A Bifidobacterium choerinum vagy az Escherichia coli Nissle 1917 interferenciája a Salmonella Typhimuriummal a gnotobiotikus malacokban korrelál a vér és a belek citokinmintázatával

Egy Splichalova

* Immunológiai és Gnotobiológiai Tanszék, Mikrobiológiai Intézet, Cseh Tudományos Akadémia, Novy Hradek, Csehország

Én Trebichavsky

* Immunológiai és Gnotobiológiai Tanszék, Mikrobiológiai Intézet, Cseh Tudományos Akadémia, Novy Hradek, Csehország

V Rada

† Mikrobiológiai, Táplálkozási és Dietetikai Tanszék, Agrobiológiai Kar, Élelmiszer- és természeti erőforrások, Cseh Élettudományi Egyetem, Prága, Prága 6 - Suchdol, Csehország

E Vlkova

† Mikrobiológiai, Táplálkozási és Dietetikai Tanszék, Agrobiológiai Kar, Élelmiszer- és természeti erőforrások, Cseh Élettudományi Egyetem, Prága, Prága 6 - Suchdol, Csehország

U Sonnenborn

‡ Biológiai Kutatási Osztály, Ardeypharm GmbH, Herdecke, Németország

Én Splichal

* Immunológiai és Gnotobiológiai Tanszék, Mikrobiológiai Intézet, Cseh Tudományos Akadémia, Novy Hradek, Csehország

Absztrakt

Bevezetés

Az ember és az állatok gyomor-bél traktusának rendkívül változatos mikrobiája egyedülálló ökoszisztémát képez, amely rendkívül robusztus és képes versenyezni a tranziens és patogén mikrobákkal [1,2]. Ezt a tulajdonságot korábban gyarmatosítási rezisztenciának nevezték el [3]. A bél mikrobiota olyan kölcsönös baktériumtörzseket is tartalmaz, amelyek egészségügyi hasznot jelentenek a gazdaszervezetnek, és probiotikumokként ismertek [4,5]. Hatásuk mechanizmusait nem értik jól. Úgy gondolják, hogy az immunmoduláció, a kórokozók kompetitív kizárása és a különböző gátló vegyületek (pl. Szerves savak, mikrocinek) termelése fontos szerepet játszik. Az antibiotikumoknak az állattenyésztésben való betiltása ösztönözte a probiotikus hatások és a házi állatok bélmikrobiotájába vetett versenyinterferencia tanulmányozását.

Az emlős újszülöttek gyomor-bél traktusát az anya hüvelyi és bél mikroflórája gyarmatosítja a szülés során, és az élet első éveiben a sterilitástól a sűrű mikrobiális kolonizációig halad [6]. A bifidobaktériumok az emberi és állati bél mikrobiota rendszeres összetevői [7–9]. Az újszülött belében az első telepesek közé tartoznak, és a szoptató csecsemők mikrobiótájának akár 90% -át is elérik [10]. A császármetszéssel szült újszülöttek és a táplált tejpótlók a bél mikrobiotájának összetétele eltérõ, a bifidobaktériumok száma alacsonyabb [6]. A sertésbélben a bifidobaktériumok 10–100-szor alacsonyabb koncentrációban vannak jelen, mint az embereknél [7,11–13]. Számuk a sertések prebiotikumokat tartalmazó étrend-kiegészítővel történő etetése után nőtt [14].

A Bifidobacterium choerinum a sertés autochton bifidobaktérium-faja, amely jól alkalmazkodik az elválasztott malacok béléhez és potenciális probiotikus tulajdonságokkal rendelkezik [15].

Az Escherichia coli Nissle 1917 (EcN) az E. coli [16] probiotikus törzse, amelyet eredetileg Shigella-fertőzéssel szemben rezisztens emberi székletből izoláltak [17]. Hatékony a dysmicrobia és a csecsemő hasmenés [18] és az újszülött borjú hasmenése [19] megelőzésében és gyógyításában. Kimutatták azt is, hogy ez a törzs megvédi a sertéseket az enteropatogén baktériumokkal való fertőzéstől [20,21]. Az EcN két mikrocint állít elő, amelyek hatékonyak az enterobaktériumok ellen [22], és csökkenti a szalmonella enterocitákba való behatolását [23].

Az egyszerűsített, ellenőrzött és meghatározott mikrobiotájukkal a gnotobiotikus állatok megfelelő biológiai modellek a baktériumok és a gazda kölcsönhatásainak tanulmányozására [24]. Ezeket a tulajdonságokat használták ki a Salmonella-fertőzés vizsgálata során [25,26].

Ebben a munkában az autochton B. choerinum lehetséges probiotikus hatását hasonlítottuk össze a probiotikus E. coli Nissle 1917 hatásával. Gnotobiotikus sertéseket alkalmaztunk a bél mikroflóra és a tenyészkörnyezet egyénközi variációinak bármilyen hatásának elkerülésére [27]. A baktériumok eloszlása, transzlokációjuk, a későbbi virulens Salmonella Typhimurium fertőzéssel szembeni védőhatás, a kísérleti malacok klinikai állapota, valamint két gyulladásos citokin - kemokin, interleukin (IL) -8, gyulladásgátló citokin, tumor - szisztémás és lokális termelése értékelték a nekrózis faktor (TNF) -α és egy gyulladáscsökkentő citokint, az IL-10-et.

Anyagok és metódusok

Állatok

A miniatűr minnesotai származású kocákat intramuszkulárisan (i.m.) kezeltük 50 mg medroxi-progeszteron-acetáttal (Depo-Promone; Pfizer Manufacturing Belgium, Puurs, Belgium) a vemhesség 105. napján. A kolosztrumtól megfosztott csíramentes malacokat méheltávolítással állítottuk elő halotán altatásban a terhesség 112. napján. A malacokat pozitív nyomású, mikrobiológiailag kontrollált üvegszálas izolátorokban nevelte, és jóllakásig táplálta autoklávban sterilizált tej-étrenddel ásványi anyagokkal és vitaminokkal [28]. A malacok sterilitását heti két alkalommal és az eutanázia napján ellenőriztük rektális tamponok aerob és anaerob tenyésztésével és festési módszerekkel [29]. Az állatokkal végzett összes eljárást a Mikrobiológiai Intézet Állatvédelmi és Felhasználási Bizottsága hagyta jóvá.

Baktériumtörzsek

A PR4 egy 8 hetes (LW × L) × Pn fajtájú sertés székletflórájából izolált B. choerinum kommenzális törzse, módosított triptikáz – fiton – év (agar) agar alkalmazásával [30]. Az izolátumot véletlenszerűen amplifikált polimorf DNS – polimeráz láncreakció (RAPD-PCR) eljárással azonosítottuk Sakata és mtsai. [31] és összehasonlították a német Biológiai Anyagforrás Központ sertés bifidobaktérium törzseivel.

Az EcN az E. coli Nissle 1917 (EcN, O6 szerovar: K5: H1). Ezt a szérumérzékeny, nem virulens E. coli törzset alkalmazzák emberi és állatorvosi probiotikumként [16].

Az LT2 a S. enterica szerovar Typhimurium szérumrezisztens LT2 törzse, amely letális szepszist okoz csíra nélküli malacokban [26].

Bakteriális szuszpenziók

Minden kísérlethez friss baktériumtenyészeteket készítettünk előállításukkal, éjszakán át 37 ° C-on történő tenyésztéssel. A PR4-et anaerob kamrában tenyésztettük 10 ml TPY-táptalajban (Scharlau, Barcelona, Spanyolország). A sejteket 4000 ° C-on végzett centrifugálással gyűjtöttük össze g 10 percig. Az üledéket kétszer 0,05 M foszfátpufferrel (pH 6,5) mossuk, amely 500 mg/l ciszteint (PBC) tartalmaz. Az EcN-t és az LT2-t hús-pepton agar lejtőkön tenyésztettük (véragar bázis; Oxoid, Basingstoke, Egyesült Királyság). A baktériumokat 5x108 telepképző egység (CFU)/ml sűrűségig újraszuszpendáltuk, és tejjel etetett disznóknak adtuk. A 600 nm-en spektrofotometriával becsült CFU számát tenyésztési módszerrel igazoltuk.

A csíra nélküli sertések baktériumokkal való kolonizálása

Az egy hetes csíramentes sertések orálisan társultak/fertõzõdtek 1 × 108 CFU baktériummal 5 ml tejetáplálékban. A di-asszociált sertéseket 24 órával a PR4-gyel vagy az EcN-vel való asszociáció után fertőztük S. Typhimuriummal. Valamennyi kísérleti sertést 24 órával az utolsó baktériumkezelés után halotán érzéstelenítéssel végzett exsanguációval eutanizáltuk. A csíra mentes kontrollcsoportot ugyanabban az életkorban eutanizálták.

Hat kísérleti csoportot vizsgáltak 1 hetes gnotobiotikus sertésből (mindegyik csoportban öt sertés), miniatűr kocák öt méheltávolításából: (i) csíramentes malacok, (ii) LT2-hez mono-társított sertések (S LT2 törzs). enterica szerovar Typhimurium), (iii) PR4-hez mono-társult sertések (B. choerinum PR4-törzs), (iv) EcN-hez egyidejűleg társított sertések (E. coli Nissle 1917 törzs), (v) PR4 + -hoz társított sertések LT2 és (vi) LT2 sertések, amelyek társulnak az EcN + LT2-vel.

A baktériumok eloszlása

A kísérleti állatokat eutanizáltuk, és a perifériás vérből, a bélmosásból és a homogenizált szövetekből származó mintákat (lépből, mesenterialis nyirokcsomókból és májból) sorozatosan hígítottuk PBC-ben. Megfelelő hígításokat vittünk át steril, 60 mm-es Petri-csészékbe, amelyeket azonnal megtöltöttünk 100 mg/l mupirocinnal és 1 ml/l tömény jégecettel kiegészített bifidobaktériumok táptalajával (TPY agar; Scharlau) [30]. A bifidobaktériumokat anaerob edényben (Anaerobic System; Oxoid) inkubáltuk CO2/H2 (90/10%) atmoszférában 37 ° C-on 3 napig. E. coli és Salmonella sp. tenyésztettük és 90 mm-es Petri-csészéken számláltuk MacConkey agarral (Merck, Darmstadt, Németország), illetve Brilliant Green agarral (Oxoid). Az oltott lemezeket aerob módon inkubáltuk 37 ° C-on 1 napig.

Az ileum lemosását úgy kaptuk, hogy az ileocaecalis nyílástól kezdve levágtuk az ileum disztális részének 40 cm-es szegmensét, és 2 ml PBC-vel öblítettük. A vastagbél átmosását úgy kaptuk, hogy az egész vastagbélt Petri-csészébe helyeztük, ollóval rövid darabokra vágtuk, és hozzáadtunk 4 ml PBC-t. A minták tízszeres soros hígítását tenyésztettük a fentiek szerint, a célbaktériumtól függően. Egy proteázinhibitor-koktélt (Roche, Mannheim, Németország) adtunk a maradék bélmosáshoz a citokinek későbbi kimutatásához a gyártó ajánlásai szerint.

Citokin kimutatás enzimhez kapcsolt immunszorbens vizsgálattal (ELISA)

Az IL-8, IL-10 és TNF-α-t citrált vérplazmában becsültük meg (1200 g, 10 perc, 8 ° C) vagy ileummosás (1500 ° C) g, 20 perc, 8 ° C), a fentiek szerint elkészítve, majd 0,2 µm nitrocellulóz szűrőn (Sartorius, Göttingen, Németország) átszűrjük. Az összes mintát hozzáadott proteáz inhibitor koktéllal (Roche) azonnal lefagyasztottuk, és felhasználásukig -70 ° C-on tartottuk. A 15 pg/ml érzékenységű szendvics IL-8 ELISA-t máshol írják le [32]. Az IL-10-et és a TNF-α-t azonos sűrűséggel, 15 pg/ml-rel detektáltuk sertés IL-10 CytoSet ™ és sertés TNF-α CytoSet ™ (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) felhasználásával, a gyártó utasításainak megfelelően. A vizsgálatokat 96 üreges MaxiSorp ™ ELISA lemezeken (Nunc, Roskilde, Dánia) végeztük, és 450 és 620 nm-en mértük Infinite M200 mikrolemez-olvasóval (Tecan, Grödig, Ausztria). Az eredményeket a Magellan 6.3 verziójú szoftver (Tecan) segítségével értékeltük.

Statisztikai analízis

A CFU baktériumok Log10 értékeit párosítatlan Student-féle t-teszttel hasonlítottuk össze. Az S. Typhimuriummal (LT2) fertőzött sertések csak kontrollcsoportként szolgáltak a plazma és a belek citokinszintjéhez di-asszociált csoportokban (PR4 + LT2 és EcN + LT2). A csoportok közötti különbségeket varianciaanalízissel (anova) hasonlítottuk össze Dunnett post-hoc tesztjével. A különbségeket az InStat 3.10 verziójával (GraphPad Software, San Diego, Kalifornia, USA) értékeltük, és jelentősnek tekintettük, ha P 1a. Ábra). A mono-asszociált (EcN) és a di-asszociált sertések (EcN + LT2) bélében az EcN-számok közötti különbségek nem voltak szignifikánsak (1b. Ábra). Mind az EcN, mind a PR4 csökkentette a szalmonella számát az ileumban (P 2. ábra). Ezzel szemben sem a PR4, sem az EcN baktériumokat nem találták a vérben 24 órával az orális beadás után. Az EcN megzavarta az S. Typhimurium mesenterialis nyirokcsomókba történő transzlokációját is (P 2. ábra): Az S. Typhimurium nem volt jelen az EcN-di-asszociált sertések vérében, májában és tüdejében. Ezzel szemben az összes PR4-di-asszociált sertés vérmérgezésben szenvedett.