Resveratrollal kiegészített étrend fogyasztása csökkent fertőzéssel összefüggő neuroinflammációval és a munkamemória hiányával idős egerekben

Jayne Abraham

1 Táplálkozástudományi Osztály, Illinois Egyetem, Urbana, Illinois.

3 Integratív Immunológiai és Viselkedési Program, Illinois Egyetem, Urbana, Illinois.

Rodney W. Johnson

1 Táplálkozástudományi Osztály, Illinois Egyetem, Urbana, Illinois.

2 Állattudományi Tanszék, Illinois Egyetem, Urbana, Illinois.

3 Integratív Immunológiai és Viselkedési Program, Illinois Egyetem, Urbana, Illinois.

Absztrakt

Bevezetés

A rezveratrol (3,5,4′-trihidroxi-transz-stilbene) egy főleg a szőlőben és a vörösborban található polifenol, és sokféle biológiai aktivitással rendelkezik, amelyek védelmet nyújtanak az oxidatív stressz, a gyulladás, a szív- és érrendszeri betegségek és a rák ellen. A 13–19 resveratrol különösen érdekes a gyulladásos komponenssel járó betegségek modulálásában, mivel számos tanulmány megállapította, hogy gátolja a reaktív oxigénfajták (ROS) termelését a neutrofilek, a monociták és a 20–24-es makrofágok által, valamint számos transzkripciós faktor, köztük a nukleáris sejtek aktiválódását. faktor-KB (NF-KB) és aktivátor fehérje-1 (AP-1). 25,26 A közelmúltban számos állatkísérlet foglalkozott a resveratrol neuroprotektív hatásaival, bemutatva, hogy lassítja az Alzheimer 27-hez és a Parkinson-kórhoz 28 kapcsolódó neuropatológiát, és megvéd az agyi traumáktól 29 és az agyi ischaemiatól. 30 Továbbá kimutatták, hogy modulálja a kolinerg neurotranszmissziót és javítja a megismerést diabéteszes patkányokban. 31

Az, hogy a fent említett állapotok mindegyike összefügg az IL-1β és más gyulladásos citokinek fokozott expressziójával az agyban, egyértelmű lehetőséget jelent arra, hogy a resveratrol jótékony hatásai gyulladáscsökkentő tulajdonságai révén jelentkezzenek. Annak ellenére, hogy számos tanulmány kimutatta, hogy a resveratrol gátolja a gyulladásos molekulák termelését stimulált mikroglia sejtek által in vitro, 32–35 nem végeztek idős állatokon olyan vizsgálatokat, amelyek azt vizsgálták volna, hogy az étrendi resveratrol képes-e csökkenteni az IL-1β koncentrációját az agyban a fertőzés során és megvédeni a megismerési hiányokkal szemben.

Ezért a jelen tanulmány célja annak meghatározása volt, hogy a resveratrol étrend-kiegészítő gátolja-e az IL-1β expressziót a hippocampusban, valamint a viselkedési és kognitív hiányokat idős egerekben, akik LPS-t kaptak perifériás fertőzés utánzására. Az eredmények azt sugallják, hogy a fertőzéssel összefüggő ideggyulladás és a kognitív deficit idős egyénekben minimalizálható resveratrol-kiegészítéssel.

Anyagok és metódusok

Állatok és étrend

A specifikus kórokozótól mentes telepünkből származó felnőtt (3-6 hónapos) és idős (22-24 hónapos) hím BALB/c egereket fenntartottuk az előzőekben leírtak szerint. 12 A szokásos rágcsáló-chow étrendben jelen lévő fitoösztrogének hatásának kiküszöbölésére a szója helyett inkább kazeinnel formulázott izoflavonmentes étrendet (AIN93G) használtunk. Az egyes kísérletek megkezdése előtt az egereknek standard AIN-93G egér diétát (Research Diets, Inc., New Brunswick, NJ) biztosítottak egy hetes akklimatizációs periódusra. Néhány állat AIN-93G-t kapott a vizsgálat során, míg mások AIN-93G-t plusz 0,4% resveratrollal. A resveratrolt (kat. Szám 70675; tételszám: 125673; Cayman Chemicals, Ann Arbor, MI) homogén módon kevertük az AIN-93G kontroll étrendbe, pelletáltuk és tartósítottuk a resveratrol stabilitásának biztosítása érdekében. Az összes eljárást az Illinoisi Egyetem Intézményi Állattenyésztési és Felhasználási Bizottsága hagyta jóvá.

Viselkedési tesztek

Mozgásszervi tevékenység

A házi ketrec aktivitását az EthoVision állatkövető rendszerrel (Noldus Information Technologies, Hollandia) mértük, és a teljes elmozdított távolságot 5 perces tesztek során határoztuk meg. A vizsgálatokat a fotoperiódus sötét fázisában (0800 és 1700 között) végeztük infravörös megvilágításban a videofelvétel megkönnyítése érdekében.

Téri munkamemória

A horrokampustól függő hajlás és memória meghatározásához a Morris vízi labirintus egyik változatát használták. Az alkalmazott tesztberendezést korábban leírták. Az állatok kiképzésére egy 5 napos elsajátítási szakaszban került sor, minden nap három tömeges vizsgálattal. Az egyes próbák megkezdéséhez az egereket az egyes munkamenetek kezdete előtt 30 másodpercig az emelvényre helyeztük, majd pszeudo-véletlenszerűen a vízbe helyeztük a három előre meghatározott hely egyikében, 2 cm-re a tartály falától néző szélétől. Az egerek szabadon úszhattak legfeljebb 60 másodpercig, vagy addig, amíg az emelvény meg nem volt. Miután az egér elérte a peronot, 30 másodpercig ott kellett maradnia. Ha az emelvény nem volt elhelyezve a 60 másodperc alatt, az egereket az emelvényhez vezettük, és 30 másodpercig hagytuk ott maradni. Három egymást követő vizsgálat befejezése után az egereket visszahelyezték háziketrecükbe. Az EthoVision állatkövető rendszerrel meghatározott teljesítményparaméterek közé tartozott az úszás sebessége, az emelvényre való késés és az úszott távolság.

A munkamemória teljesítményének kiértékeléséhez az egereket ugyanazon a fentiekben leírt helyhez illesztési paradigmában teszteltük, azzal a különbséggel, hogy a platformot áthelyezték a készlet ellentétes negyedébe; minden disztális vizuális jel állandó maradt. Az állatokat a megfordítási teszt megkezdése előtt 30 másodpercig helyeztük az emelvényre, és három kísérletet kaptunk a peron elhelyezésére az új célnegyedben. Minden teljesítményparaméter megmaradt a fent leírtakkal.

Kísérleti terv

Az Escherichia coli LPS-t (1,0 μg/egér; 0127 szerotípus: B8, Sigma, St. Louis, MO) közvetlenül a kísérlet előtt feloldottuk steril sóoldatban. Felnőtt (n = 40) és idős (n = 48) egereknek 4 héten át AIN-93G standard étrendet vagy AIN-93G plusz 0,4% resveratrol diétát biztosítottak. A táplálékfelvételt és a testsúlyt heti rendszerességgel mértük a vizsgálat időtartama alatt.

4 hetes étrend-kiegészítés után a sötét fázis kezdetén értékeltük a mozgásszervi aktivitást. Közvetlenül a viselkedési teszt után az egereknek 100 μl intraperitoneális (i.p.) injekciót kaptak steril sóoldat vagy LPS (1,0 μg). Az injekciók után az egereket visszahelyezték háziketrecükbe, és 2, 4, 8 és 24 órával később ismét meghatározták a mozgásszervi aktivitást. Az injekció beadása után 24 órával az egereket CO2-elfojtással elpusztítottuk, és az IL-1β fehérje, illetve az mRNS szint meghatározásához a vért és a hippocampus szöveteket gyűjtöttük össze.

A resveratrolnak a hippokampustól függő tanulás változásaira gyakorolt hatásainak meghatározásához külön tanulmányt végeztek, amelyben a perifériás immunstimulációt követően 4 és 24 órával a Morris vízi labirintus fordított tanulási változatát használták. Az étrend-kiegészítés negyedik hetében az állatokat 5 napos felvásárlási szakaszban képezték ki, három tömeges vizsgálattal, minden nap. A platform az akvizíció szakaszában állandó helyen maradt. Az állatoknak kétnapos pihenőidőt engedélyeztek, és a 8. napon az egereknek LPS-t adtak, majd 4 és 24 órával később megfordítási tesztnek vetették alá őket, amelynek során az emelvényt a medence ellentétes negyedébe helyezték, de az összes disztális vizuális jel állandó maradt.

Az IL-1β fehérje és az mRNS expressziójának meghatározása

A plazmamintákból meghatároztuk az IL-1β fehérjét gyöngyalapú immunvizsgálati készlettel, citokin reagens készlettel kombinálva, a gyártó leírása szerint (Bio-Rad, Hercules, CA). A multiplex vizsgálat 37-re volt érzékeny. Kvantitatív, valós idejű PCR-t hajtottak végre a leírtaknak megfelelő Assay-on-Demand génexpressziós protokoll (Applied Biosystems, Foster City, CA) alkalmazásával. Röviden, a cDNS-t PCR-rel amplifikáltuk, ahol egy cél-cDNS-t (Mm00434228_ml az IL-1β-hoz) és egy referencia-cDNS-t (Mn99999915_gl glükóz-3-foszfát-dehidrogenázhoz) egyidejűleg amplifikáltunk 5'-fluoreszcens riporterfestékkel ellátott oligonukleotid szondával (6 karboxifluoreszcein) és 3'-nemfluoreszcens csillapító festék. A fluoreszcenciát egy ABI PRISM 7900HT szekvencia detektáló rendszeren (Perkin Elmer, Forest City, Kalifornia) határoztuk meg. Az adatokat összehasonlító küszöbérték-ciklus (Ct) módszerrel elemeztük, és az eredményeket szeres különbségként fejeztük ki.

BV-2 mikroglia sejtkultúra

Az immortalizált egér mikroglia sejtvonalat, a BV-2-t (Linda Van Eldik, az Északnyugati Egyetem, Evanston, IL ajándék) 150 cm2-es szövetkultúra lombikokban (BD Falcon) tartottuk Dulbecco-val módosított Eagle-táptalajban (DMEM) kiegészítve. 10% magzati szarvasmarha-szérum (FBS) és 100 egység/ml penicillin/sztreptomicin 37 ° C-on, nedvesített inkubátorban, 5% CO2 alatt. Valamennyi kísérletben a sejteket 10% FBS-sel kiegészített DMEM-ben szuszpendáltuk, és hatlyukú lemezekre (BD Falcon) beoltottuk, mielőtt kezelésnek vetettük alá őket. A sejtek életképességét a tetrazolium vegyület MTS sejtproliferációs vizsgálatával mértük a gyártó utasításai szerint (Promega, Madison, WI).

Felnőtt és idős egerek teljesítménye egy 5 napos felvételi szakaszban a Morris vízi labirintusban. A felnőtt és idős egereknek kontroll vagy resveratrollal kiegészített étrendet biztosítottak 4 héten keresztül, és az étrend-kiegészítés negyedik hetében az állatokat 5 napos elsajátítási szakaszban képezték ki. Úszott távolság (A), késés a platformig (B) és az úszási sebesség (C) felnőtt és idős egereknél is mértük. Az adatpontok az átlag ± standard hiba (SEM) értékét jelentik (n = 11–13). A csillaggal (*) vagy a számjellel (#) jelölt eszközök az LPS után jelentősen eltérnek (p. 3A – C. Ábra). Az LPS injekció után 4 órával úszott távolság elemzése az étrend (F [1, 61] = 5,01, p = 0,02) és az LPS (F [1, 61] = 12,70, p = 0,007) jelentős fő hatásait tárta fel. A platform késleltetése 4 órával az LPS után elemezte az életkor (F [1, 61] = 4,52, p = 0,03) és az LPS (F [1, 61] = 6,70, p = 0,01) és az LPS ( az étrend jelentősége (F [1, 61] = 2,82, p = 0,09), valamint az életkor × étrend (F [1, 61] = 3,67, p = 0,06) és az életkor × LPS (F [ 1, 61] = 3,40, p = 0,06) kölcsönhatások. A post hoc összehasonlítások azt mutatták, hogy az LPS károsodott tanulásban és memóriában volt, úgymint úszott távolság (t [61] = 3,86, p = 0,006) és a platformra való késés (t [61] = 3,87, p = 0,007) 4 órával az LPS után csak időseknél egerek. Figyelemre méltó, hogy az LPS által kiváltott munkamemória-gátlást időseknél teljesen blokkolták a resveratrol étrend-kiegészítők, amelyeket úszott távolság (t [61] = 3,57, p = 0,01) és a platformra való késés (t [61] = 3,72, p = 0,01).

A resveratrol 4 órával az LPS injekció után javítja az idős egerek károsodott térbeli munkamemóriáját. 5 napos megszerzési tréning után az egereket 4 órával a lipopoliszacharid (LPS) injekció beadása után egy fordított tesztben értékeltük. A platformig úszott távolság (A), késés a platform megtalálásához (B) és az úszási sebesség (C) felnőtt és idős egerek esetében is értékelték. A sávok az átlag ± standard hibát (SEM) jelentik (n = 11–13). A különböző betűkkel (a vagy b) rendelkező eszközök jelentősen eltérnek egymástól (p. 4A – C. Ábra). Az úszott távolság elemzése az étrend jelentős fő hatását mutatta ki (F [1, 65] = 3,17, p = 0,05), valamint az étrend × LPS szignifikancia irányába mutató tendenciát (F [1, 65] = 3,18, p = 0,06). kölcsönhatás. A platform késleltetésének elemzése az LPS után 24 órával az életkor (F [1, 63] = 3,94, p = 0,05) és az LPS (F [1, 63] = 4,84, p = 0,03), valamint az LPS jelentős fő hatásait mutatta ki. az étrend × LPS (F [1, 63] = 3,15, p = 0,08) kölcsönhatás jelentőségének tendenciája a késés és a platform között. A post hoc összehasonlítások azt mutatták, hogy az LPS-indukálta tanulási zavarok csak idős egerekben maradtak fenn, az úszás távolságának (t [65] = 3,43, p = 0,04) és a platformra való késéssel (t [63] = 3,39, p = 0,03) értékelve. Az LPS-t kapott idős állatoknál a 4 órás időponthoz hasonlóan a munkamemória teljesen helyreállt resveratrol étrend-kiegészítéssel, amelyet úszott távolság (t [65] = 3,03, p = 0,06), valamint a peron késleltetése (t [ 63] = 2,23, p = 0,04). Ezek az adatok azt jelzik, hogy az új platformpozíció és a térbeli jelek meglévő emlékeivel való integrálásának képességét a perifériás immunstimuláció megzavarja, és az életkorral együtt jár. Megmutatták továbbá, hogy a resveratrollal kiegészített étrend jelentős védelmet nyújtott a teljesítmény ezen csökkenéseivel szemben.

Ebben a tanulmányban pragmatikus megközelítést fogadtunk el a resveratrol étrend-kiegészítőként történő szállításával. A többi polifenolhoz hasonlóan a resveratrol orális biohasznosulása alacsony a gyors kiválasztódás és a különféle glükuronid- és szulfátkonjugátumokká történő kiterjedt metabolizmus miatt. 45,46 Ennek ellenére a vörösbor mérsékelt fogyasztása, ahol a rezveratrol nagyon koncentrált, a szív- és érrendszeri betegségek és a rák kockázatának csökkenésével jár. 47,48 Ezenkívül számos jelentés megerősítette, hogy a szájon át alkalmazott resveratrol felszívódik, átjut a vér-agy gáton és beépül az agyba. 49–52 A resveratrol gyulladáscsökkentő hatása idős egerekben összekapcsolható azzal a képességével, hogy gátolja a génátírásban szerepet játszó tényezőket, mint például a mitogén-aktivált protein-kináz (MAPK), az AP-1 és az NF-κB. 25 A rezveratrol az NK-B kináz gátlásával befolyásolja az NF-κB-t, megakadályozva ezzel az NF-αB transzlokációját a sejtmagba. 25,53, hogy ez hogyan fordul elő, nem világos; azonban előfordulhat, hogy a resveratrol aktiválja a SIRT1-et, a nikotinamid-adenin-dinukleotid (NAD) + -függő hiszton-dezacetilázok sirtuin-osztályának enzimjét, amely az NF-κB-t dezacetilálja, ezáltal inaktiválja a transzkripciós faktort. 54,55

Nemrégiben Adler és mtsai. 56 kimutatta, hogy az NF-κB jelátvitel gátlása öreg egereknél a szöveti tulajdonságokat és a globális génexpressziót visszavitte a fiatal egerekéhez. Ez a fajta „fiatalítás” azt sugallja, hogy az NF-κB folyamatos aktiválása elősegítheti az öregedési folyamatot. Számos tanulmány kimutatta, hogy a SIRT1 az NF-κB transzkripció hatékony inhibitora. A SIRT1 és az NF-κB közötti jelátviteli kapcsolat különösen érdekes az öregedés szempontjából, mert számos tanulmány szerint a SIRT1 az NF-κB jelátvitel gátlásával meghosszabbítja az élettartamot, és ez elegendő az életkorral összefüggő génexpressziós változások visszafordításához. egerekben. 54,56,57 Fontos megjegyezni, hogy a resveratrol nem gátolta az LPS hatásait fiatal felnőtteknél. Ez azért fontos, mert a fertőzésre adott immunológiai és viselkedési válaszok célja, hogy segítsék a gazda fertőző ágensek elleni küzdelmét. Azonban LPS-sel kezelt öreg egerekben a resveratrol csökkentette az IL-1β-t a periférián és az agyban, és javította a mozgásszervi viselkedést és a hippokampus-függő térbeli munkamemóriát. Ennek megfelelően a resveratrol neuroprotektívnek bizonyulhat a korral járó ideggyulladással szemben azáltal, hogy csökkenti az NF-κB jelátvitelt és helyreállítja az LPS-re adott választ fiatalabb kohorszuk válaszával.

A mechanizmustól függetlenül a jelenlegi eredmények azt sugallják, hogy a resveratrollal végzett étrend-kiegészítés fontos szerepet játszhat a fertőzés idős személyek viselkedésére és megismerésére gyakorolt káros hatásainak megfordításában. Ezek a megállapítások támogathatják a természetes vegyületek szerepét, mint lehetséges megelőző és/vagy kiegészítő terápiát számos, neuroinflammáció által okozott neurodegeneratív betegség esetén.

Köszönetnyilvánítás

Ezt a kutatást az Országos Egészségügyi Intézet (NIH) támogatta az AG16710 és az MH069148 támogatásokkal (R.W.J. részére). J.A. támogatja az NIH Ruth L. Kirschstein Intézményi Nemzeti Kutatási Szolgálat 5T32 DK59802 díj, amelyet az Országos Cukorbetegség és Emésztőrendszeri és Vesebetegségek Intézete (NIDDK) az Illinois-i Egyetem táplálkozástudományi osztályának támogat.

Szerző közzétételi nyilatkozata

Nincsenek tényleges vagy potenciálisan versengő érdekek.