Tetrodotoxint termelő baktériumok: A toxin kimutatása, eloszlása és migrációja vízi rendszerekben

Timur Yu. Magarlamov

1 Nemzeti Tengeri Biológiai Tudományos Központ, Távol-keleti részleg, Orosz Tudományos Akadémia, Vladivostok 690041, Oroszország; [email protected] (T.Y.M.); ur.ufvd@id_avokinlem (D.I.M.); [email protected] (A.V.C.)

2 Biomedicina Iskola, Távol-Keleti Szövetségi Egyetem, Vladivostok 690090, Oroszország

Daria I. Melnikova

2 Biomedicina Iskola, Távol-Keleti Szövetségi Egyetem, Vladivostok 690090, Oroszország

Alekszej V. Csernyev

3 Természettudományi Iskola, Távol-Keleti Szövetségi Egyetem, Vladivostok 690090, Oroszország

Absztrakt

1. Bemutatkozás

A tetrodotoxin (TTX) egy nem fehérjeszerű neurotoxin, amely blokkolja a feszültségtől függő nátrium (Na +) csatornákat az ideg- és izomszövetekben. A TTX iránti kezdeti érdeklődés a TTX-et tartalmazó tenger gyümölcseinek fogyasztása által okozott számos ételmérgezés következménye.

Az 1960-as években a TTX széles körű népszerűségre tett szert a kísérleti neurobiológia eszközeként, bár a közelmúltban szélesebb körű érdeklődés mutatkozott a toxin terápiában történő alkalmazása függőség, epilepszia, helyi és általános érzéstelenítő és fájdalomcsillapító, valamint egyéb orvosi célokból [1 ]. A TTX-et 1909-ben fedezte fel először Yoshizumi Tahara, aki kivonta a toxint a globefish (fam. Tetraodontidae) petefészkeiből, bár a pufferhalak toxicitása már régóta ismert [2]. A TTX-et először az 1950-es években izolálták kristályos formában [3], és az 1960-as években kromatográfiásan extrahálták [4].

További vizsgálatok ezt a neurotoxint számos tengeri és néhány szárazföldi állatban és tengeri algákban találták [5,6,7,8]. A TTX széles körű előfordulása az eukarióta organizmusok filogenetikailag elkülönülő csoportjaiban lehetővé teszi a toxin bakteriális eredetének feltételezését. E hipotézis szerint a TTX-t hordozó organizmusok szimbiotikus/asszociatív TTX-termelő mikroflórája a toxin kezdő forrása a gazdaszervezetben. Van azonban néhány érv az asszociatív mikroflóra hozzájárulása ellen a gazdaszervezet mérgezésében. Például TTX-termelő baktériumokat találtak a legtöbb, de nem minden TTX-tartalmú fajnál (lásd alább). Sőt, a baktériumtörzsek által termelt TTX szintje sokkal alacsonyabb, mint a toxin koncentrációja a gazdaszervezetben. A tengeri és édesvízi üledékekben a TTX-termelő baktériumok kimutatása lehetővé tette a TTX bioakkumuláció feltételezését az élelmiszerlánc mentén elhelyezkedő kis zooplankton és detritus adagolókon keresztül [9]. A TTX-termelő baktériumokról szóló számos adat ellenére a mikroorganizmusok hozzájárulása a TTX bioakkumulációjához a tengeri ökoszisztémákban még mindig vita tárgyát képezi.

A TTX-t termelő tengeri baktériumokról szóló közelmúltbeli áttekintés [10] hangsúlyozta a tengeri élőlényekkel társult TTX-t termelő mikroflóra rendszertani sokféleségét és földrajzi eloszlását. Számos kérdést, például a toxin migrációs útját a baktériumokból a gazdaállatok testébe és az azt követő toxinok bioakkumulációja, valamint a kapcsolódó mikroflóra hozzájárulása a szervezet toxicitásához nem tárgyalták. A biológiai mintákban a toxin detektálásának bonyolultsága a TTX detektálási módszerek sokféleségét eredményezi, amelyek különböző cselekvési elveken alapulnak. A baktériumminták egyes kimutatási módszereinek hatástalanságát fontolóra kell venni, mielőtt következtetést vonnánk le egy adott törzs TTX-termeléséről.

Ez az áttekintés a mikrobiális termelők TTX kiválasztási mechanizmusaira és a baktériumokból a gazdaszervezetekbe történő toxinvándorlásra összpontosít. Szóba kerül a tengeri TTX-termelő baktériumok ökológiája és földrajzi elterjedése is. Különös figyelmet fordítanak a TTX kimutatási módszerekre és a megfelelő adatok megbízhatóságára, különös hangsúlyt fektetve a toxin kimutatására hamis pozitív eredményekre hajlamos módszerekre.

2. A TTX detektálás módszerei

Jelenleg számos módszer létezik a TTX kimutatására biológiai mintákban, beleértve a baktériumokat is (1. táblázat). A TTX kimutatási módszereket három különböző módszertani megközelítésre osztják a toxin fizikai-kémiai tulajdonságai, antigénspecifitása és neurotoxikus hatása alapján.

Asztal 1

Általános módszerek a tetrodotoxin (TTX) kimutatására baktériumokban.

alacsony pontosság a biológiai tárgyak egyéni változékonysága miatt;

kevés érvényesítési adat;

az egerek vásárlásának nehézségei;

alacsony specificitás, csak a teljes Na-csatornát blokkoló toxin koncentráció meghatározását teszi lehetővé a mintában

2. táblázat

A vízi rendszerekből izolált TTX-termelő baktériumok.

TTX-termelő mikroorganizmus A törzsek száma Az izolálás forrása * Hely TTX detektálási módszer Kimutatott toxinok TTX koncentráció (µg/ml) Referenciák

Vibrio sp.	1	xanthid rák Atergatis floridus	Japán	HPLC – FLD GC – MS	TTX anhydro-TTX	NM	[26]
Pseudomonas sp.	1	vörös alga Jania sp.	Japán	HPLC – FLD HPLC – FAB – MS MBA	TTX anhydro-TTX	2. táblázat). A TTX-t termelő baktériumok ilyen földrajzi eloszlása nagyrészt annak az állatnak a rendszertani sokféleségének köszönhető, amelyhez társulnak. Az e régiókban élő állatok közötti nagy verseny miatt néhányuk a toxint termelő baktériumok szimbiózisára összpontosít. A TTX-t termelő törzseket azonban több, boreális szélességben élő nemertean fajból [43,57] és kéthéjú puhatestűből [61] izolálták. Az elmúlt években a Földközi-tengeren és az Atlanti-óceánon találtak TTX-tartalmú pufferhalakat [72,73], haslábúakat [74,75,76,77,78] és kéthéjú kagylókat [61,62]. Feltételezzük, hogy a TTX-t hordozó állatok európai vizekben való megjelenésének fő okai a globális óceán hőmérsékletének emelkedése és a Vörös-tengeren élő fajok vándorlása a Suez-csatornán keresztül [2]. Meg kell azonban jegyezni, hogy a hőmérséklet növekedése vagy csökkenése befolyásolhatja a növekedési sebességet, az anyagcserét és a szimbiotikus mikroorganizmusok sokféleségét. A pufferhal T. niphobles különféle szerveinek mikrobiális összetételéről szóló vizsgálatok azt mutatták, hogy a hőmérséklet csökkenése csökkentette a társult baktériumok sokféleségét és túlélését [79]. A lagocephalus lunaris-ban január és március között 25–26 ° C-os vízhőmérsékleten kimutatott magas TTX-koncentráció egybeesett a szimbiotikus baktériumok, a Shewanella putrefaciens fokozott toxintermelésével ugyanabban az időszakban [56]. A többi hónapban 29–30 ° C-os vízhőmérsékleten ennek a törzsnek az aktív növekedése volt megfigyelhető, de a baktériumok által termelt toxintermelés és a pufferhalak toxinkoncentrációja jelentősen csökkent.

4. A TTX-t termelő baktériumok taxonómiai sokfélesége

A tengeri és édesvízi üledékekből származó TTX-tartalmú organizmusok kutatása során 31 baktérium nemzetség TTX-termelő képviselőjét izolálták (2. táblázat). Az izolált törzsek többsége a Proteobacteriumok és a Gammaproteobacteriumok osztályába (Vibrio, Aeromonas, Pseudomonas, Shewanella, Alteromonas stb. Nemzetségek) tartozott, de Alphaproteobacteria (Caulobacter és Roseobacter nemzetségek) és Betaproteobacteria (Alcaligenes nemzetség) osztályok is megtalálhatók 1.ábra ). A phyla Firmicutes (Bacillus, Lysinibacillus és Enterococcus nemzetség), Bacteroides (Flavobacterium és Tenacibaculum nemzetség) és Actinobacteria (Actinomycetes, Microbacterium, Micrococcus és Nocardiopsis nemzetségek) TTX-termelő baktérium törzsei ritkábban fordultak elő.

A TTX-t termelő baktériumok taxonómiai összetétele. A diagram 150, eddig talált TTX-termelő törzs elemzésén alapul.

Az irodalomban legalább 150 TTX-termelő baktérium törzsről számoltak be (2. táblázat). A TTX-t hordozó sok állatban talált Vibrio nemzetség képviselői az összes TTX-termelő törzs több mint 30% -át teszik ki. A legtöbb tanulmány összefüggést mutat a toxintermelés és az V. alginolyticus jelenléte között a vízi állatok mikroflórájában [28,29,35]. A Bacillus nemzetség képviselői az izolált TTX-termelő törzsek körülbelül 15% -át teszik ki. A Pseudomonas, Aeromonas, Alteromonas, Streptomyces és Roseobacter törzsek a TTX-t termelő baktériumok 7% -át teszik ki. Más nemzetségeket csak egy-egy törzs képvisel.

A TTX-t termelő törzsek többségében meghatározták általános helyzetüket; az izolált törzsek csupán 25% -át azonosították fajként (2. táblázat). A baktériumok TTX szintézisének fajspecifitása jelenleg továbbra is nyitott kérdés. Mint Matsumura [23] és Strand és mtsai. [25] kimutatták, hogy az V. alginolyticus-on végzett vizsgálatok azt mutatták, hogy ennek a fajnak nem minden törzse képes TTX előállítására. Más fajokon még nem végeztek hasonló vizsgálatokat, köztük néhány TTX-termelővel; ezért nem zárhatjuk ki annak lehetőségét, hogy csak bizonyos törzsek képesek szintetizálni a toxint.

5. TTX-termelő baktériumok, mint a gyógyszer ígéretes forrása a gyógyszeripar számára

Egyedülálló felépítésének köszönhetően a TTX és analógjai blokkolják az intermembrán áramokat az ingerlõ szövetekben (izmos és ideges) anélkül, hogy megzavarnák a környezõ szövetek homeosztázisát. Ezt a toxin tulajdonságot széles körben használják a neurobiológiában [80,81]. A TTX erős fájdalomcsillapító hatása meghatározza sikeres alkalmazását az orvosi gyakorlatban. A TTX-alapú gyógyszereket klinikai vizsgálatokban tesztelték, felhasználhatók általános és helyi fájdalomcsillapítóként [82], valamint helyi érzéstelenítésként [83]. A toxin gyógyszerészeti szempontból érdekes, mint neuroprotektív szer a stroke által okozott ischaemiás agykárosodásban, valamint renoprotektív és antinociceptív szerként [59].

Jelenleg a TTX gyártásának egyetlen módszere a pufferhal mérgező szerveiből származó toxin kivonáson alapul. Ez a módszer alacsony hatékonysággal rendelkezik, és negatív hatással van a vízi ökoszisztémára, aláássa a Tetraodontidae család TTX-tartalmú halainak populációját [84]. A toxin sikeres kémiai szintézisére tett kísérletek is ismertek, de ezek alacsony végtermékhozamhoz vezettek [85]. A baktériumok termelőinek használata a gyógyszergyártásban jövedelmezőbb, és nagy érdeklődést vált ki a tengeri baktériumok, mint TTX-forrás iránt.

Röviden: a baktériumtermesztés és a TTX-szintézis optimális feltételeinek hiánya és a toxintermelő képesség gyors elvesztése megakadályozza a baktériumok ipari méregtermelésben történő felhasználását gyógyszergyártáshoz és bonyolítja az új TTX-termelő törzsek keresését.

6. Megbeszélés

Noguchi és munkatársai felfedezték az első baktérium TTX-termelőket. [26] több mint 150 TTX-termelő törzset találtak különféle taxonómiai csoportokból (Proteobacteria; Firmicutes; Actinobacteria; Bacteroidetes) (1. ábra). A toxintermelő törzseket túlnyomórészt a tengeri környezettől izolálták, beleértve a TTX-t hordozó organizmusok asszociatív/szimbiotikus mikroflóráját és a tengeri üledéket is (2. táblázat). Ha a tengeri baktériumok által okozott toxintermelés ténye nem kerül megvitatásra, a TTX vándorlása a tengeri környezetben számos kérdést felvet.

A toxint termelő baktériumokból a környezetbe történő TTX extrakció mechanizmusát feltételezzük, hogy: (1) sejthalál; (2) passzív/aktív toxin kiválasztás a sejtekből; (3) spóraképző baktériumok spóracsírázása (2. ábra). Jelenleg a baktériumok TTX környezetbe történő kiválasztásának folyamatát csak a Bacillus nemzetség képviselői számára javasolták [57]. TTX kimutatása a Bacillus sp. Sp. Elősejtjeinek és szabad spóráinak sejtfalán, magjain 1839 arra a felvetésre vezetett, hogy a spóraképző baktériumok sporangiumából felszabaduló szabad és érett spórák méreganyagok felszabadulásához vezettek a környezetben. Számos tanulmány kimutatta a TTX megjelenését mind a tápoldatban, mind a sejtekben a Vibrio törzsek folyékony táptalajban történő tenyésztése során [28,35,48]. A baktériumok toxinfunkciójának feltárása segít megválaszolni azt a kérdést, hogy a TTX vándorlása a baktériumsejtekben irányított vagy spontán jellegű-e.

A toxintermelő baktériumokból a környezetbe történő TTX vándorlás javasolt mechanizmusai.

Williams [70] feltételezte, hogy a TTX széles eloszlása a mikroorganizmusok között a toxin fontos szerepét jelzi a baktériumok számára, de ez a szerep ismeretlen. A szabadon élő TTX-termelő baktériumok léte cáfolja a fő hipotézist, a TTX-t mint másodlagos metabolitot, amely a gazdaszervezet céljára szekretálódik [1]. Egy adott anyag molekuláris célpontjainak keresése az egyik módszer funkcionális hozzárendelésükhöz. Egy állat gerjesztő szöveteinek nátriumcsatornái az egyetlen ismert TTX célosztály [88]. Így a TTX egy baktériumsejtben az ionáramlás szabályozója lehet a feszültségtől függő nátriumcsatornákon keresztül. Ezen állítás igazolásához meg kell vizsgálni a toxintermelő baktériumok feszültségfüggő nátriumcsatornáinak TTX érzékenységét. Jelenleg 500 ismert homológ közül csak 89 baktériumfeszültség-függő nátriumcsatornán igazolták a TTX érzékenységet [89]. Mindkét csatornát a nem toxikus Bacillus halodurans baktériumból izolálták, és nagy ellenálló képességgel bírtak a toxinnal szemben [90].

7. Következtetések és jövőbeli perspektíva

Eddig a mikrobiális TTX-termelők biológiai sokféleségével és az állatok mérgezésében való részvételükkel kapcsolatos kérdéseket jobban megvizsgálták, mint a TTX bioszintézisének kérdését és a toxin baktériumsejtekben betöltött szerepét. A baktériumok termelőiben a TTX bioszintézis genetikai alapjának dekódolására tett kísérleteket a közelmúltban kezdték meg. Liu és mtsai. [87] pozitív korrelációt mutattak a pNE-1 plazmid másolatai és a TTX koncentráció között az Aeromonas sp. Ne-1. Egy másik tanulmány feltárta a nem riboszomális peptid-transzferáz jelenlétét, amelyről feltételezik, hogy részt vesz a TTX guanidin csoport szintézisében, a TTX termelő baktérium törzsekben [22]. A TTX bioszintetikus útjainak és funkcióinak dekódolása a baktériumsejtekben elengedhetetlen a TTX további természetes forrásainak vizsgálatához. Nyilvánvaló, hogy sok mikroorganizmus képes TTX termelni, de szintézise ismeretlen körülményektől függ; vagyis a toxint nem lehet folyamatosan kimutatni a baktériumtenyészetben. A TTX-pozitív baktériumok hiánya egyes TTX-t hordozó állatokban [108] a TTX-szintézis opcionális jellegével magyarázható, bár a nem termesztett TTX-t termelő baktérium törzsek lehetséges létezését is figyelembe kell venni.

Köszönetnyilvánítás

A jelen munkát anyagilag az Orosz Tudományos Alapítvány támogatta (projekt száma: 15-15-20026).

Tetrodotoxint termelő baktériumok: A toxin kimutatása, eloszlása ​​és migrációja vízi rendszerekben