A bilirubin csökkenti a zsigeri elhízást és az inzulinrezisztenciát a gyulladásos citokinek elnyomásával

Egyformán járult hozzá ehhez a munkához: Ryoko Takei, Tomoaki Inoue

elhízást

Szerepek Adatkezelés, Formális elemzés, Vizsgálat, Módszertan, Projekt adminisztráció, Validálás, Megjelenítés, Írás - eredeti vázlat, Írás - áttekintés és szerkesztés

Társulás Orvostudományi és Bioregulációs Tudományok Tanszék, Orvostudományi Doktori Iskola, Kyushu Egyetem, Fukuoka, Japán, Fukuoka város egészségfejlesztési támogató központja, Fukuoka, Japán

Egyformán járult hozzá ehhez a munkához: Ryoko Takei, Tomoaki Inoue

Szerepek Adatkezelés, Formális elemzés, Vizsgálat, Módszertan, Projekt adminisztráció, Szoftver, Validálás, Megjelenítés, Írás - eredeti vázlat, Írás - áttekintés és szerkesztés

Csatlakozás Orvostudományi és Bioregulációs Tudományok Tanszék, Orvostudományi Doktori Iskola, Kyushu Egyetem, Fukuoka, Japán

Szerepek felügyelete, érvényesítése

Csatlakozás Orvostudományi és Bioregulációs Tudományok Tanszék, Orvostudományi Doktori Iskola, Kyushu Egyetem, Fukuoka, Japán

Szerepek Adatkúra, módszertan, validálás

Csatlakozás Orvostudományi és Bioregulációs Tudományok Tanszék, Orvostudományi Doktori Iskola, Kyushu Egyetem, Fukuoka, Japán

Szerepek Adatkezelés, Projekt adminisztráció, Validálás

Csatlakozás Orvostudományi és Bioregulációs Tudományok Tanszék, Orvostudományi Doktori Iskola, Kyushu Egyetem, Fukuoka, Japán

Szerepek Adatmegőrzés, validálás

Csatlakozás Orvostudományi és Bioregulációs Tudományok Tanszék, Orvostudományi Doktori Iskola, Kyushu Egyetem, Fukuoka, Japán

Szerepek konceptualizálás, finanszírozás megszerzése, projekt adminisztráció, erőforrások, felügyelet, validálás, vizualizáció, írás - áttekintés és szerkesztés

Fukuoka város egészségfejlesztési támogató központja, Fukuoka, Japán

Szerepek konceptualizálás, adatkezelés, finanszírozás megszerzése, projekt adminisztráció, erőforrások, felügyelet, validálás

Társulás Orvostudományi és Bioregulációs Tudományok Tanszék, Orvostudományi Doktori Iskola, Kyushu Egyetem, Fukuoka, Japán, Molekuláris és Sejtanyagcsere Tanszék, Orvostudományi és Fogtudományi Doktori Iskola, Tokiói Orvosi és Fogorvosi Egyetem, Tokió, Japán

  • Ryoko Takei,
  • Tomoaki Inoue,
  • Noriyuki Sonoda,
  • Motoyuki Kohjima,
  • Misato Okamoto,
  • Ryuichi Sakamoto,
  • Toyoshi Inoguchi,
  • Yoshihiro Ogawa

Ábrák

Absztrakt

Célkitűzés

Bár korábbi vizsgálatok negatív összefüggést jelentettek a szérum bilirubin koncentráció és a diabetes mellitus (DM) kialakulása között, a bilirubin és az inzulinrezisztencia közötti kapcsolatot még nem értékelték alaposan. Ezt a vizsgálatot a bilirubin, a testzsír-eloszlás és a zsírszövet-gyulladás közötti összefüggések meghatározására tervezték 2-es típusú DM-ben szenvedő betegeknél és a bilirubin hatása elhízott állatmodellben.

Módszer

A testzsír-eloszlást hasi kettős bioelektromos impedancia analizátorral mértük 2-es típusú DM-ben szenvedő betegeknél. Megmértük a glikémiás kontrollt, a lipidprofilt, a szérum bilirubin koncentrációját és egyéb klinikai jellemzőket, és meghatároztuk azok kapcsolatát a testzsír eloszlásával. Az állatkísérletben biliverdint (napi 20 mg/kg) adtak szájon át a magas zsírtartalmú étrend (HFD) által kiváltott elhízott (DIO) egereknek 2 hétig, majd intraperitoneális inzulin tolerancia tesztet végeztek. Ezután az adipocita területét, az adipocytokin expresszióját és a makrofág polarizációt értékelték az epididymális zsírszövetekben.

Eredmények

A klinikai vizsgálatban az egyváltozós elemzés azt mutatta, hogy az alacsonyabb bilirubin-koncentráció szignifikánsan korrelált a magasabb testtömeg-indexdel, a derék kerületével, a trigliceriddel, a húgysavval, a kreatininnel, a zsigeri zsírterülettel és az alacsonyabb HDL-C-értékkel. Többváltozós elemzések során a bilirubin koncentrációja szignifikánsan korrelált a diasztolés vérnyomással, a kreatininnel és a zsigeri zsírterülettel. A bilirubin koncentráció és a szubkután zsírterület között azonban nem volt összefüggés. Az állatkísérlet során a biliverdinnel kezelt DIO egereknek kisebb volt az adipocitáik száma, mint a kezeletlen DIO egereknek, és a biliverdin javította a HFD által kiváltott inzulinrezisztenciát. A Biliverdin-kezelés megfordította az M1 makrofág markert kódoló Cd11c és a proinflammatorikus citokintumor nekrózis faktort α kódoló Tnfa magasabb génexpresszióját a DIO egerek zsírszöveteiben. Ezek az adatok arra utalnak, hogy a biliverdin beadása enyhíti az inzulinrezisztenciát azáltal, hogy enyhíti a gyulladást és az adipocytokin expressziójának diszregulációját a DIO egerek zsírszöveteiben.

Következtetések

A bilirubin a zsigeri elhízás és a zsírszövet-gyulladás enyhítésével védhet az inzulinrezisztencia ellen.

Idézet: Takei R, Inoue T, Sonoda N, Kohjima M, Okamoto M, Sakamoto R és mtsai. (2019) A bilirubin a gyulladásos citokinek elnyomásával csökkenti a zsigeri elhízást és az inzulinrezisztenciát. PLoS ONE 14 (10): e0223302. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0223302

Szerkesztő: Makoto Kanzaki, Tohoku Egyetem, Japán

Fogadott: 2019. június 25 .; Elfogadott: 2019. szeptember 18 .; Közzétett: 2019. október 2

Adatok elérhetősége: Minden lényeges adat a kéziratban és annak kiegészítő információs fájljaiban található.

Finanszírozás: Ezt a munkát részben a Speciális Koordinációs Alapok támogatták a tudomány és a technológia előmozdítása érdekében (SCF finanszírozási program „Innovatív Központ az Orvosi Redox Navigációhoz”). A finanszírozóknak nem volt szerepük a tanulmányok tervezésében, adatgyűjtésben és elemzésben, a közzétételre vonatkozó döntésben vagy a kézirat elkészítésében. Ehhez a tanulmányhoz további külső finanszírozás nem érkezett.

Versenyző érdeklődési körök: A szerzők kijelentették, hogy nincsenek versengő érdekek.

Bevezetés

Anyagok és metódusok

Klinikai vizsgálat

176 japán beteget (90 férfit és 86 nőt) vettünk fel 2-es típusú diabetes mellitusban, akiket 2017 júniusa és 2018 decembere között a Kyushu Egyetemi Kórház metabolikus osztályára vittek be. A diabetes mellitus diagnózisát az American Diabetes Association kritériumai alapján igazolták/Egészségügyi Világszervezet (ADA/WHO), vagy a cukorbetegség kórtörténetének megerősítésével. A klinikai vizsgálatot a Helsinki Nyilatkozatnak megfelelően hajtották végre, amelyet a Kyushu Egyetemi Kórház Klinikai Etikai Bizottsága hagyott jóvá (29–33. Sz.). Írásbeli tájékozott beleegyezést kaptak minden betegtől. Krónikus hepatitis, májcirrhosis vagy májrák terápiájában részesülő betegek, akiknek korábban májdaganata volt, és akiknek a szérum aszpartát-aminotranszferáz (AST) vagy alanin-aminotranszferáz (ALT) koncentrációja meghaladta a normál tartomány felső határának háromszorosát > 120 U/L), vagy akik szérum teljes bilirubin-koncentrációja> 3,0 mg/dL volt, kizárták.

Valamennyi beteg klinikai és laboratóriumi értékelésen esett át. A testtömeg-indexet (BMI) a testtömeg (kg) és a négyzetmagasság (m 2) osztva osztották ki. A derékbőséget (WC) a csípőcsík felső vége és a 12. borda alsó vége közötti középpontban, minden alany normál lejártának végén, antropometrikus szalaggal mértük. A zsigeri zsírterületet (VFA) és a szubkután zsírterületet (SFA) hasi kettős bioelektromos impedancia analizátorral (Dualscan HDS-2000; Omron Healthcare Co., Kiotó, Japán) mértük. Megmértük a plazma glükóz, HbA1c (Nemzeti Glikohemoglobin Szabványosítási Program), teljes koleszterin (TC), nagy sűrűségű lipoprotein-koleszterin (HDL-C), trigliceridek (TG), húgysav (UA), bilirubin és kreatinin éhomi koncentrációit. . A HbA1c szinteket (%) a Klinikai Kémiai és Laboratóriumi Orvostudományi Nemzetközi Szövetségre konvertáltuk mmol/mol egységekké a HbA1c NGSP konverterével (http://www.ngsp.org/convert1.asp).

Állatkísérlet

Állatok és kísérleti protokoll.

Öt hetes hím C57Bl/6J egereket vásároltunk a Clea Japan Inc.-től (Tokió, Japán). Az egereket telep-ketrecekben helyezték el 12 órás fény/12 óra sötét ciklus alatt, szabad hozzáféréssel a csapvízhez és a chow-hoz (Clea Japan Inc.). 8 hetes korukban 8 hétig vagy kontroll étrendet (CD; 74% szénhidrát, 14% fehérje és 12% zsír) vagy HFD-t (20% szénhidrát, 18% fehérje és 62% zsír) kezdtek el fogyasztani. 16 hetes korban a HFD-vel (n = 16) vagy CD-vel (n = 16) táplált egerek felét véletlenszerűen választották ki, hogy biliverdinnel (20 mg/kg) kiegészített porított étrendre (Clea Japan Inc.) váltsanak. (Frontier Scientific, Logan, UT, USA) 2 héten keresztül, míg a megmaradt egerek egy kontroll, porított étrendet fogyasztottak, amely nem tartalmazott biliverdint, ugyanarra az időtartamra (S1 ábra), a korábban leírtak szerint [15]. Valamennyi protokollt felülvizsgálták és jóváhagyták a Kyushu Egyetem Orvostudományi Doktori Iskola Állatkísérleti Etikai Bizottsága.

A vércukorszint és az intraperitoneális inzulin tolerancia mérése.

Vérmintákat nyertünk az egerek farokvénájából. A plazma glükóz- és inzulin-koncentrációt glükóz-oxidáz módszerrel és enzimmel kapcsolt immunszorbens vizsgálattal (ELISA; Morinaga Institute of Biological Science, Yokohama, Japán) határoztuk meg. Az adiponektin és a leptin plazmakoncentrációit szintén ELISA módszerrel határoztuk meg (Wako, Osaka, Japán). Az inzulinrezisztencia mértékét inzulin tolerancia teszt (ITT) segítségével értékeltük. Röviden: az egereknek 2 U/kg humán bioszintetikus inzulint (Novo Nordisk, NJ, USA) injektáltunk, majd a vérmintákat 0, 15, 30, 60, 90 és 120 percen belül összegyűjtöttük, és megmértük a glükózkoncentrációjukat. fent leírt. Az inzulinrezisztencia (HOMA-IR) homeosztázis-modelljének értékelését a korábban leírtak szerint határoztuk meg [16, 17].

A fehér zsírszövet szövettani elemzése (WAT).

A WAT-ot az intraabdominális perigonadalis zsírpárnáról gyűjtötték össze, amelyről korábban metabolikusan szignifikánsnak bizonyult, és ahol az elhízás során gyulladás alakul ki, és megmérte [18]. Kétoldalas perigonadal zsírpárnákat boncoltunk és lemértünk, és a zsírpárna tömegét a testtömeg százalékában számoltuk. Az adipocita méretének becsléséhez [19] formalinnal rögzített, paraffinba ágyazott WAT szakaszokat festettünk hematoxilinnel és eozinnal, és egérenként 100 adipocitát kvantitatívan értékeltünk mikroszkóppal.

RNS extrakció és kvantitatív RT-PCR.

A teljes RNS-t fagyasztott epididymális zsírmintákból extraháltuk RNeasy Adipose Tissue Mini Kit (Qiagen, Chatsworth, CA, USA) segítségével, a gyártó utasításainak megfelelően. A kivont RNS-t (1 μg) reverz transzkripcióval egyszálú cDNS-be írtuk le QuantiTect reverz transzkripciós készlet alkalmazásával (Qiagen, Valencia, CA, USA). A fajlagos mRNS expressziós szinteket kvantitatív RT-PCR-rel mértük iTaq SYBR Green keverék (Bio-Rad) és Bio-Rad Chromo 4/Opticon ciklus segítségével. Az egyes megcélzott cDNS-ekre PCR-reakciókat hajtottunk végre az S1 – S3 táblázatokban bemutatott körülmények felhasználásával. Az amplifikációk linearitását a ciklusszám függvényében előzetes kísérletekben értékeltük. Az egyes gének mRNS-expresszióját normalizáltuk a referencia gén β-aktin expressziójához.

Statisztikai analízis

Az összes statisztikai elemzést a JMP statisztikai szoftver 13-as verziójával (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA) végeztük. A klinikai vizsgálat során a folyamatos változókat Spearman rangkorrelációjával és a kategorikus változókat elemezték a Mann – Whitney U-teszt segítségével a szérum bilirubin koncentráció, a testzsír eloszlás és az egyes paraméterek közötti kapcsolat egyváltozós elemzéséhez. Többváltozós lineáris regressziós elemzéseket végeztünk a potenciális zavarók kontrollálására. A nemet dummy változónak kódolták. A folyamatos adatokat mediánként és interkvartilis tartományokként (IQR), a kategorikus változásokat abszolút számokként (%) foglaljuk össze. Az állatkísérlet során az összes adatot átlag ± SEM értékben fejezzük ki. A statisztikai elemzést a Student-féle t-teszt vagy egyirányú varianciaanalízis (ANOVA) alkalmazásával, majd Fisher által védett legkevésbé szignifikáns különbségteszt alkalmazásával végeztük. P 1. táblázat: A betegcsoport demográfiai és klinikai jellemzői (N = 176).

A szérum bilirubin koncentráció és az egyéb változók közötti összefüggéseket a 2. táblázat mutatja be. A HDL-C pozitív kapcsolatban állt a szérum bilirubin koncentrációval, míg a BMI, WC, TG, UA, Cre és VFA fordítva társult a szérum bilirubin koncentrációval. A szérum bilirubin koncentrációja a potenciális zavaró tényezők kiigazítása után is fordítottan összefügg a VFA-val (2. táblázat). A testzsír-eloszlás és az egyéb változók közötti összefüggéseket az S4 táblázat mutatja. A korrekció után a VFA korrelált az életkorral, a nemmel, a WC-vel, a HbA1c-vel, a HDL-C-vel, a bilirubinnal és a Cre-vel. A szérum bilirubin koncentráció és az SFA között azonban nem volt összefüggés (2. és S4. Táblázat).

Állatkísérlet

Testtömeg, éhgyomri glükózkoncentráció és epididymális zsírtömeg.

A klinikai vizsgálatban azonosított összefüggések alapjául szolgáló lehetséges mechanizmusok feltárásához állatkísérletet végeztünk annak megállapítására, hogy a bilirubin csökkentette-e a zsírszövet tömegét és javította-e az elhízás okozta inzulinrezisztenciát. Amint azt az S1 ábra mutatja, szignifikáns különbség volt a testtömegben a 8-16 hetes CD-vel táplált és HFD-vel táplált egerek között. 16 hetes korban a vércukorszint szignifikánsan magasabb volt a HFD-vel tápláltaknál, mint a CD-vel táplált egereknél (3. táblázat). Ettől az időponttól kezdve biliverdint (napi 20 mg/kg) adtak szájon át a HFD-vel táplált egerek felének 2 hétig. 18 hetes korban, miután két hétig biliverdinnel vagy anélkül kiegészített kontroll púderes táplálékkal etették (S1 ábra), nem volt különbség az éhomi és a táplált vércukorszint között a CD-vel táplált egerek, a HFD-vel táplált egerek és a biliverdinnel kezelt egerek között. HFD-vel táplált egerek (3. táblázat). Amint azt a 3. táblázat mutatja, a HFD-vel táplált egerek testtömege szignifikánsan magasabb volt, mint az életkornak megfelelő CD-vel táplált egerek 18 hetes korában, de a biliverdin-kezelés nem befolyásolta jelentősen. A zsírpárna tömege kezeletlen HFD-vel táplált egerekben nagyobb volt, mint az életkornak megfelelő CD-vel táplált egerekben 2 hét kezelés után (3. táblázat), de a CD-vel táplált egerek és a biliverdinnel kezelt HFD között nem volt különbség a zsírpárna tömegében etetett egerek.

A biliverdin kezelés hatása az inzulinrezisztenciára.

Ezután meghatároztuk a biliverdin kezelés hatását az inzulinrezisztenciára. A HOMA-IR jelentősen megnőtt a kezeletlen HFD-vel táplált egerekben, összehasonlítva az életkornak megfelelő CD-vel táplált egerekkel 2 hét kezelés után (3. táblázat), de a HOMA-IR-ben nem volt különbség a CD-vel táplált egerek és a biliverdinnel kezelt HFD között etetett egerek. Az ITT-k során, bár a kezeletlen HFD-vel táplált egerek vércukor-koncentrációja magasabb volt, mint a biliverdinnel kezelt HFD-vel táplált egereké, a 30 és 60 perces időpontokban nem volt szignifikáns különbség a CD-vel táplált és a biliverdinnel kezelt egerek között HFD-vel táplált egerek (1. ábra). Ezek az adatok arra utalnak, hogy a biliverdin kezelés enyhíti a HFD által kiváltott inzulinrezisztenciát.

2 hetes kezelés után egereken inzulin tolerancia tesztet hajtottak végre. A vércukor-koncentrációt a bazális vércukorszint százalékában fejezzük ki. Kontroll egerek (○), HFD egerek (●) és biliverdinnel (BVD) kezelt HFD egerek (▲). Az eredményeket átlag ± SEM-ben fejezzük ki (n = 8). * P 2. ábra: A biliverdin (BVD) hatása az adipocita méretére.

Reprezentatív fotomikrográfok (A), az átlagos zsírsejt-terület (B) és az adipocita-terület hisztogramja (C) származnak a haematoxilinnal és eozinnal festett zsírszöveti szakaszokból. Egérenként száz adipocitát használtunk a kvantitatív értékeléshez. Kontroll egerek (○), HFD egerek (●) és BVD-vel kezelt HFD egerek (▲). Az eredményeket átlag ± SEM-ben fejezzük ki (n = 3). Méretarány, 100 μm. Eredeti nagyítás, × 200. * P 3. ábra: A biliverdin (BVD) hatása a génexpresszióra.

A fehér zsírszövetben mértük a makrofág markerek (A), az adipocitokinek (B), az adipogenezis fő szabályozói (B) és a NAD (P) H oxidáz komponensek (C) expresszióját. Összesen RNS-t nyertünk ki a kontroll egerek (nyitott oszlopok), a magas zsírtartalmú étrenddel (HFD) táplált egerek (zárt oszlopok) és a biliverdinnel (BVD) kezelt HFD egerek (kikelt rudak) fehér zsírszövetéből. Az mRNS expresszióját valós idejű RT-PCR alkalmazásával mértük, és a p-aktin expressziójára normalizáltuk. Az eredményeket átlag ± SEM-ben fejezzük ki. (n = 8). * P 4. ábra: Az adiponektin és a leptin szérumkoncentrációi.

Kontroll egerek (nyitott rudak), magas zsírtartalmú étrend (HFD) táplált egerek (zárt oszlopok) és biliverdinnel (BVD) kezelt HFD egerek (kikelt rudak). Az eredményeket átlag ± SEM-ben fejezzük ki (n = 8). * P 2 (IQR, 22,1–28,9 kg/m 2) a felvett 2-es típusú cukorbetegségben szenvedő betegeknél, bár állatkísérletekben HFD-indukálta elhízott egerek modelljét használtuk. Ezért egy jövőbeni klinikai vizsgálat során elhízott betegcsoportot (BMI> 30 kg/m 2) is meg kell vizsgálnunk.

Összefoglalva, ez a tanulmány kimutatta, hogy a szérum bilirubin koncentrációja fordított összefüggésben van a VFA-val cukorbetegségben szenvedő betegeknél, és hogy a biliverdin beadása enyhíti az inzulinrezisztenciát, potenciálisan a zsírszövet gyulladásának, az adipocita expanziójának és az adipocytokinek diszregulációjának javításával HFD-vel táplált egerekben . Eredményeink azt sugallják, hogy a bilirubin javíthatja a zsigeri elhízást és az inzulinrezisztenciát, ami azt jelzi, hogy a viscerális elhízásban és cukorbetegségben szenvedő betegek inzulinrezisztenciája elleni védelem új terápiáinak lehetséges célpontja.

Segítő információ

S1 táblázat. Feltételek és specifikus primerek a valós idejű PCR módszerekhez.

S2 táblázat. Feltételek és specifikus primerek a valós idejű PCR módszerekhez.

S3 táblázat. Feltételek és specifikus primerek a valós idejű PCR módszerekhez.

S4 táblázat. A testzsír-eloszlás és más változók közötti összefüggések.

S1 ábra. Kísérleti protokoll és testtömeg.

Tárgyterületek

A PLOS tárgyterületeivel kapcsolatos további információkért kattintson ide.

Szeretnénk visszajelzését. Van-e értelme ezeknek a tárgyköröknek a cikk számára? Kattintson a célra a helytelen Tárgy mellett, és tudassa velünk. Köszönöm a segítséget!

A tárgykör "Zsírszövet" alkalmazható erre a cikkre? igen nem

Köszönjük a visszajelzést.

A tárgykör "Bilirubin" alkalmazható erre a cikkre? igen nem

Köszönjük a visszajelzést.

A tárgykör "Inzulinrezisztencia" alkalmazható erre a cikkre? igen nem

Köszönjük a visszajelzést.

A tárgykör "Adipociták" alkalmazható erre a cikkre? igen nem

Köszönjük a visszajelzést.

A tárgykör "Diabetes mellitus" alkalmazható erre a cikkre? igen nem

Köszönjük a visszajelzést.

A tárgykör "Gyulladás" alkalmazható erre a cikkre? igen nem

Köszönjük a visszajelzést.

A tárgykör "Elhízottság" alkalmazható erre a cikkre? igen nem

Köszönjük a visszajelzést.

A tárgykör "Makrofágok" alkalmazható erre a cikkre? igen nem