Presep: A Supernatantba szekretálódó fehérje hajlamának előrejelzése, ha Pichia pastoris-ban kifejezzük

Jian Tian

1 Biotechnológiai Kutatóintézet, Kínai Agrártudományi Akadémia, Peking, Kína,

presep

Yuhong Zhang

1 Biotechnológiai Kutatóintézet, Kínai Agrártudományi Akadémia, Peking, Kína,

Bo Liu

1 Biotechnológiai Kutatóintézet, Kínai Agrártudományi Akadémia, Peking, Kína,

Dongyang Zuo

1 Biotechnológiai Kutatóintézet, Kínai Agrártudományi Akadémia, Peking, Kína,

Tao Jiang

1 Biotechnológiai Kutatóintézet, Kínai Agrártudományi Akadémia, Peking, Kína,

Jun Guo

1 Biotechnológiai Kutatóintézet, Kínai Agrártudományi Akadémia, Peking, Kína,

Wei Zhang

2 Agrárgenomikai Fő Laboratórium (Peking), Mezőgazdasági Minisztérium, Peking, Kína,

Ningfeng Wu

1 Biotechnológiai Kutatóintézet, Kínai Agrártudományi Akadémia, Peking, Kína,

Yunliu Fan

1 Biotechnológiai Kutatóintézet, Kínai Agrártudományi Akadémia, Peking, Kína,

A kísérletek megtervezése és megtervezése: JT YZ JG YF. Végezte a kísérleteket: YZ BL DZ TJ. Elemezte az adatokat: JT YZ BL. Hozzájáruló reagensek/anyagok/elemző eszközök: DZ TJ. Írta az írást: JT YZ WZ NW. Tervezte az elemzéshez használt szoftvert: JT YZ.

Társított adatok

Absztrakt

Bevezetés

A Pichia pastoris az egyik leggyakrabban használt szervezet a rekombináns fehérjék heterológ termeléséhez. Jól jellemezhető, genetikailag könnyen kezelhető, minimális biztonsági óvintézkedéseket igényel, gyorsan és olcsón nagy sejtsűrűségig növeszthető [1], [2]. Ezenkívül az ebben a szervezetben expresszált rekombináns fehérjék többsége közvetlenül a táptalajba szekretálódik. A rekombináns fehérjéknek ez a preferenciális szekréciója lehetővé teszi a célfehérjék közvetlen izolálását a táptalajból, kiküszöbölve a magas költségű, alacsony hozamú sejttörés szükségességét. Ez a tulajdonság továbbá korlátozza a célfehérjék intracelluláris felhalmozódásából eredő toxicitási problémákat. Azonban nem minden rekombináns fehérje képes sikeresen kiválasztódni az élesztőben, és néhány erősen expresszált fehérje intracelluláris visszatartása továbbra is problémát jelent, korlátozva a szélesebb körű felhasználást.

Számos módszert fejlesztettek ki a rekombináns fehérjék szekréciójának fokozására a P. pastoris-ban. Tanulmányok kimutatták, hogy a géndózis növekedése [1], a promóterek vagy a szignálszekvenciák megváltozása [3], valamint a molekuláris chaperonok [4], [5], [6], a fehérje-diszulfid-izomeráz (PDI) [7] együttes túlzott expressziója, [8] és a kibontakozott fehérje válasz faktor (UPR) [9] fokozhatja egyes rekombináns fehérjék szekrécióját. Míg ezeknek a módszereknek a hatékonysága számos fehérje esetében bebizonyosodott, nem biztos, hogy elegendőek azokhoz a fehérjékhez, amelyeket az eredeti sejt általában nem választ ki. Ezért az ilyen fehérjék P. pastoris-ban történő expressziójára tett kísérletek jelentős időt és erőforrásokat emésztenek fel, anélkül, hogy megjósolnák a siker valószínűségét. Jelentős értéket jelentene egy olyan módszer, amely megjósolja annak valószínűségét, hogy egy fehérje kiválik a felülúszóba, mielőtt P. pastoris-ban kifejeződik. azonban legjobb tudomásunk szerint még nem fejlesztettek ilyen eszközt.

Nemrégiben kimutatták, hogy a fehérjék belső régióiban szekréciós jelek léteznek, a hagyományos N-terminális szignálszekvenciákon kívül. Például egyetlen mutáció (N184Q vagy N250Q) a hFasLECD fehérjében javíthatja a fehérje szekréció szintjét, ha P. pastoris-ban fejezzük ki [10], [11]. A P. pastoris-ban exogén módon expresszált OPHC2 metil-paration-hidroláz (GenBank-szám> CAE53631) vizsgálata magas expressziós szinteket mutatott (~ 5,5 g/l) 3 liter nagysejtű sűrűségű fermentáció alkalmazásával [12]; azonban egy másik metil-paration-hidrolázt (MPH, GenBank-szám> ACC63894), amely 46% -os szekvenciaazonosságot mutat az OPHC2-vel, nem szekretálták a tenyészet felülúszójába. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a belső fehérjeszekvenciák tartalmazhatnak olyan szignálokat, amelyek befolyásolják a szekréciót. Ezért ezek a szekvenciák felhasználhatók a fehérje szekréció valószínűségének előrejelzésére, ha P. pastoris-ban exogén módon expresszálódnak.

Ebben a tanulmányban javasoljuk a Presep módszert (A felülúszóba szekretálódó fehérje hajlamának előrejelzése, amikor P. pastoris-ban fejezik ki) a P. pastoris fehérjék szekréciós állapotának azonosítására az együttes tanulási módszer random erdők (RF) alapján. . Összeállítottunk egy adatkészletet (Secreprot), amely 136 pozitív fehérjét tartalmazott, amelyek kísérletileg kimutatták, hogy P. pastoris-ban történő expresszióval szekretálódnak a felülúszóba, 957 negatív mintával együtt. Ezen fehérjék kódolására pszeudo-aminosav-összetétel (PseAAC) módszert alkalmaztunk. Az előrejelzett és a kísérleti eredmények egyaránt azt mutatták, hogy a Presep hatékony osztályozó volt az adott fehérje szekréciós hajlandóságának előrejelzésében. Ez a módszer felhasználható egy adott fehérje szekréciós lehetőségének előrejelzésére és optimalizálására a P. pastoris heterológ expressziója előtt.

Eredmények és vita

Képzés és érvényesítés