Összefüggések a tibetiek bélmikrobiota közösségi struktúrái és a földrajz között

Tárgyak

A cikkhez írt javítás 2018. március 19-én jelent meg

Ez a cikk frissült

Absztrakt

Bevezetés

A Tibeti-fennsíkot a harmadik pólusnak tekintik, és ez az egyik olyan hely a földön, ahol a legszélsőségesebb életviszonyok vannak 1. Ezt a helyet az alacsony oxigénszint, a magas sugárzás és az ellátás hiánya jellemzi 1,2. Ezek a körülmények óriási élettani kihívásokat jelentenek a nagy magasságban fennsíkon élő emberek vagy állatok számára 3. Tibet őslakosai azonban több mint 25 000 éven át elfoglalták a zord helyet, és jelentős civilizációt hoztak létre a Himalájában és más 4,5,6 régiókban. Ezek a tibetiek a nagy magasságban történő sikeres alkalmazkodás jó példáiként szolgálnak 3. A tibetiek jó példák a nagy magasságban történő alkalmazkodás mechanizmusainak feltárására is. Számos munkát végeztek a nagy magasságban történő adaptáció molekuláris aláírásainak feltárására a földrajzi helyek széles skáláján a 3, 7, 8, 9, 10 genom elemzésével. A tibetiek egyedi életmódot és étkezési szokásokat is kialakítottak, például a hús (marha- és birkahús), a jakvaj, a tej és más tejtermékek az energia legfőbb táplálékai, de minimális mennyiségű zöldséget és gyümölcsöt fogyasztanak 11 .

A genetikai különbségeket genomszintű elemzéssel vagy más molekuláris módszerekkel tárták fel a tibetiek és a han emberei között 3,7,8,9,10. Egyes tanulmányok összehasonlították a széklet mikrobiotáját a tibeti és a han populáció és a mongolok között, és a tibetiek 2,19,20 különböző bélmikrobiom-struktúrájára utaltak. A Han populációkkal összehasonlítva a tibeti mikrobiómát a relatív bőség jellemezte Prevotella, mivel a Han székletet gazdagították Bacteroides 23. A nagy magasságban (4800 m) élő tibetiek a kemény környezetekre reagálva butiráttermelő baktériumokkal dúsított mikroflórát mutattak 23. Rövidláncú zsírsavak (SCFA-k), amelyeket a Clostridium, Desulfovibrio, Bacteroides, Lactobacillus, és Prevotella segíthet a vérnyomás csökkentésében, alkalmazkodni az energiaigényhez és a pulmonalis hipertóniához 2,23. Nem érkeztek azonban jelentések a tibetiek székletének mikrobiotájának széles körű feltárásáról (a Tibeti-fennsík körülbelül 2 500 000 km 2 -et mér). Különböző földrajzi helyek, életmód, gazdálkodási stílus és a más helyekkel folytatott kommunikáció gyakorisága a tibetiek bélmikrobiomájától függően változhat.

Ebben a tanulmányban a tibetiek bélmikrobiota közösségi struktúrájának és a földrajz közötti összefüggések meghatározásához elemeztük a Tibet-fennsíkon 2800–4500 m magasságú hat régió 208 mintájának 208 mintájából származó feca mikrobiótákat, és összehasonlítottuk a filogenetikai sokféleséget és a taxonómiai relatív bőséget régiók.

Eredmények

DNS szekvenálás és szűrés

Összesen 17 870 011 nyers leolvasást generáltak a MiSeq platformról. A gyenge minőségű olvasmányok szűrése után 16 509 385 tiszta olvasást megtartottunk 240–300 bp hosszúsággal, és a nyers adatok közel 7,04% -át kiszűrtük. Az egyes mintákban a kiváló minőségű olvasmányok átlagos száma elérte a 79 372-et, és az összes mintában 12 594-től 125 895-ig terjedt.

Mikrobiális sokféleség a Tibeti-fennsík különböző helyeiről származó mintákban

Mind a 16 509 385 kiváló minőségű szekvenciát operatív taxonómiai egységekbe (OTU-k) csoportosítottuk 97% -os szekvencia-hasonlósággal, a Quantitative Insights Into Microbial Ecology (QIIME) szoftverrel. Összesen 1544 OTU-t detektáltak (S1. Táblázat). A retefrakciós görbék azt mutatták, hogy az összes mintában elértük a fennsík szintjét (S1. Ábra), Good lefedettségi értéke 98,94% és 99,84% között mozgott, feltárva, hogy szekvenálási mélységünk megfelelő volt ahhoz, hogy az ürülékminták mikrobaközösségét enyhítsük. A mikrobiális sokféleség (Shannon-index) és a gazdagság (Chao-index) szignifikáns különbségeket mutatott a minták között a különböző helyeken (1. ábra). A Shannon-index Hongyuan (HY), Lhasa (LS) és Nagqu (NQ) mintákban volt a legmagasabb, míg a Chao index a Gangcha (GC), HY, LS és NQ mintákban volt a legmagasabb. A legalacsonyabb Chao index 187 volt Tianzhu-ban (TZ), míg a legalacsonyabb Shannon-index 2,44-et ért el Gannanban (GN).

A minták mikrobiális sokfélesége és gazdagsága. (A-C) Káo-index. (A) Különböző helyszínek, (B) Magasság, (C) Korosztályok; (D – F) Shannon-index. (D) Különböző helyszínek, (E) Magasság, (F) Korok. A sávok fölötti kis „abcd” betűk a csoportok közötti különbségeket jelentik, ugyanaz a betű azt jelzi, hogy a különbség nem jelentős, míg a különbség betű azt jelzi, hogy a különbség jelentős.

A GN és a TZ helyeinek magassága 3000 m alatt mért, míg az LS, HY és GC helyek magassága 3000 és 4000 m között volt. Az NQ volt a legdurvább hely, átlagos magassága meghaladja a 4000 m-t. A növekvő magassággal együtt a bélben a baktériumok sokfélesége a GN és a TZ 2,80-ról NQ-ra 4,27-re nőtt, míg a bélben gazdagság 212-ről 301-re nőtt.

A baktériumok sokfélesége és gazdagsága szintén korrelál az életkorral. A régi stádiumban a baktériumok sokfélesége és gazdagsága volt a legmagasabb, elérte a 3,82, illetve a 309-et. A baktériumok sokfélesége és gazdagsága az emberek növekedésével nőtt. A bél mikrobiómák és a BMI között azonban nincs összefüggés (az adatokat nem közöljük).

A bél mikrobiota béta változatossága a Tibeti-fennsík különböző helyszínein

Összehasonlításokat végeztek a különböző helyekről származó minták közötti különbségek feltárására. A főkomponens-elemzés (PCA) és a klaszteranalízis azt sugallta, hogy jelentős különbségek figyelhetők meg a különböző helyekről származó minták között (p 2. ábra

PCA elemzések a különböző minták közötti hasonlóságok kimutatására. (A) Különböző helyszínek, (B) Magasság, (CBMI, (D) Korok.

A tibetiek belében a baktériumok összetétele a magasság növekedésével jelentősen változott (2B. Ábra). A BMI tekintetében csak az alsúlyú résztvevők mutattak eltérő baktériumprofilt a normál testsúlyú és elhízott résztvevőkhöz képest. A többi résztvevő között azonban nem figyeltek meg különbségeket (2C. Ábra). A növekedési folyamatok alatt a baktériumközösségek a gyermek és az ifjúság szakaszában jelentősen változtak; és idősek és fiatalok (2D. ábra).

A tibetiek beléből származó baktériumok különböző helyeken

Az adatkészlet szinte összes szekvenciáját (99,99%) egy baktérium királysághoz rendelték, de néhány olvasmány továbbra sem volt osztályozva. Összességében 18 bakteriális phylát nyertünk ki a mintákból; ezek közé tartoztak a Bacteroidetes (60,00%), a Firmicutes (29,04%), a Proteobacteriumok (5,40%) és az Actinobacteriumok (3,85%) (S2 ábra), amelyek az összes szekvencia 90% -át tették ki. Ugyanakkor a különböző régiókból származó mintákban ugyanazok a baktériumok aránya a menekültügyi szinten eltérő volt. A Bacteroidetes relatív bősége GN-ben (82,27%) volt az összes csoport között a legmagasabb, ezt követte a HY (66,99%), a TZ (54,48%), az LS (59,12%), az NQ (51,10%) és a GC (45,90%). Az NQ (40,00%) és a GC (41,49%) mintákban a firicutes több volt, mint a HY, LS, TZ és GN mintákban. A Firmicutes relatív bősége a GN mintákban elérte a 11,71% -ot, ami jóval alacsonyabb, mint más mintáké, különösen a GN mintáké. Az aktinobaktériumok az NQ-ban (3,85%) sokkal alacsonyabbak voltak, mint a többi mintában. Az F/B arány 0,48 volt az összes mintában. Az F/B arány 0,14, 0,37, 0,46, 0,58, 0,78 és 0,90 volt GN, HY, LS, TZ, NQ és GC populációkban.

Osztályszinten minden osztályban 34 osztályt mutattak ki (S3. Ábra), amelyek 91,20% -át a Bacteroidia, Clostridia, Gammaproteobacteria és Actinobacteria osztályba tartozó baktériumok képviselték. A statisztikák azt mutatták, hogy 25 osztály szignifikánsan változott az összes mintában (o 1. táblázat A magbaktériumok összetétele az összes bélmintában.

A 3. ábra a GC, GN, HY, LS, NQ és TZ helyek által megosztott OTU-kat mutatja be, összesen 594 OTU-t detektálva. Ezt az 594 OTU-t 53 különböző családhoz rendelték, és a Ruminococcaceae, a Lachnospiraceae, a Prevotellaceae és a Bacteroidaceae tartozó OTU-k száma összesen 182, 115, 66 és 28 volt. A leggyakoribb család a Prevotellaceae volt, amely az összes szekvencia 42,86% -át képviselte. A Ruminococcaceae (13,60%) és a Bacteroidaceae (11,62%) bősége meghaladta az összes szekvencia 10% -át.

A VENN különböző helyszíneken elemez.

Mikrobiális aláírások különböző mintákban

A VENN elemzések azt mutatták, hogy egyes OTU-k egyes helyeken egyediek, például 909 OTU TZ-ben, 1157 NQ-ban, 1034 HY-ben, 1002 GC-ben, 1031 GN-ben és 1239 LS-ben (3. ábra)

A mikrobiális aláírás detektálására az egyes helyeken lineáris diszkrimináns elemzési hatásméretet (LEfSe) végeztünk. Az aláíró bél mikrobiotában a Prevotellaceae, a Bacteroidales és a Veillonellaceae szerepelt a GN mintában; Bacteroidaceae, Staphylococcaceae, Lachnospiraceae és Clostridiales GC mintában; Micrococcaceae LS mintában; Rikenellaceae HY mintában; Porphyromonadaceae, Ruminococcaceae és Erysipelotrichaceae NQ mintában; Prevotellaceae TZ mintában; Sphingobacteriaceae, Elusimicrobiaceae és Rhizobiales az LSmintában; és Clostridiaceae a GC-mintában (4A. ábra).

A LEfSe baktériumközösség alapján történt minden mintában. (A) Különböző helyszínek, (B) Magasság, (C) MBI, (D) Korok.

A Methanobactericeae, a Coriobacteriaceae, a Prevotellaceae, a Bacteroidales és a Veilonellaceae aláírt mikrobiota volt a résztvevők belében 3000 m alatti környezetben élő résztvevők béljében. Az Actinomycetales, a Porphyromonadaceae és a Clostridiales aláírt mikrobiota volt a 3000 és 4000 m közötti helyekről származó mintákban (4B. Ábra). A Bacteroidaceae, az Enterobacteriaceae és a Verrucomicrobiae aláírt mikrobiota volt az elhízott résztvevők belében (4C. Ábra). Csak idős emberek mutattak be egyedi baktériumadókat, amelyek a Lactobacillales és az Enterobacteriales baktériumokhoz tartoznak (4D. Ábra).

A bél mikrobioma és az életkor, valamint a magasság és a testtömeg-index (BMI) összefüggései

A baktériumközösség és a helyek, az életkor, a magasság és a BMI közötti összefüggéseket a nemzetség szintjén lévő mikrobiális összetétel alkalmazásával határoztuk meg (> 1%). A kanonikus levelezési elemzés (CCA) eredményeiből kiderült, hogy a belekben különböző adókat befolyásolta az életkor, a magasság és a BMI. A Ruminococcaceae, a Prevotella és a Lachnospiraseae fő magasságban negatív volt. A Faecalibacterium, a Bacteroides és a Bifidobacterium pozitív volt magassággal, BMI-vel és életkorral (5. ábra).

Az életkor, magasság, BMI és elhelyezkedés CCA-ja a nemzetek szintjén a közösség összetételével.

Közösségi államtípusok (CST) elemzése

A CST-k elemzése feltárta, hogy a tibetieknél négy CST található, mégpedig, Bacteroides, Prevotella, Ruminococcaceae és Succinivibrio (6. ábra). Prevotella A leggyakoribb volt a CST, amely 208 résztvevőből 124-ben volt jelen, majd ezt követte Bacteroides és Ruminococcaceae CST-k. Ezen felül a negyedik CST, amelyhez tartozik Succinivibrio, két mintát detektáltunk LS-ből, egy mintát GN-ből és egy mintát a HY-ből (2. táblázat).

A minták teljes összekapcsolódási klaszterezésének hőtérképe a nemzetség összetétele és a közösségekben tapasztalható bőség alapján.

Vita

A tibetiek bélmikrobiotájáról hat helyszínen végeztek felmérést a MiSeq szekvenáló platform segítségével. Az eredmények azt mutatták, hogy a tibetiek belében a baktériumok összetétele a magasság, a BMI és az életkor növekedésével jelentősen változott. Mag mikrobiotát tartalmaz Prevotella, Faecalibacterium, és Blautia. Az összes mintában négy CST-t detektáltunk.

A fogadó földrajzi elhelyezkedése, életmódja, étrendje és életkora fontos szerepet játszik a bélmikrobiális közösségek szerkezetének kialakításában az Egyesült Államok, Európa és Korea lakosságának felmérése alapján 15,24. A tibetiek baktériumközösségének szerkezete összefüggésben volt a fent említett tényezőkkel. A baktériumok sokfélesége és gazdagsága azonban nem volt szignifikáns összefüggésben a BMI-vel. Mag mikrobiota áll Prevotella, Faecalibacterium, és Blautia a tibetieknél. Prevotella volt az uralkodó nemzetség; ez az eredmény összhangban áll más vizsgálatok eredményeivel. A három nemzetség közös volt az alapvető OTU-k esetében a kínai és a nyugati populációkban 2. Korábbi funkcionális és metabolikus szintű vizsgálatok azt mutatták, hogy ezek a nemzetek kulcsszerepet játszanak az alapvető metabolitok szintézisében az emberi gyomor-bél traktusban. Ezért a mag bél mikrobiota minden emberben korlátozott tartományban változhat.

Összefoglalva, ez a tanulmány feltárta, hogy a nagy magasságban élő tibetiek alacsony F/B arányokkal rendelkeznek. A bél mikrobiotájában jelentős különbségeket figyeltek meg a különböző helyek, magasságok és életkorok között. Négy CST-t detektáltak. A bél mikrobiota fontos szerepet játszik a nagy magasságban történő alkalmazkodás és a magas zsírtartalmú étrend szabályozásában.

Anyag és módszerek

A vizsgálati hely és a mintavétel

Jelen tanulmányban 208 egészséges tibeti önkéntest toboroztak mintavételre, amely hat helyet lefedett a tibeti fennsíkon; a területek közé tartoztak a GC (30 minta), a GN (52 minta), a HY (29 minta), az LS (32 minta), az NQ (34 minta) és a TZ (30 minta) (7. ábra). A résztvevők életkora 0,7 és 86 év között mozgott. Különböző korcsoportokba sorolták őket, nevezetesen csecsemők (1–4 évesek), gyermekek (5–12 évesek), fiatalkorúak (13–18 évesek), fiatalok (19–39 évesek), középső (40–40 évesek) 59 évesek) és öregek (60 év felett). Magasság és tömeg állt rendelkezésre a BMI kiszámításához (S2. Táblázat). A BMI-t négybe sorolták, nevezetesen az alsúlyba (7. ábra

A mintavételi helyek térképe. A mintavételi helyeket a MapGIS 10.2 Desktop szoftver segítségével térképezik fel (http://www.mapgis.com/index.php/index-view-aid-977.html, kínai szoftver).

Az ebben a tanulmányban felvett összes önkéntes őslakos volt, és legalább három generációig ugyanazon a településen tartózkodott, anélkül, hogy bármilyen más etnikai csoportba tartozó embereket feleségül vett volna, és soha nem hagyták el Tibetet. Ezek az emberek nem tapasztaltak bél- vagy anyagcserebetegségeket, és a mintavétel dátuma előtt három hónapon belül nem szedtek antibiotikumot vagy probiotikumot. Az S2 táblázat részletes információkat sorol fel, például életkor, nem és magasság. A mintavétel a korábban publikált módszerek szerint történt2. A székletmintákat a gyűjtés után azonnal folyékony nitrogénben tartottuk, és további kísérletek előtt -80 ° C-on tároltuk. Ezt a tanulmányt a Southwest University for Nationalities Etikai Bizottsága hagyta jóvá, és minden önkéntestől tájékozott beleegyezést kaptak a vizsgálatba való felvétel előtt. Minden kísérletet a jóváhagyott irányelveknek és előírásoknak megfelelően hajtottunk végre.

DNS-kivonás

A széklet DNS-t QIAampDNA széklet minikit segítségével extraháltuk a gyártó utasításai szerint, a Schnorr által leírt gyöngyverési eljárás módosított előkezelési protokolljával. et al. 20. A DNS mennyiségét a Nanodrop ND-2000 (Nanodrop, USA) segítségével határoztuk meg. A genomi DNS tisztaságát és minőségét 0,8% -os agaróz géleken ellenőriztük.

Polimeráz láncreakció (PCR) amplifikáció és nagy áteresztőképességű szekvenálás

A bakteriális 16S rRNS gén V4 hipervariábilis régióját 515F (GTGCCAGCMGCCGCGGTAA) és 806R (GGACTACVSGGGTAT-CTAAT) 33 primerekkel amplifikáltuk. Minden széklet DNS-mintához 10-jegyű vonalkód-szekvenciát adunk az elő- és hátramenet primerek 5'-végéhez. A PCR-t Mastercycler Gradient-en (Eppendorf, Németország) végeztük 50 µl reakciótérfogattal, amely 5 µl10x Ex Taq puffert (Mg 2+ plusz), 4 µl 12,5 mM dNTPmix-et (mindegyik), 1,25 U Ex Taq DNS-polimerázt, 2 µl templátot használt. DNS, 200 nM vonalkódolt primerek, egyenként 967F és 1406R, valamint 36,75 µl ddH2O. A kerékpározási paraméterek 94 ° C-on voltak 2 percig, majd 30 ciklus következett 94 ° C-on 30 másodpercig, 57 ° C-on 30 másodpercig és 72 ° C-on 30 másodpercig, végső meghosszabbítással 72 ° C-on 10 percig. Mintánként három PCR terméket egyesítettünk a reakciószintű PCR torzítások enyhítése érdekében. A PCR termékeket QIAquick gél extrakciós készlet (QIAGEN, Németország) segítségével tisztítottuk, és valós idejű PCR alkalmazásával számszerűsítettük. Az amplifikációs terméket mély szekvenáljuk az Illumina MiSeq platform segítségével a BGI-nél (Shen zhen). A futtatás után képelemzést, alaphívást és hibabecslést hajtottak végre az Illumina Analysis Pipeline 2.6 verziójával.

Adatok elemzése

A nyers adatokat először átvilágították, és a szekvenciákat eltávolították a megfontolásokból, amikor azok 200 bp-nél kisebb tartományban voltak. Ezek az adatok alacsony minőségű ≤ 20 pontszámot mutattak, és kétértelmű bázisokat tartalmaztak, vagy nem egyeztek pontosan az primer szekvenciákkal és a vonalkód-címkékkel. A minősített leolvasásokat külön mintákra osztottuk mintaspecifikus vonalkód-szekvenciák alkalmazásával, és az Illumina Analysis Pipeline 2.6 verziójával vágtuk le. Ezután az adatkészletet a QIIME 34 segítségével elemeztük. A szekvenciákat 97% -os hasonlósági szinten csoportosítottuk OTU-kba, hogy 35 ritkasággörbéket hozzunk létre, és kiszámítsuk a gazdagsági és diverzitási indexeket 36. Az RDP 37 osztályozó eszközt használták az összes szekvencia osztályozására különböző taxonómiai csoportokba.

Az összes mintában bemutatott mag OTU-kat QIIME segítségével detektáltuk. Klaszterelemzéseket és PCA-kat használtunk az egyes minták OTU-információi alapján, az R csomag segítségével, a különböző minták közötti hasonlóság vizsgálatához. A VENN elemzéseket R csomag segítségével is elvégeztük. A különböző csoportok közötti statisztikai elemzéseket ANOVA 38 alkalmazásával elemeztük. Mann – Whitney U tesztet alkalmaztak a sokféleség és a taxonómiai összehasonlítás érdekében a különböző szintű csoportok (törzs, osztály, rend, család és nemzetség) között 39. CCA-t alkalmaztunk a bél mikrobiális szerkezete és a környezeti tulajdonságok közötti kapcsolatok értékelésére R csomag segítségével. Az LEfSe 40-et alkalmazták az egyedi baktériumadó kimutatására a különböző csoportok között. A különböző CST-k meghatározásához az összes helyszínen hierarchikus csoportosítást végeztek a CST-kbe a nemzetség összetétele és a bőség alapján, a DiGiulio által leírt módszerekkel. et al. 41 .

Adatok elérhetősége

Ennek a tanulmánynak a nyers szekvenciáit letétbe helyezték a Sequence Read Archive (hozzáférési szám: SRA551593).