn és mtsai.

Akadémiai kutatási cikk "A nőstény patkányok környezeti szempontból releváns brómozott égésgátlók keverékének való kitettsége a petefészket célozza meg, befolyásolva a folliculogenezist és a szteroidogenezist"

A REPRODUKCIÓ BIOLÓGIÁJA (2016) 94 (1): 9, 1–11 Megjelent online, 2015. november 25-i nyomtatás előtt. DOI 10.1095/biolreprod.115.134452

A női patkányok brómozott égésgátlók környezetileg releváns keverékének való kitettsége a petefészket célozza meg, befolyásolva a folliculogenezist és a szteroidogenezist1

Pavine L.C. Lefevre, 3 Robert G. Berger, 3 Sheila R. Ernest, 3 Dean W. Gaertner, 5 Dorothea F.K. Rawn, 5 Michael G. Wade, 6 Bernard Robaire, 3,4 és Barbara F. Hales2,3

3D farmakológiai és terápiás osztály, McGill Egyetem, Montreal, Quebec, Kanada

4 Szülészeti és Nőgyógyászati Tanszék, McGill Egyetem, Montreal, Quebec, Kanada

5Élelmiszer-kutatási részleg, Kémiai Biztonsági Iroda, Egészségügyi Termékek és Élelmiszer-ágazat, Health Canada, Ottawa,

6 Környezet-egészségügyi Tudományos és Kutatási Iroda, Sugárzási és Kutatási Igazgatóság, Health Canada, Ottawa, Ontario, Kanada

1Támogatja az RHF100625 támogatás, amelyet a kanadai Egészségügyi Kutatóintézetek (CIHR) Humán Fejlesztési, Gyermek- és Ifjúságegészségügyi Intézete nyújtott be. R.G.B. az NSERC Create díjat kapta a Quebec-Sante Fonds de recherche du Sands ösztöndíjának Reseau Quebecois en Reproduction és PLCL-től. B.R. és B.F.H. James McGill professzorok. A Virginia Egyetem Reprodukciós Ligand Assay and Analysis Core Kutatási Központját az Eunice Kennedy Shriver NICHD/NIH (SCCPIR) U54-HD28934 támogatása támogatja. Levelezés: Barbara F. Hales, Farmakológiai és Terápiás Tanszék, McGill Egyetem, 3655 Promenade Sir William Osler, Montreal, QC, H3G 1Y6, Kanada. E-mail: [email protected]

Beérkezett: 2015. augusztus 12. Első döntés: 2015. szeptember 28. Elfogadva: 2015. november 13.

elSSN: 1529-7268 http://www.biolreprod.org ISSN: 0006-3363

androgének, brómozott égésgátlók, kataláz, endokrin rendellenességek, follikulogenezis, HBCDD, inzulinszerű 3-as faktor, petefészek, oxidatív stressz, PBDE, szteroidogenezis, toxikológia

Az égésgátló vegyi anyagok nagy mennyiségben termelődnek, elterjedtek a környezetben, és mindegyikünkben kimutathatóak, és bioakkumulatívak [1]. Ezeket a vegyszereket számos olyan termékbe építik be, amelyek jellemzően fokozottan tűzveszélyesek, például műanyagok, textíliák és habok; az irodai és otthoni elektronikai cikkek, a szintetikus építőanyagok, valamint a bútorok vagy gépjárművek alkatrészeinek tömegének legfeljebb 30% -át teszik ki [1]. Az égésgátlók fő osztályát a brómozott égésgátlók (BFR) képviselik, beleértve a polibrómozott difenil-étereket (PBDE-ket) és a hexabróm-ciklododekánt (HBCDD) [1]. Idővel ezek az égésgátlók kimosódnak a háztartási környezetbe, ismételt expozíciót eredményezve belégzéssel és lenyeléssel [2, 3]. Mivel a BFR-ek lipofilek és perzisztensek [4], bioakkumulatívak az emberi anyatejben, szérumban és zsírszövetekben [5], és táplálékláncokon keresztül biomagnifikálnak [3]. Észak-Amerikában több mint 10 éve tiltott PBDE-ket számos emberi testfolyadékban és háztartási porban is kimutattak [6, 7].

Egyre több bizonyíték van arra, hogy a BFR-ek endokrin rendellenességek, befolyásolják az androgén, az ösztrogén és a pajzsmirigyhormon aktivitását [8]. Emberben a férfi reprodukcióra gyakorolt káros hatások a BFR-eknek való kitettséggel társulnak, és magukban foglalják a szteroid hormonok szintjének változását [9-11], valamint a spermiumok számának és minőségének csökkenését [12-14]. A PBDE-k méhen belüli és laktációs expozíciója a cryptorchidizmus fokozott előfordulásával jár [15, 16]. Serdülő lányoknál a BFR magas szérumszintje a menarche korábbi korához kapcsolódik [17-19]. Korábbi vizsgálatok arról számoltak be, hogy a follikuláris folyadékban vagy a szérumban a PBDE-k magas szintjének kimutatása hosszabb időre teherbe esik [20] és az embrió beültetésének sikertelenségével in vitro megtermékenyítés után [21].

Az állatmodellekben a BFR-ek hatására vonatkozó legtöbb tanulmány az egyes rokonok vagy kereskedelmi keverékek expozíciójának következményeire összpontosított. Ezek a tanulmányok azt mutatják, hogy a BFR-ek megzavarják az endokrin rendszert [8, 22], és cukorbetegséggel, rákkal, valamint neurobehaviorális és fejlődési rendellenességekkel társulnak [23]. Az expozíció időtartama azért fontos, mert a BFR-ek perinatális expozíciója egyértelmű zavarokat eredményez a pubertás időzítésében és a gametogenezisben hím és nőstény patkányokban

[24-27]. Az állatkísérletek emberi egészséggel való összefüggésének egyik nehézsége az, hogy az emberi expozíció a BFR-ek komplex keverékeinek a környezetben található, nem pedig specifikus, egyedi rokon vegyületeknek. Megmutattuk, hogy a felnőtt hím patkányok környezeti szempontból releváns BFR keveréknek való krónikus expozíciója, amely utánozza a házi por relatív kongener-szintjét, a máj és a vese megnagyobbodását, valamint a pajzsmirigyhormon-paraméterek megváltozását eredményezte a reproduktív rendszerre gyakorolt hatás hiányában [ 28.] Nem észleltek változást az ösztrikus ciklikusságban vagy a terhesség kimenetelében, mint például a párzási és termékenységi indexek vagy az élő magzatok száma, nem figyeltek meg ugyanezen BFR-keverékkel etetett nőstény patkányokban a párzás előtt és a terhesség alatt [29]. Sertés antrális tüszőkkel végzett in vitro vizsgálatok azonban kimutatták, hogy a szteroid hormon termelését és a szteroidogén enzimek expresszióját befolyásolják az egyes PBDE-rokonok [30], metabolitjaik [31], vagy az emberi szérumban kimutatott PBDE-ket tükröző keverék [32].

Többféle magyarázat lehet az epidemiológiai vizsgálatok, az in vivo állatkísérletek és az in vitro vizsgálatok eredményeinek eltérésére. Az egyik lehetőség, hogy fajkülönbségek vannak; azonban a BFR-ek hasonló endokrin rendszert károsító tevékenységekkel rendelkeznek sokféle fajban [8]. A második lehetőség az, hogy az ilyen vegyi anyagok női reprodukcióra gyakorolt hatásainak értékelésére szolgáló szokásos vizsgálati eljárások nem fedezhetik fel a petefészek működésére gyakorolt fontos hatásokat. Jelen vizsgálat célja annak meghatározása, hogy a BFR-ek megcélozzák-e a patkány petefészkét. E cél elérése érdekében a petefészek működését megvizsgáltuk a nőstény Sprague-Dawley patkányoknál, amelyek a párzás előtt és a vemhesség alatt egy környezeti szempontból releváns BFR keveréket tápláltak, és amelyben nem észleltek jelentős változásokat az ösztrikus ciklikusságban, a párosításban vagy a termékenységben [29].

ANYAGOK ÉS METÓDUSOK

BFR keverékkészítmény

A BFR keverék elkészítését korábban leírtuk [28, 29]. Röviden, három technikai PBDE-keveréket (DE-71, DE-79 és BDE-209) és egy HBCDD-keveréket kombináltunk, így a PBDE-rokonok és a HBCDD-k aránya összehasonlítható volt a bostoni háztartási porban megfigyelt mediánszinttel [33]. Ezt a BFR keveréket izoflavonmentes étrendbe építették be (Teklad Global 2019; Harlan Laboratories). Az étrendeket úgy alakítottuk ki, hogy kilogrammonként 0, 0,75, 250 vagy 750 mg BFR-keveréket tartalmazzanak. Az egyes kísérleti állapotokból étrendmintákat gyűjtöttünk, és a BFR-tartalmat gázkromatográfiával/tömegspektrometriával igazoltuk a korábban leírtak szerint [34]. Ezeket a BFR-rel kiegészített étrendeket úgy tervezték, hogy 0, 0,06, 20 és 60 mg/testtömeg/nap névleges adagokat adjanak ki, feltételezve, hogy a napi élelmiszer-fogyasztás 80 g/testtömeg-kg. A legalacsonyabb dózist becsülték a maximális emberi expozíció szoros közelítésére a gyermekek 100 mg/nap porfelvételi aránya (16,5 kg testtömeg), valamint az emberek és rágcsálók közötti dózis (ember és patkány testfelület aránya) alapján. 1: 6,3) [33, 35].

Állatok és kezelés

Szűz nőstény Sprague-Dawley patkányokat (tömeg, 200-250 g) a Charles River Laboratories-től szereztünk be. Az állatokat egyenként a McGill Egyetem Állatforrás-központjában helyeztük el 20 ° C-on, 12 l: 12 d-os fotoperiódus alatt. Az ételt és a vizet ad libitum szolgáltatták. Minden állatkísérletet a Kanadai Állattenyésztési Tanács által a 4456 protokoll szerint készített, a kísérleti állatok gondozására és felhasználására vonatkozó útmutatóban ismertetett eljárásoknak és elveknek megfelelően végeztek. A kontroll étrendhez való 1 hetes akklimatizálódást követően nőstény patkányokat véletlenszerűen a négy kísérleti körülmény egyikéhez rendeltük (csoportonként n = 35-38), és párzás előtt 2-4 hétig BFR-kiegészített étrendet tápláltunk. Ebben az időszakban az ösztrikus ciklikusságot a hüvelyi citológia elemzésével értékelték [36]. A proestrus nőstényeket bizonyítottan tenyésztett hím Sprague-Dawley hím patkányokkal (kontroll étrenden tartottuk) egy éjszakán át ketrecbe helyeztük. A terhességi napot (GD) 0 jelölték ki annak a napnak, amikor spermium-pozitív hüvelyi kenetet észleltek. Az inszeminációt követően a nőstények folytatták a megfelelő étrendet az eutanáziáig a GD 20-on.

A gátakat CO2-elfojtással eutanizálták, majd ezt követően szívszúrás útján exsanguálták a GD 20-on. A petefészkeket eltávolítottuk és lemértük. A jobb petefészket 4% paraformaldehidben rögzítettük, míg a bal oldali -80 ° C-on tároltuk a génexpressziós elemzést. A teljes vért egy Vacutainer SST-be (BD Biosciences) vittük át, hagytuk alvadni 30 percig szobahőmérsékleten, majd 4 óránál hosszabb ideig jégen tartottuk, amíg 1300 x g-vel 20 percig centrifugáltuk. A szérumot alikvotizáltuk és -80 ° C-on tároltuk.

A BFR szérumszintek mérése

1 g-ot felolvasztottunk és 50 ml-es üvegcentrifuga csövekbe lemértük. Mindegyik mintát helyettesítő standardokkal erősítettük (tizenkét 13C12-jelölt PBDE-rokon [BDE-15, BDE-28, BDE-47, BDE-77, BDE-99, BDE-100, BDE-126, BDE-138, BDE-153, BDE-154, BDE-183 és BDE-209; Cambridge Isotope Laboratories] és a 13C12 a-, b- és y-HBCDD-vel jelölt; Wellington Laboratories). A mintákat homogenizáltuk, és az extraktumokat megtisztítottuk a korábban leírtak szerint [34]. A dezaktivált Florisil oszlopokból (60-100 mesh; Fisher Scientific) a PBDE-ket 70 ml hexánnal eluálva egy második gömblombikot helyezünk a Florisil oszlop alá, és a HBCDD izomereket 70 ml diklór-metán: hexán eleggyel eluáljuk. (30:70, v/v). Mindkét frakciót rotációs bepárló alkalmazásával körülbelül 1 ml-re csökkentettük. A PBDE frakciót v-bevágású fiolába vittük, enyhe nitrogénárammal szárazra pároltuk, izo-oktánban újra hígítottuk és összekevertük. A végső izooktán-extraktumot analitikai célokra kromatográfiás fiolába vittük. A HBCDD frakciót hasonlóan v-bevágású fiolába vitték, de csak majdnem szárazra vitték (

50 il) enyhe nitrogénáramot használunk, mielőtt az a-, b- és y-HBCDD C122H18Br6 analógjait hozzáadnánk teljesítmény-standardként. A mintákat ezután elszívóba helyezték, ahol a szárazság eléréséig maradtak. Minden száraz HBCDD-kivonathoz 100 ul metanol: víz (80:20, v/v) adunk, és az üveget összekeverjük és kromatográfiás fiolába helyezzük. A szérum minta kivonatainak hígítására volt szükség azoknál a patkányoknál, akiket magas koncentrációjú PBDE-kkel és HBCDD-vel tápláltak (pl. 20 és 60 mg/kg/nap), hogy biztosítsák a pontos koncentrációméréseket. Az elemzést és a minőségbiztosítást a korábban leírtak szerint végeztük [29, 34].

Tüszőmorfometriai elemzések

A tüszők átmérőjét és területeit minden szakaszban, valamint az antrális tüszők granulosa és theca sejtrétegének szélességét ImageJ szoftver segítségével 3-10 tüszőben és petefészekben, öt kísérleti csoportban pedig kísérleti csoportban mértük [38] . Az átmérőket következetesen, látható petesejtet tartalmazó szakaszokban mértük, és azokat a leghosszabb távolságként rögzítettük, amely a petesejten átívelő szemközti tüszőszélek közötti egyenes vonal mentén történt. A területmérések magukban foglalták a theca sejtréteget. A granulosa és a theca rekesz vastagságát ugyanazon kritériumok alapján végeztük, mint az átmérőméréseknél.

Fehérje lokalizáció immunhisztokémiai módszerrel

A szérum hormonszintek számszerűsítése

A szteroidhormonokat, beleértve a pregnenolont, a progeszteront, a 17-OH pregnen-olont, a 17-OH progeszteront, a dihidroepiandroszteront, az androszténdiont, a tesztoszteront és a dihidrotesztoszteront (DHT), 100 il szérummintákban mértük folyadékkromatográfiával kettős tömegspektrometriával (operálta: az OpAns LLC vállalat) egy Agilent 1200 kapilláris nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás rendszerrel, amely egy Agilent Triple Quad LC/MS-hez kapcsolódik (6430-as modell). A follikulus-stimuláló hormon (FSH) és a luteinizáló hormon (LH) szérumszintjét a Luminex 2000IS platformon mértük a Milliplex patkány hipofízis panel (Millipore) és ösztradiol alkalmazásával radioimmunassay (Siemens Medical Solutions Diagnostics) segítségével a Ligand Assay and Analysis Core Laboratóriumban (Virginia Egyetem Reprodukciós Kutatóközpontja). Patkány anti-Mullerian hormon (AMH) ELISA készleteket (Cusabio Life Sciences) használtunk az AMH szérumszintjének kvantifikálására. A hormon és a gonadotropin szintjét kvantitatívan meghatároztuk, kísérleti csoportonként 16-21 szérummintában.

Fehérje mennyiségi meghatározása Western Blot módszerrel

A génexpresszió számszerűsítése

A teljes RNS-kivonást 30 mg petefészekszövetből az RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen) segítségével végeztük a gyártó ajánlása szerint.-

A statisztikai elemzéseket a SigmaPlot Software (Systat Software) segítségével végeztük. Az adatokat egyirányú ANOVA-val elemeztük, majd post hoc Holm-Sidak teszttel hasonlítottuk össze a kezelt és a kontroll állatokban mért paraméterek átlagát. Amikor a variancia és a normalitás feltételezésének tesztje kudarcot vallott, az adatokat log transzformálták és újra tesztelték. Amikor az átalakulás után a homoszkedaszticitás és a normalitás még mindig nem volt kielégítve, az adatokat Kruskal-Wallis ANOVA segítségével ismételten teszteltük. A tüszőszám statisztikai elemzéséhez az elsődleges és a másodlagos tüszőket egyesítették, és preantrális tüszőkké sorolták. A tüszőszámokat Pearson-együtthatóval elemeztük. A szignifikancia szintjét P-re állítottuk