Új eredmények a nukleáris gangliozidokkal kapcsolatban: áttekintés az anyagcseréről és a működésről

Neurológiai és Idegtudományi Tanszék, New Jersey Medical School, UMDNJ, Newark, New Jersey, USA

Absztrakt

J. Neurochem. (2011) 116, 714–720.

Absztrakt

Használt rövidítések:

A gangliozidok, a glikoszfingolipidek sziálsavat tartalmazó alcsoportja a nukleáris burok (NE) jól megalapozott alkotóeleme, amelyek funkciója ezen a lokuszon fokozatosan egyre jobban megért. A lipidek összességében a mag viszonylag kis részét (~ 5 tömeg%) teszik ki, ami a korlátozott hitelességnek tudható be, és eredetileg azt a javaslatot adta, hogy funkciójuk meghaladhatja a strukturális támogatást. Számos laboratórium munkája az elmúlt években megalapozta a lipidek ma már elismert szerepét, mint fő jelátviteli szubsztrátumot a magban, amint azt a legutóbbi áttekintések összefoglalták (Tamiya ‐ Koizumi 2002; Irvine 2003; Albi és Viola Magni 2004; Ledeen és Wu 2006). Kimutatták, hogy a GM1, az ÉK egyik fő gangliozidjának fő szerepe a Ca 2+ -szabályozásra összpontosít egy Na +/Ca 2+ -cserélő (NCX) potencírozása révén oly módon, hogy az befolyásolja a citoszolos Ca 2+ -ot is. ÉK-ban és a nukleoplazmában (áttekintésre: Ledeen és Wu 2007). Kimutatták, hogy a GD1a, az ÉK másik fő gangliozidja a GM1 prekurzoraként funkcionál a membránhoz kötött neuraminidázzal (N’ase) reagálva, amely ÉNy-i gangliozidokkal (Wang et al. 2009). Ez az áttekintés megkísérli összefoglalni ezeket a megállapításokat, és figyelembe veszi ezeket a nukleáris alkotóelemek által biztosított citoprotektív mechanizmusok tágabb összefüggésében.

Gangliozidok és a sejt neuraminidáza

Az NE ezen vizsgálatai során feltárt másik fő gangliozid a GD1a volt, a GM1 neuraminidáz-reaktív prekurzora, amely valójában nagyobb volt, mint az utóbbi. A GD1a egyik fő funkciója a GM1 tartalék prekurzorának mutatkozott, ezt az átalakulást az N’ase (szialidáz) enzim katalizálta, amely szintén kimutatták, hogy ÉK-ban (Saito) et al. 1996). További tanulmányok bizonyították az N’áz jelenlétét az ÉK mindkét membránjában, a Neu3 izoform a burkolat belső és Neu1 külső burkolatában jelenik meg (Wang et al. 2009) (1. ábra). Ezeket a megállapításokat megkönnyítette a két membrán elválasztása Gilchrist és Pierce (1993) eljárása szerint, amely kezünkben a belső és a külső membrán meglehetősen tiszta készítményeit adta. A Neu3 az az izoform, amelyről korábban kimutatták, hogy a plazmamembránban fordul elő, és specifikusan reagál a gangliozidokkal (Miyagi et al. 1999; Monti et al. 2000), míg a Neu1 eredetileg lizoszomális eredetű volt, és később kimutatták, hogy a plazmamembránban is előfordul (Liang et al. 2006); aktivitást mutatott mind a gangliozidokkal, mind a glikoproteinekkel szemben (Pshezhetsky és Ashmarina 2001). Vizsgálatunk kimutatta, hogy az N’ase mindkét helyen képes volt katalizálni a GD1a GM1-vé (Wang et al. 2009). Ezek az eredmények a 2. ábrán bemutatott Neu1 és Neu3 orientációját sugallják.

A neuraminidáz izoformák azonosítása a mag burkolatában. a) Western-blot elemzés. Az i. Panel, a differenciálódott (Diff.) És a differenciálatlan (Diff.) NG108-15 sejtek külső és belső NE membránjait immunoblot vizsgálatnak vetettük alá anti-egér Neu3 Ab alkalmazásával. A Neu3 szabvány látható. A Neu3 festés szignifikánsan nehezebb volt a belső-, mint a külső membránhoz képest, és a differenciálódott és a differenciálatlan magokhoz képest. A (ii) panel, a differenciálatlan SH ‐ SY5Y sejtek NE membránjait a fentieknek megfelelően immunoblot elemzésnek vetettük alá anti-humán Neu3 és Neu1 alkalmazásával. A Neu3 és a Neu1 szabványok láthatók. Az eredmények azt mutatják, hogy a Neu3 az SH-SY5Y sejtek NE belső NE- és külső membránjában expresszálódik. b) Immunocitokémiai elemzés. A differenciálódott NG108-15 sejtekből izolált magokat (i panel) és a differenciálatlan SH-SY5Y sejteket (ii panel), amelyeket citráttal kezeltünk vagy nem kezeltünk az ONM eltávolítása érdekében, anti-humán Neu3 és Neu1 Abs-vel festettük, majd megfelelő 2. Abs kapcsolódik a FITC-hez. A Western blot analízissel összhangban ezek az eredmények azt mutatják, hogy a Neu3 az INM-ben és a Neu1 az ONM-ben. Újranyomtatták Wang engedélyével et al. (2009) a J. Neurochem.

A GM1, a neuraminidáz (Neu1, Neu3) és a Na +/Ca 2+ cserélő (NCX) javasolt topológiája a mag burkolatában (NE, a) és a plazmamembránban (PM, b). Mindkét esetben az 5 és 6 transzmembrán egységek közötti nagy hurok az alacsony Ca 2+ oldalon helyezkedik el, azaz a PM esetében a citoplazma és NE esetében a nukleoplazma. Ez összhangban áll a GM1 és az NCX bizonyított elhelyezkedésével az NE belső membránjában (INM) és a nagy NCX hurok előfordulásával a GM1 oligoszacharid lánc közelében. Javasoltuk, hogy a GM1 és az NCX nagy affinitású asszociációja a N‐Acetil-neuraminsav a GM1-ben, kölcsönhatásban áll az NCX hurok alternatív toldási régiójával (ASR), amelynek egyes izoformái pozitív töltésű aminosavakban dúsulnak. Ilyen asszociáció a PM esetében nem lehetséges, mivel az NCX hurok és a GM1 oligoszacharid a membrán ellentétes oldalán fordul elő. A Neu1 a külső magmembránban (ONM), a Neu3 pedig az INM-ben található. A PM köztudottan tartalmaz Neu3-at, de csak alkalmanként Neu1-et. Részben reprodukálva Ledeen és Wu (2007) felhasználásával J. Neurochem.

Az endonukleáris domének tekintetében a heterokromatin az egér hámsejtjeiben bizonyította a GM1 jelenlétét, amelyet mind a CtxB, mind az anti-GM1 Ab (Parkinson et al. 1989). A β-amiloid peptidnek kitett patkány agykérgi neuronok immunocitokémiai vizsgálata alapján a GD3 heterokromatinban is előfordult (Copani et al. 2002). Ez a viszonylag feltáratlan terület nyilvánvalóan szisztematikus vizsgálatra szorul.

GM1 kölcsönhatás Na +/Ca 2+ cserélővel

Az észak-északi GM1 funkcióval kapcsolatos fontos nyomra derült fény azzal a felfedezéssel, hogy ez a gangliozid nagyon szoros kapcsolatban fordul elő egy Na +/Ca 2+ cserélővel (NCX) (Xie et al. 2002). Ezt a nagy affinitású asszociációt az NE-kivonat anti-NCX Ab immunprecipitációjával, majd immunoblot-analízissel mutattuk ki, amely azt mutatta, hogy a GM1 a nátrium-dodecil-szulfát – poliakrilamid gél elektroforézis során kapcsolatban marad az NCX-szel. Ez az eljárás általában csak a ritka kivételektől elkülöníti a lipideket a fehérjéktől, például GM1 kötődése az ideg növekedési faktorához (Mutoh et al. 1995). Az NE NCX izoformái nyilvánvalóan abban különböztek a plazmamembránban lévőktől, hogy az utóbbiak egyike sem maradt kapcsolatban a GM1-gyel. Az eredmények szerint a GM1 lazábban kapcsolódhat egy vagy több NCX izoformához az adott lokuszon. Az NCX splice-alapú izoformáinak létezését leírták (Kofuji et al. 1994; Ő et al. 1998).

Az NCX-aktivitás GM1-gyel való asszociálódását 45 Ca 2+ felvételi kísérlet jelezte izolált sejtmagokkal, izotóptranszfer nukleoplazmából NE-be (Xie et al. 2002). Ezt a differenciált NG108-15 sejtek (magas NE GM1) sejtjeiben tapasztalható robusztus NCX aktivitás összehasonlításával mutatták ki a differenciálatlan sejtek sejtjeiben tapasztalható lassú aktivitással (kevés vagy egyáltalán nem voltak NE GM1 sejtek). 45 A nukleoplazmától az NE lumenig terjedő Ca 2+ transzfer az NCX/GM1 komplex elhelyezkedését javasolta az NE belső membránjában, és ezt az elválasztott membránok immunblott-analízisével igazolták. Mivel az NCX által történő Ca 2+ transzfert Na + gradiens vezérli, a fentiekben a Na + ÉK-ban megemelkedett in vitro kísérletek a magok Na + -tartalmú közegben történő előzetes inkubálásával, megfelelő ionoforokkal. Az ilyen transzfer természetes módon bekövetkezett egy Na +/K + -ATPáz részéről, amelyről kiderül, hogy az NE belső membránjában fordul elő, amely folyamat magas intraluminális Na + koncentrációt eredményezett (Garner 2002).

A plazmamembránban lévő Na +/Ca 2+ -cserélő három Na + ellentranszportját közvetíti egy Ca 2+ esetén, miközben elősegíti a citoszolos Ca 2+ felfelé történő extrudálását. Ennek az „előre” váltási módnak egyik topológiai követelménye, hogy az 5. és 6. transzmembrán szegmens közötti nagy polipeptid hurok a membrán alacsony Ca 2+ (citoszolos) oldalán található (Philipson és Nicoll 2000). Feltételezve, hogy az NE NCX-re ugyanaz a követelmény, ez a peptidhurok kiterjed a nukleoplazmába, hogy megkönnyítse a nukleoplazmatikus Ca 2+ felfelé történő transzferét a belső magmembránon át az NE lumenen belüli koncentrált Ca 2+ -készletbe. Ez jelentős különbséget eredményezne a GM1 orientációban, ahol a GM1 oligoszacharid lánc és az NCX hurok a plazma membrán ellentétes oldalán, de a belső NE membrán ugyanazon oldalán található (2. ábra). Ez a topológia lehetővé tenné, hogy a GM1 sziálsav negatív töltése kölcsönhatásba lépjen pozitív töltésű aminosavakkal, amelyekről kimutatták, hogy ezen NCX hurok néhány izoformájának alternatívan splicelt régiójában fordulnak elő (He et al. 1998). Ilyen töltés-töltés kölcsönhatás, amelyet kísérletileg javasolnak észak-északi részen bekövetkezni (Xie et al. 2004a) nem lehetséges a plazmamembránban.

A nukleáris NCX/GM1 közvetíti a Ca 2+ transzfert a citoszolból az endoplazmatikus retikulumba

Az intracelluláris rekeszekbe történő Ca 2+ belépés összehasonlítása, amely a NE-ben a GM1-től és az NCX-től függ. Az NE/ER Ca 2+ eltávolítását thapsigarginnal Ca 2+ hozzáadása követte. Az NG108-15 sejtek (GM1-t expresszáló) szignifikánsan több Ca 2+ bejutást mutattak az NE/ER-be, mint az NG-CR72 sejtek (GM1 hiányos) (a-i vs. a-ii). A C6 sejtek (amelyek NC-t expresszálnak NE-ben) robusztus Ca 2+ bejutást tapasztaltak az NE/ER-be (b-i), szemben a Jurkat-sejtekkel (nincs NCX-expresszió), amelyek nem mutattak Ca 2+ -ot NE/ER-be (c-i). A Ca 2+ bejutása a nukleoplazmába hasonló volt a C6 (b-ii) és a Jurkat (c-ii) sejteknél, mint a Ca 2+ citoszolba való belépése esetén is (b-iii, c-iii); A KB ‐ R7943 (KB, NCX gátló) szerény hatást fejtett ki a C6 nukleoplazmájára és citoszoljára, de a Jurkat sejtekre nem volt hatással. A KB-nak nagy hatása volt az NG108-15 (a-i) NE/ER-be történő Ca 2+ bejutására, az NG-CR72 sejtekkel (b-i) pedig kicsi volt a hatása. Sorozatképeket kaptunk ER-cameleont expresszáló NG108-15 sejtekkel, miután a thapsigargin 50 másodpercen keresztül alkalmazta a [Ca 2+] ne/er (d) kimerülését. A CaCl2/KCl hozzáadása 550 mp-nél a [Ca 2+] ne/er emelkedését okozta, amely a perinukleáris (NE) régióból származik (nyílhegyek 592,8 s képnél * -nel), majd az egész NE/ER-re kiterjedtek. Ezt fokozatos Tg-indukált kimerülés követte. Wu-tól adaptálva et al. (2009) engedélyével Proc. Natl Acad. Sci. USA.

A nukleáris NCX/GM1 biztosítja a citovédelmet

A gangliozidokat ma szinte minden gerinces és néhány gerinctelen sejt mindenütt elismert komponenseként ismerik el, számos szabályozó és jelző funkcióval a membránban és a sejtben (Yu és Saito 1989; Ledeen et al. 1998; Hakomori 2001). A nukleáris NCX/GM1 prevalenciáját illetően a mai napig vizsgált sejttípusok többsége rendelkezik ezzel a komplextel, még olyan sejtekben is (pl. C6), amelyek nem tartalmaznak NCX-t a plazmamembránban (Xie et al. 2004a, b). A fő kivétel, amelyet eddig megfigyeltünk, az immunrendszer elsődleges vagy származékos sejtjei, beleértve Jurkatot és az emberi T-sejtek egy alcsoportját (Xie et al. 2004a). Az a tény, hogy egyes sejtek nem rendelkeznek ezzel a citoprotektív mechanizmussal, arra utal, hogy a szervezet érdekében megfelelő időben eliminálódhatnak. Így úgy tűnik, hogy a nukleáris NCX/GM1 jelenléte és hiánya kritikus hatást gyakorol a sejtek viselkedésére és a túlélésre.

Kilátások a jövőre

Elismerés

Ezt a munkát az Országos Egészségügyi Intézet támogatta: 2 RO1 NS033912.