Allergiás reakciók összehasonlítva a BN és a Wistar patkányokkal szájon át történő ovalbumin expozíció után

Kutatási cikk

Teljes cikk
Ábrák és adatok
Hivatkozások
Kiegészítő
Idézetek
Metrikák
Újranyomtatások és engedélyek
PDF

Absztrakt

A kutatók állatmodellek, köztük patkányok, egerek és tengerimalacok alkalmazását vizsgálták az allergén potenciál felmérésére (Knippels et al., 1999a; Piacentini et al., 2003; Vinje et al., 2009). Néhány hátrány korlátozza a tengerimalacok megfelelő modellként való alkalmazását, ideértve az immunofiziológia jelentős különbségeit más fajokhoz képest, valamint az immunrendszerének tanulmányozásához szükséges eszközök hiányát (Ahuja et al., 2010). Egerek esetében az allergiás reakciók természetes összetettsége megnehezíti egyetlen megbízható marker megtalálását a fehérje szenzibilizációs potenciáljának számszerűsítésére (Aldemir et al., 2009). A patkányoknak azonban számos előnye van a többi állatmodellhez képest, különösen abban a tekintetben, hogy a toxicitási vizsgálatok során az egyik leggyakrabban használt faj. Ezek magukban foglalják az immunrendszerükkel kapcsolatos kellő mennyiségű tudást és az immunrendszerrel kapcsolatos vizsgálatokhoz szükséges számos eszköz rendelkezésre állását (Penninks és Knippels, 2001).

Feltétlenül meg kell jegyezni, hogy jelenleg az új fehérjék allergén hatásának értékelése során az expozíció egyik megfelelőbb módját sem igazolták. Elméletileg a fehérje parenterális beadása elkerüli az orális tolerancia kialakulását, és egyértelműen jelzi a fehérjék eredendő képességét az IgE antitest válaszok kiváltására. Ennek ellenére el kell ismerni, hogy a szenzibilizációs időszak alatti természetes táplálkozási módot nem vették figyelembe (Dearman és Kimber, 2001). Nyilvánvaló, hogy az ételallergének anafilaxiát válthatnak ki gyomor-, nyelv-, orr- vagy bőrön keresztül; ennek ellenére az ételallergének orális expozíciója gyakran előfordul, az élet legkorábbi szakaszától kezdve (Dunkin et al., 2011). Ezért a jelen tanulmányban megvizsgáltuk az allergiás reakciók mértékét összehasonlítva a BN és a Wistar patkányokkal az ovalbumin orális expozícióját követően.

Anyagok és metódusok

Állatok és allergének

A nőstény Wistar és beltenyésztett BN patkányokat (mindegyik 4 hetes) a Vital River Company-tól (Peking, Kína) vásároltuk, és a vásárlás előtt tojásmentes étrenden tartottuk őket. Valamennyi patkányt a vizsgálat megkezdése előtt legalább 5 napig akklimatizáltuk. Az állatokat specifikus kórokozóktól mentes körülmények között tartottuk 23 (± 3) ° C-on és 40–70% relatív páratartalom mellett, 12 órás világos/sötét ciklus mellett. Valamennyi patkányt négyes csoportokban rozsdamentes acél drótketrecekben helyeztük el és adtuk meg ad libitum hozzáférés a kereskedelemben kapható tojásmentes rágcsáló-étrendhez és desztillált vízhez. A kínai Pekingi Városi Tudományos és Technológiai Bizottság (NO. SYXK 2010-0036) jóváhagyta az itt leírt összes állatkísérletet.

Szenzibilizáció és kihívás

A patkányokat ovalbuminnak (OVA, tételszám: A5503, Sigma, St. Louis, MO) szondázás útján tettük ki az 1. és a 14. napon, majd ezt követően naponta a 15. és a 42. nap között; az alkalmazott dózis 150 ug OVA/testtömeg g (testtömeg: 1 ml/patkány) volt. A kontrollok minden alkalommal 1 ml sóoldatot kaptak. Ezen indukciós periódus után a patkányokat 1 hétig nem tették ki OVA-nak. A 49. napon az összes OVA-szenzibilizált állatot orálisan beadtuk OVA-oldattal desztillált vízben (750 ug OVA/g [BW], térfogat = 2 ml/patkány); a kontroll patkányok 2 ml sóoldatot kaptak.

A 0., 14., 28., 35. és 42. napon az orbitális plexusból vérmintákat vettünk. Mindegyik mintát 1 órán át hagytuk szobahőmérsékleten, majd 3000 × g (10 perc, 4 ° C) hőmérsékleten centrifugáltuk. szérumok antitestanalízishez. A 0. nap szérumait egyesítettük, és negatív kontrollként használtuk. Az összes egyesített és egyesített szérumot -20 ° C-on tároltuk az elemzésig. A plazma hisztaminszint meghatározásához és a sejtek differenciálszámához külön mintákat gyűjtöttünk (ugyanazon a napon) hűtött EDTA-K2 csövekbe.

Antitest (IgE, IgG és IgG2a) titer meghatározása

Az összesített 0. nap szérumot negatív kontrollként használtuk, és ezeket a mintákat 1: 4 hígítással mértük. A negatív kontrolllyukak átlagos abszorbanciája (amelyhez a szórás háromszorosát adtuk) adta a referenciaértéket a titer meghatározásához (log2-titerként kifejezve) minden tesztszérum-mintában. Minden tesztszérum esetében a legtávolabbi szérumhígítás reciprokját, amely a referenciaértéknél nagyobb abszorbancát eredményezett, ellenanyag-titerként fogadtuk el.

A plazma hisztaminszintjének meghatározása

A vért 30 perccel az OVA vagy sóoldat orális expozíciója után vettük fel a 14., 28. és 42. napon. A hűtött csövekbe gyűjtött patkányok vérmintáit 3000 × g (10 perc, 4 ° C) hőmérsékleten centrifugáltuk, hogy plazma alikvotákat kapjunk, és tároltuk. -80 ° C-on az elemzésig. A plazma hisztamin szintjét ezután egy patkány hisztamin (HIS) ELISA kit (H026-10 tétel, Groundwork Biotechnology Diagnostics Ltd., San Diego, CA) segítségével határoztuk meg, a gyártó utasításainak betartásával. Ebben az esetben az egyes üregek optikai sűrűségét 450 nm-en mértük az automatizált mikrolemez-olvasóban. A készlet érzékenységi szintje 0,5 ng/ml volt.

Differenciálsejtek száma

Az 50. napon kapott vérmintákat EDTA-t tartalmazó hűtött csövekbe gyűjtöttük és 4 órán belül elemeztük. A vérben lévő bazofilek, eozinofilek és neutrofilek számát Animal Hematology System (Hemavet 950 típus, Drew Scientific Inc., Dallas, TX) segítségével határoztuk meg.

A vérnyomás meghatározása

A 49. napon az összes OVA-szenzibilizált patkányt szájon át 2 ml OVA-oldattal desztillált vízben (750 ug/g · BW) fertőztük; a kontroll patkányok 2 ml sóoldatot kaptak. A kísérletek alatti stressz elkerülése érdekében a patkányokat a szenzibilizációs periódus alatt a vérnyomás-mandzsettához igazították. A nagy dózisú stimuláció előtt megmérték a patkányok vérnyomását. A mérési periódus alatt a patkányokat egy kis hőszigetelő csővel ellátott csőbe zártuk, amelyet 20 ° C-on tartottunk. Felfújható nyomó mandzsettát tettek a farok köré, és disztális szalaggal ellátott szenzort használtak a szisztolés vérnyomás rögzítésére. A vérnyomást egy non-invazív vérnyomásmérő mandzsettával (BP-98A típus, Softron, Tokió, Japán) határoztuk meg, 7 órás időközönként.

Szövettani elemzés

Az állatokat méhnyak diszlokációval eutanizáltuk 24 órával az orális provokáció után (azaz az 50. napon). Boncoláskor mindegyik patkány szívét, máját, lépét, tüdejét és veséjét semleges foszfáttal pufferolt 10% (v/v) formaldehidben tartósítottuk és paraffin viaszba ágyazottuk. A tüdő esetében ez fixálóval történő felfújás után következett be. Ezután a metszeteket (6 µm vastagságban) standard protokollok segítségével készítettük, majd a szöveteket hematoxilinnal és eozinnal (Sigma) festettük.

Statisztikai analízis

A csoport antitest titereit, a plazma hisztamin szintjét és az immunsejt altípus számát statisztikailag összehasonlítottuk kétfarkú Student's t-teszt az SPSS 13.0 programban (SPSS Inc., Chicago, IL). A különbségeket statisztikailag szignifikánsnak tekintették o-értékek ≤ 0,05.

Az OVA-val fertőzött állatok vérnyomás-változásainak értékeléséhez referenciaértékként a kontroll patkányoknál tapasztalt vérnyomásértékek 95% -os megbízhatósági tartományának felső és alsó határát használtuk. A vérnyomás csökkenését akkor tekintették jelentősnek, amikor a nyomás értéke a 95% -os konfidencia tartomány alsó határán kívül esett (Knippels et al., 1999b).

Eredmények

OVA-specifikus antitest (IgE, IgG és IgG2a) titerek

Az expozíció megkezdése előtt vérmintákat vettünk és szérummintákat készítettünk. A szérumokat egyesítettük és negatív kontrollként használtuk az ELISA tesztekben. OVA-val történő szájon át történő szenzibilizálás után az OVA-specifikus IgE válaszok kimutathatók a BN és a Wistar patkányokban a 0., 14., 28. és 42. napon. a 28. napon az orális expozíció megkezdése után (1a. ábra: log2 titer = 1,48 ± 0,42 [átlag ± SD]), majd kissé csökkent. Wistar patkányok esetében az OVA-specifikus IgE válaszok a 14. naptól kezdve voltak kimutathatók, a maximális válaszok pedig a 42. napon voltak kimutathatók (1a. Ábra: log2 titer = 1,62 ± 0,28).

Online közzététel:

1. ábra: Hatások az OVA-specifikus antitest szintekre. (A) IgE, (b) IgG és (c) IgG2a válasz szintje fiatal nőstény BN és Wistar patkányokban az OVA orális expozícióját követő időszakban. Az OVA-t BN patkányoknak (♦) és Wistar (▪) patkányoknak juttatták el az 1. és a 14. napon, majd ezt követően naponta a 15. és a 42. nap között. Ugyanakkor a kontroll BN patkányok (▴) és a Wistar patkányok (•) megkapták a azonos térfogatú sóoldat. Az adatokat csoportonként hat patkány log2 titerének átlagában (± SD) mutatjuk be. a BN vagy b Wistar patkányok esetében az OVA-nak kitett csoport szignifikánsan eltér a o 1. ábra: Hatások az OVA-specifikus antitest szintekre. (A) IgE, (b) IgG és (c) IgG2a válasz szintje fiatal nőstény BN és Wistar patkányokban az OVA orális expozícióját követő időszakban. Az OVA-t BN patkányoknak (♦) és Wistar (▪) patkányoknak juttatták el az 1. és a 14. napon, majd ezt követően naponta a 15. és a 42. nap között. Ugyanakkor a kontroll BN patkányok (▴) és a Wistar patkányok (•) megkapták a azonos térfogatú sóoldat. Az adatokat csoportonként hat patkány log2 titerének átlagában (± SD) mutatjuk be. a BN vagy b Wistar patkányok esetében az OVA-nak kitett csoport szignifikánsan eltér a o Allergiás reakciók összehasonlítva a BN és a Wistar patkányokkal orális ovalbumin expozíció után

Online közzététel:

2. ábra A hisztamin felszabadulására gyakorolt hatás. Kibocsátás fiatal nőstény (a) BN és (b) Wistar patkányokban orális expozíció után OVA-val vagy fiziológiás sóoldattal az 1. és 14. napon, majd ezt követően naponta a 15. és a 42. nap között. A hisztamin szintjét a plazmában ELISA segítségével mértük. Megmutatjuk az átlagértékeket (ng/ml) 95% CI (konfidencia intervallum) mellett a különböző csoportoknál. * Jelentősen eltér a o 2. ábra A hisztamin felszabadulására gyakorolt hatás. Kibocsátás fiatal nőstény (a) BN és (b) Wistar patkányokban orális expozíció után OVA-val vagy fiziológiás sóoldattal az 1. és 14. napon, majd ezt követően naponta a 15. és a 42. nap között. A hisztamin szintjét a plazmában ELISA segítségével mértük. Megmutatjuk az átlagértékeket (ng/ml) 95% CI (konfidencia intervallum) mellett a különböző csoportoknál. * Jelentősen eltér a o Allergiás reakciók összehasonlítva a BN és a Wistar patkányokkal szájon át történő ovalbumin expozíció után

Online közzététel:

3. ábra: A granulocita szintre gyakorolt hatás. Az (a) bazofilek, (b) eozinofilek és (c) neutrofilek száma a fiatal nőstény BN és Wistar patkányok vérében az OVA vagy sóoldat orális expozíciója utáni időszakban (a 49. napon). A fehér sávok a kontrollokat, a fekete sávok pedig az OVA-nak kitett csoportokat jelölik. Az adatokat csoportonként hat patkány átlagaként (± SD) mutatjuk be. * Jelentősen eltér a o 3. ábra: A granulocita szintre gyakorolt hatás. Az (a) bazofilek, (b) eozinofilek és (c) neutrofilek száma a fiatal nőstény BN és Wistar patkányok vérében az OVA vagy sóoldat orális expozíciója utáni időszakban (a 49. napon). A fehér sávok a kontrollokat, a fekete sávok pedig az OVA-nak kitett csoportokat jelölik. Az adatokat csoportonként hat patkány átlagaként (± SD) mutatjuk be. * Jelentősen eltér a o Allergiás reakciók összehasonlítva a BN és a Wistar patkányokkal szájon át történő ovalbumin expozíció után

Online közzététel:

4. ábra: A vérnyomásra gyakorolt hatás. A nyomásértékek változásának szintjei a 49. napon fiatal nőstény (a) BN és (b) Wistar patkányokban OVA-val történő szájon át történő fertőzés után (▪) vagy kontroll patkányokban orális sóoldattal történő fertőzés után (♦). A bemutatott adatok az ismételt vérnyomásmérések átlagai (± SD) (patkány Hg-ban) egyes patkányokon 7 órán keresztül. A megtört vonalak a kontroll patkányok vérnyomásértékeinek 95% -os megbízhatósági tartományának felső és alsó határát jelzik. A vérnyomás csökkenését akkor tekintették jelentősnek, ha az érték a 95% -os konfidencia tartomány alá esett.

Szövettani elváltozások OVA-szenzibilizált patkányokban

Amint az az S1 – S5 kiegészítő ábrákon látható, a fiziológiás sóoldatú kontroll patkányok normális morfológiát mutattak a különféle szervekben (pl. Szív, tüdő, máj, lép és vese), amelyet 24 órával az orális beadás után (azaz az 50. napon) kaptak. Ezzel szemben a szívszövetekben a diffúz steatózist és a tüdőszövetekben az eozinofil infiltrációt főleg OVA-szenzibilizált BN patkányokban figyelték meg. Az OVA-szenzibilizált Wistar patkányok szív- és májszöveteiben is steatosis volt, de a lépeikben makrofág-aggregátumok, a tüdőben enyhe intersticiális tüdőgyulladás és tubulo-interstitialis nephritis is volt. Az 1. táblázat összefoglalja a különböző elváltozásokat szenvedő patkányok számát.

Online közzététel:

1. táblázat: OV-ra érzékeny BN- és Wistar-patkányok hisztopatológiai változásai.

Vita

Az IgE-függő allergiás reakció két fázisból áll: egy indukciós lépés, amelyben a gazdaszervezet immunrendszerét érzékenyíti az allergén, és specifikus IgE-antitestek termelődéséhez vezet, amelyek a hízósejtek specifikus sejtfelszíni receptoraihoz kötődnek. célszervek; a második lépés egy kiváltó fázis, amelyet az allergén kötődik ezekhez az IgE-hez és stimulálja a mediátor (hisztamin) felszabadulását a hízósejtekből. Az ételantigének allergén hatásának értékeléséhez mindkét fázist megfelelő vizsgálatokkal kell megvizsgálni (Fritsche, 2009).

Az OVA-specifikus antitest válaszok voltak az indukáló fázis markerei. Az OVA-szenzibilizált BN- és Wistar-patkányok szignifikánsan magasabb OVA-specifikus antitest-titereket mutattak a 28. és a 42. nap között, a negatív kontroll csoporthoz képest. Azonban az OVA-specifikus IgE-titerek BN patkányokban szignifikánsan megnőttek, a maximális szintet a szájon át történő expozíció megkezdése után a 28. napon tapasztalták. Ezzel szemben a Wistar patkányokban az OVA-specifikus IgE válaszok csak a 14. nap után voltak kimutathatók. Ezek a megfigyelések azt mutatják, hogy a BN patkányok érzékenyebbek voltak az OVA-ra, mint a Wistar patkányok az IgE-függő allergiás reakció tekintetében. A BN patkányok az OVA-specifikus IgE antitest szintjének csökkenését is mutatták, hosszan tartó orális expozícióval. Ez valószínűleg - legalábbis részben - annak tudható be, hogy az állandó orális expozíció összefüggésbe hozható az orális tolerancia kialakulásával, amely folyamat a T-szabályozó sejtek és más kapcsolódó mechanizmusok által vezérelt (Ahuja et al., 2010). Másrészt Wistar patkányokban az OVA-specifikus IgE titerek szinte folyamatos növekedését figyelték meg.

Kimutatták, hogy egy specifikus IgE antitest indukciója változatlanul együtt jár egy antigénspecifikus IgG indukciójával (Vaz és mtsai, 1970, 1971; Yamanishi és mtsai, 2003). Ez különösen érvényes az IgG azon alosztályaira, amelyeket az IgE-hez hasonló módon szabályoznak (mint az IgE helyettesítői). Patkányban az IgG2a antitest hasonló citokin-szabályozásnak van alávetve, mint az IgE (Saoudi et al., 1993; Gracie és Bradley, 1996; Kimber et al., 2003). A BN patkányok OVA általi orális expozíciója stimulált IgG és IgG2a antitest-válaszokat eredményezett, amelyek általában magasabb titerekben fejeződtek ki, mint a Wistar patkány társaiban, kivéve az IgG-t a 14. napon.

Az antitestképződés, a hisztamin felszabadulás és/vagy az immunsejtpopuláció bármely változásával járó klinikai következmények további szemléltetése érdekében a szisztolés vérnyomásra gyakorolt hatásokat az OVA-expozíció megkezdése után a 49. napon mértük. Ezek az intézkedések pedig elősegítenék az IgE által közvetített allergiás reakciók patológiájához kapcsolódó mechanizmusok jobb meghatározásának képességét (Ahuja et al., 2010). Néhány BN patkány átmeneti szisztolés vérnyomáscsökkenést mutatott, amely 1 órán belül normál értékre állt vissza, ami összhangban van a korábbi vizsgálatokkal (Knippels et al., 1999b; Knippels és Pennicks 2002; Jia et al., 2005). Egyes Wistar patkányok azonban a fertőzés után szinte folyamatosan csökkenték a vérnyomást. Mivel ezekről a klinikai megnyilvánulásokról kiderült, hogy csak néhány állatnál nyilvánvalóak, ezeket az eredményeket figyelembe lehet venni az ételallergiás betegeknél is tapasztalható helyzet tükrözése érdekében (Knippels et al., 1999b).

Következtetések

Az OVA-szenzibilizált BN- és Wistar-patkányok eltérő immunválaszokat és klinikai megnyilvánulásokat eredményeztek. Az ilyen eredmények azt sugallták számunkra, hogy a két patkánytörzs eltérhet az immunológia immunológiai mechanizmusaitól, és hogy nincs összefüggés az immunválaszok és a klinikai tünetek súlyossága között. Az egyértelműség érdekében ezeknek a vizsgálatoknak az adatait „előzetesnek” kell tekinteni, mivel csak egyetlen fehérje allergént vizsgáltak. Ennek megfelelően további vizsgálatokra van szükség a BN és a Wistar patkányok közötti allergiás reakciók összehasonlításához tisztított erős, gyenge és nem allergén fehérjék alkalmazásával az itt közölt kísérlet alapján. Ezenkívül, mivel bizonyos összefüggés van a kiválasztott gyulladásos mediátorok jelenléte és a klinikai tünetek között, e mediátorok szintjének értékelése diagnosztikai értékű lehet, és esetleg hasznos lehet a klinikai tünetek súlyosságának figyelemmel kísérésére a jövőben.

Megjegyzés az olvasóknak

1. táblázat: OV-ra érzékeny BN- és Wistar-patkányok hisztopatológiai változásai.