Új gomba-rovar szimbiózis: tenyésztési, molekuláris és szövettani módszerek határozzák meg az Ambrosiodmus Ambrosia Bogarak szaprofita polyporalesének kölcsönös képviselőit

Li Te

1 Erdei Erőforrás- és Természetvédelmi Iskola, Élelmiszer- és Agrártudományi Intézet, Floridai Egyetem, Gainesville, Florida, Amerikai Egyesült Államok,

David Rabern Simmons

1 Erdei Erőforrás- és Természetvédelmi Iskola, Élelmiszer- és Agrártudományi Intézet, Floridai Egyetem, Gainesville, Florida, Amerikai Egyesült Államok,

Craig C. Bateman

2 Entomológiai és Nematológiai Tanszék, Élelmiszer- és Agrártudományi Intézet, Floridai Egyetem, Gainesville, Florida, Amerikai Egyesült Államok,

Dylan P. G. Short

3 Növény- és Talajtudományi Osztály, Nyugat-Virginia Egyetem, Morgantown, Nyugat-Virginia, Amerikai Egyesült Államok,

Matthew T. Kasson

3 Növény- és Talajtudományi Osztály, Nyugat-Virginia Egyetem, Morgantown, Nyugat-Virginia, Amerikai Egyesült Államok,

Robert J. Rabaglia

4 Erdő-egészségvédelem, állami és magánerdészet, Egyesült Államok Mezőgazdasági Minisztériuma Erdészeti Szolgálat, Washington, Columbia körzet, Amerikai Egyesült Államok,

Jiri Hulcr

1 Erdei Erőforrás- és Természetvédelmi Iskola, Élelmiszer- és Agrártudományi Intézet, Floridai Egyetem, Gainesville, Florida, Amerikai Egyesült Államok,

2 Entomológiai és Nematológiai Tanszék, Élelmiszer- és Agrártudományi Intézet, Floridai Egyetem, Gainesville, Florida, Amerikai Egyesült Államok,

A kísérletek megtervezése és megtervezése: JH LY DRS CCB DPGS MTK RJR. Végezte a kísérleteket: LY DRS CCB MTK DPGS. Elemezte az adatokat: LY DRS CCB MTK DPGS. Hozzájáruló reagensek/anyagok/elemző eszközök: JH MTK RJR. Írta az írást: DRS JH LY CCB DPGS MTK.

Társított adatok

A MiSeq szekvenciákat letétbe helyeztük az NCBI Sequence Read Archive SRP058537 csatlakozásban. A Sanger szekvencia adatait a GenBank KR119072 – KR119080 és KR871005 – KR871009 hozzáférésekben rakták le.

Absztrakt

Bevezetés

Az ambrosia bogarak (Coleoptera: Curculionidae: Scolytinae és Platypodinae) a hiper-sokszínű kéregbogarak kládjainak polifiletikus gyűjteménye. Az ambróziai bogarak kifejlesztették a gombatermesztésnek vagy gombatermesztésnek nevezett szimbiotikus evolúciós módot. A több mint 3200 ismert ambrosia bogárfaj táplálékot a bőséges, mégis ellenszenves szubsztrátokon - elhalt fákon és fa részeken - termesztett gombákból nyer. A bogarak specifikus gombaszimbiontusok oltóanyagát szállítják szülőgalériájukból az újonnan létrehozott galériákba egy mycangium nevű tároló szervben [1]. A mikangiumok elhelyezkedése és morfológiája fajonként változó, beleértve a preoralis, a mandibuláris, az elytralis, a mesothoracus és még sok mást [2], és a legtöbb esetben filogenetikailag erősen konzervált [1,3]. Az ambrosia bogarak egyetlen megerősített gombás szimbóluma eddig az ascomycotan gomba (Ascomycota: Sordariomycetes) volt, amelyeket kezdő élesztőszerű pszeudo-micéliumként vagy konídiumként szállítottak [4]. Valamennyi vizsgált esetben a gombák ökológiailag „korai gyarmatosítók”, amelyek a frissen elhalt fa tápanyagainak kinyerésére specializálódtak, de nincsenek számottevő cellulolitikus képességük [5], és a legtöbb ambrosialis bogár-gomba pár gyarmatosítja a nemrég leölt (elhalt) fákat.

Az ambróziai bogarak gazdaságilag és ökológiailag egyre fontosabbá válnak. Számos nem őshonos faj véletlenül került be az új régiókba a nemzetközi kereskedelem révén, és számos ilyen esetben a korábban ártalmatlan bogárfajok invazív kártevőkké váltak [6–8]. Legalább négy esetben az ambrosia bogár-gomba szimbiontjai akut és folyamatos járványokat váltottak ki a fogékony gazdafák között [8–12].

Az Ambrosiodmus (1. ábra; [21–23]) az ambrosia bogarak legnagyobb csoportjában, a Xyleborini-ban (1200 spp .; Coleoptera: Scolytinae) 80 faj nemzetsége. A nemzetség több okból is szorosabb vizsgálatot érdemel. Míg gazdasági jelentősége minimális, változatos és globálisan elterjedt nemzetség. Számos faj ökológiai szempontból sikeres és bőséges az egész elterjedési területén. A huszadik században a fajok egyre inkább megtelepedtek a nem őshonos élőhelyeken ember által támogatott betelepítések révén. Csak az Egyesült Államokban az eredetileg Asiatic A. rubricollis Eichhoff [24] közel öt évtizede volt jelen [25]. Újabban az A. minor Stebbing [26], amely korábban csak Dél-Ázsiából volt ismert [22], az USA legalább három délkeleti államában elterjedt [27,28].

Jegyezzük meg a fehér gombás micéliumkertet (nyilak) a galériában.

Míg az ambrosia gombák és az ambrosia bogarak többsége az újonnan elhalt és viszonylag friss faszövetektől függ, úgy tűnik, hogy az Ambrosiodmus fajok képesek kolonizálni a fát bomlási folyamata során, ideértve az utolsó szakaszokat is, amikor a xylem versenyképes fadarabgombákkal együtt kolonizálódik . Filogenetikailag az Ambrosiodmus testvére az Ambrosiophilusnak, az ambrosia bogarak szokatlan nemzetségének, amelyek közül sok elvesztette képességét saját gombakertjeinek művelésére, és függ a mycocleptyától vagy a gombalopástól [1]. Az ilyen egyedülálló ökológiai jellemzők és a filogenetikai helyzet arra utalnak, hogy más gombákkal társulhatnak, mint amelyek általában más ambrosia bogarakhoz társulnak, ám az Ambrosiodmus symbiontokról gyakorlatilag semmit sem tudni. Az Ambrosiodmusban található mikangiumokról és gombás szimbiontusokról szóló egyetlen jelentés az A. rubricollis-t [24] vizsgálta, és meghatározta a preoralis mycangia jelenlétét a labrum mögött lévő mandibulák tövénél [29]. A mikangiális tartalmat gömbölyű konídiumoknak és rövid hifális töredékeknek írták le, amelyek agaron termesztve „csak fehér gyapjas micéliumot” eredményeztek.

Az Ambrosiodmus gombás szimbiontjainak jelenlétének és azonosságának tisztázása, valamint a nemzetség ökológiai szokásainak és sikerének feltételezése érdekében az ambrosia bogár nemzetséghez tartozó gombákat jellemeztük, és teljesen váratlan szimbiontusokat találtunk. Három különböző Ambrosiodmus fajra összpontosítottunk: A. lecontei Hopkins [23], A. minor és A. rubricollis, amelyek mind az eurázsiai, mind az amerikai faunát képviselik. Átfogó kiegészítő megközelítéscsomagot alkalmaztunk, ideértve a kvantitatív tenyésztést a fő szimbolikus jellemzéshez, a kultúrától független nagy áteresztőképességű közösségi szekvenálást az esetleges nem kulturálható szimbiontok kimutatásához, a bogár anatómiai elemzését a mikangiumok és azok tartalmának jellemzésére, és morfológiai keresztellenőrzés a mycangiumokban és a tenyésztett gombákban a symbiont azonosság mikroszkópos vizsgálatával.

Anyagok és metódusok

Gombák izolálása és tenyésztése gazda bogarakból és galériákból

Az Ambrosiodmus domináns gombás szimbiontjainak elkülönítésére három bogárfajból vettünk mintát: A. lecontei (őshonos az USA délkeleti részén), A. rubricollis (Japánban őshonos, de az Egyesült Államokban széles körben elterjedt) és A. minor (őshonos Észak-Ázsia és nemrégiben az USA-ban alakult). Mindhárom faj nőstény példányait fénycsapdával (2014. augusztus és 2015. április között) és a Myrica cerifera (A. lecontei), a Liquidambar styraciflua (A. rubricollis) és a Platanus occidentalis (A.) moribundától korhadt fáig gyűjtötték. kisebb), az amerikai floridai Gainesville-ben (29 ° 37 ′ 16 ″ É 82 ° 22 ′ 32 ″ Ny). A gyűjtést egy egyetemi ingatlanon és a vezető szerző magánvagyonán végezték, és nem igényelt engedélyeket. Az ambrosiodmus nincs veszélyben. A hímeket nem vették fel elemzéseinkbe, mivel az összes Xyleborini ambrosia bogár hím röpképtelen, ritka, és hiányzik belőlük a szimbiotikus gombák szállításához szükséges mikangium [30]. Az élő bogarakat és a faanyagokat tiszta edényekben, steril vízzel megnedvesített törlőkendővel szállítottuk a laboratóriumba. A laboratóriumban végzett azonosítást követően az egész bogarakat 1 percig vortexeljük, 1 ml steril desztillált vízben, egy kis csepp (5′-CTTCCCTTTCAACAATTTCAC-3 ’) felületen mossuk.

Mycangiális jelenlét és tartalom

Gombamorfológia agar táptalajon

Az Ambrosiodmus gomba szimbiontjainak morfológiájának dokumentálásához hat izolátumot használtunk, amelyeket mindhárom Ambrosiodmus faj fejéből kinyertünk, valamint két izolátumot, amelyek az A. minor és az A. rubricollis galériáiból kerültek elő (1. táblázat). Az izolátumokat PDA táptalajon tenyésztettük, és három hétig 20 ° C-on inkubáltuk. A hifákat aszeptikusan eltávolítottuk a reprezentatív gomba telepek széleiről, és mikroszkópos vizsgálatot végeztünk egy Nikon Eclipse 55i készülékkel, amely ProgRes® SpeedXT core 3 kamerával volt felszerelve (Jenoptik Optical Systems).

Asztal 1

SzubkultúraEredeti kultúraGazda vagy társult bogárSzigetelési forrásBecsült CFU

6853	6853_white_myce	Ambrosiodmus minor	Fej kivonat	1500
6855	6855_white_myce	A. kiskorú	Fej kivonat	1500
6860	6860_sub_white_myce	A. lecontei	Fej kivonat	4000
7324	7324_white_myce	A. lecontei	Fej kivonat	-
7346	7346_white_myce	A. kiskorú	Galéria a Platanus occidentalis-ban	-
7353	7326_white_myce	A. rubricollis	Fej kivonat	30
7354	7341_white_myce	A. rubricollis	Fej kivonat	100
7373	7325_white_myce	A. rubricollis	Galéria Liquidambar styraciflua-ban	-

Eredmények

Gombák izolálása és tenyésztése gazda bogarakból és galériákból

A három Ambrosiodmus faj egyedei legalább két fejkivonat izolációs eseményben egyetlen gomba morfotípust tartalmaztak, és az azonos domináns morfotípusú becsült CFU-k különböző izolációs eseményekből 10 és 4000 között voltak (1. táblázat). A szubkultúrákat PDA ferde üvegcsékbe krioarchiváltuk, 15% glicerinbe merítettük, és -80 ° C-on tároltuk, majd letétbe helyeztük a floridai egyetem Hulcr-gyűjteményében és az Erdészeti és Mezőgazdasági Biotechnológiai Intézet (FABI) gombakultúra-gyűjteményében (CMW). Pretoriában, a dél-afrikai Gauteng tartományban.

Az aktív Ambrosiodmus galériákat rendszeresen megtalálták a korhadt fában. Az Ambrosiodmus galéria szomszédságában lévő fa jellemzően puha és szivacsos volt, a területet sötét vonalak vették körül (2. ábra). Ezek a vonalak a ko-kolonizált elhalt fák genetikailag elkülönülő bomlási gombái közötti antagonista kölcsönhatások általános eredményei. Az eddig vizsgált egyéb ambrosia gombák nem képeznek ilyen védekezési zónákat.

Filogenetikai elemzések

Flavodon vö. flavus izolátumok, zárójelben gazda bogárral, a Polyporales flebioid kládján belül. A csomópontokban lévő értékek ≥70% ML bootstrap támogatást jeleznek, a megvastagodott ágak pedig ≥95% bayesi posterior valószínűségi támogatási értékeket jeleznek.

Gombaközösség amplikon elemzése

Mycangia vizsgálata

Az összes nőstény A. lecontei fejének keresztirányú keresztmetszete megerősítette, hogy a vizsgált 11 bogár közül kilencben (4A és 4B. Ábra) egy pár preorális mycangia volt jelen a mandiblia tövében. Két megmaradt bogárfejet nem lehetett megjeleníteni a paraffinbeágyazás alatti optimális tájolás miatt. A mikangiális tartalom változó átmérőjű hifák szorosan összepakolt tömege volt (4C. Ábra). Konidiumokat vagy kezdő pszeudo-micéliumot nem figyeltek meg.

(A) Az egész fej, a mandibulák mögött párosított mikangiumokkal, szaggatott vonallal, amely a hiányzó exoskeletalis szerkezetet mutatja. (B) Sűrített gombás hifák, amelyek mikangiális inokulumot alkotnak. (C) Laza hifák a mikangiális csomagból, mind kicsi (nyilak), mind pedig nagyobb (nyílhegy) hifákkal, amelyek valószínűleg dimitikus generatív és csontváz-hifákat képviselnek. (D & E) Flavodon vö. flavus 6860_sub_white_myce izolátum dimit generatív (D) és csontváz (E) hifákkal. Kulcs: E, szem; F, elülső széle (véletlenül megsérült); m, mikangium.

Gombamorfológia

PDA táptalajon a 6853_white_myce, 6855_white_myce és a 6860_sub_white_myce izolátumok dimitikus hifákat hoztak létre, amelyek nyilvánvalóan két átmérőjűek voltak, de némi eltéréssel is. Kisebb, generatív hifák (4D. Ábra) voltak jelen a telep szélén, de nagyobb, csontvázas hifák gyorsan eltakarták őket (4E. Ábra). Nem figyeltek meg reproduktív szerkezeteket és szorító csatlakozásokat.

Vita

Minden elemzés azt mutatta, hogy az Ambrosiodmus fajok mikangiumukban és kultúrájuk galériáikban tartalmazzák a Flavodon flavushoz (Basidiomycota: Polyporales) szorosan kapcsolódó ambrosialis basidiomycotan szimbiontusokat. Az Ambrosiodmus galériáit összegyűjtő gazdafák állapota, valamint a bogárcsarnokot körülvevő fa szerkezete azt jelzi, hogy a gombaszimbiont valódi fát lebontó szaprofita (2. ábra). Nagyon kevés olyan eset ismert, amikor a gomba a lebontott lignocellulózt állati szimbiontjának teljes táplálékká alakítja. Következésképpen az Ambrosiodmus-Flavodon szimbiózis metabolikus aspektusai további vizsgálatot érdemelnek.

Az A. minor-ból származó gombás izolátumok nukleáris 28S rDNS-szekvenciája egyetlen átmeneti pirimidin-mutációval különbözött az A. lecontei és A. rubricollis tenyésztett gombáinak szekvenciáitól. Ezenkívül az A. minor mintákból származó ITS rDNS szekvenciák azonosak voltak egymással, de csak 94% -ban hasonlóak az A. lecontei mintákhoz (S1 táblázat). Az Ambrosiodmus minorot a közelmúltban vezették be az Egyesült Államokba, összehasonlítva a régóta bevált A. rubricollis és az őshonos A. lecontei-vel. Ezek az összehasonlítások együttvéve azt sugallják, hogy a specifikus gombatörzsek összekapcsolódnak a bevett amerikai bogárfajokkal és a legújabb bevándorló bogárfajokkal.

Valamennyi izolátum megközelítőleg azonos mértékben kapcsolódik a Flavodon flavus állítólag származó szekvenciáihoz (3. ábra). Tekintettel a 100% -ban alátámasztott monofóliára és a hozzá illő hifális morfológiára, izolátumainkat Flavodon-nak nevezzük. flavus, amíg további elemzések nem támogatják differenciálódásukat. A Flavodon flavus Észak-Európából leírt szabadon élő fa szaprofita, amely messze kívül esik bármely Ambrosiodmus elterjedésén [44]. Ez azt jelezheti, hogy a gomba genetikai markerei még nem tértek el a szabadon élő rokontól, vagy hogy az asszociáció aszimmetrikus, amelyben a bogarak a gomba függvénye, de a gomba továbbra is képes lehet aposzimbiotikus életmódra. A legtöbb szimbiózis a rovarok és a bazidiomycotan gombák között hasonlóan aszimmetrikus; ide tartoznak a fentebb említett Siricidae darazsak és kéregbogarak, valamint néhány gombatermesztő termesz és néhány gomba növekvő attinás hangya [49].

Az ambrosia gombákban a symbiont diszpergálási mód új formájáról számolunk be: nem kezdő hyphal növekedés (4A. És 4B. Ábra). Úgy tűnt, hogy az A. lecontei mycangia változó átmérőjű hifákkal van tele (4.C ábra), ami megerősíti a dimitikus basidiomycotan gomba jelenlétét. A Flavodon flavus gombát dimitikusnak és bilincs nélküli kapcsolatoknak írták le [45], és ez a leírás megfelelt a hifáknak, amelyeket mycangiumban (4.C ábra) és az A. lecontei 6860_sub_white_myce izolátumából (4D és 4E ábra) figyeltünk meg, amelyeket molekulárisan jellemeztünk: F. vö. flavus (3. ábra).

Az Ambrosiodmus lecontei mycangia szinte biztosan homológ a néhány Xyleborini ambrosia bogár szokásos preoralis mycangiájával; így úgy tűnik, hogy a szokatlan gombaátviteli mód (hifák) az új gombaszimbiont, és nem a bogárhordozók jellemzője. Ne feledje, hogy a „preoral” kifejezést a xyleborine mycangia esetében használjuk, amelyeket hagyományosan „mandibularisnak” neveztek; a „mandibularis” kifejezést a valódi mandibularis mycangia foglalkoztatja Dendroctonusban [2].

A gombás szimbiont rDNS amplikonok és tenyésztett izolátumok szekvenciáinak MiSeq elemzéséből megállapíthatjuk, hogy a Flavodon vö. a flavus vagy a rejtjeles fajok komplexuma alkotja a gomba közösség túlnyomó többségét. Ezért valószínűnek tűnik, hogy a bogár a gombát használja elsődleges táplálékforrásként egy gazdanövényen. A szaprofita basidiomycotan gombával való társulás következtében előfordulhat, hogy az Ambrosiodmus bogár nemzetség hozzáférést kapott egy mindenütt jelenlévő erőforráshoz (elhalt és pusztuló fa), amely korábban nem volt elérhető bármely más kéreg vagy ambrosia bogár számára. A hipotézis megerősítéséhez további tanulmányokra van szükség. A fent leírt megközelítések mintául szolgálnak a szimbiológia ezen határának gyors és határozott feltárásához és jellemzéséhez. Tekintettel az ambrosia bogár- és gombafajok világszerte történő számára és az egyre növekvő kutatási fókuszra, több ilyen felfedezésre és evolúciós újításra kell számítanunk.