A Celastrol által kiváltott fogyást a hipofágia és az UCP1-től független

Ebben a cikkben van egy javítás. Lásd:

Absztrakt

Bevezetés

A kínai Thunder God Tripterygium wilflordii szőlőben természetes módon előforduló pentaciklikus triterpenoid, a celastrol kivonatait a hagyományos kínai orvoslásban használják láz, hidegrázás, ízületi fájdalom és ödéma kezelésére. A legújabb bizonyítékok arra utalnak, hogy a celastrol új, elhízás elleni gyógyszer lehet, amely a fogyást közvetíti leptin-szenzibilizátorként (1).

Az elhízás és a cukorbetegség elleni krónikus celastrol-kezelés jótékony hatásait először Kim és munkatársai írták le. (2) és Weisberg et al. (3), akik alacsonyabb testtömeg (BW) és vércukorszintet figyeltek meg a leptin receptorhiányos Lep db egerekben 1, illetve 3 mg/kg testtömegű celastrollal történő kezelés után. Mivel az intraperitoneális (ip) celastrol (3 mg/ttkg) egyszeri akut adagolása javítja a glükóz toleranciát és az inzulinérzékenységet a Lep db egerekben a páros táplálású Lep db kontrollokkal összehasonlítva, ennek az a következménye, hogy a celastrol hatása a glükóz homeosztázisra független lehet a BW-re és a testösszetételre gyakorolt hatásoktól (3).

A celastrol hatásainak több mechanizmusát javasolták. 10–30-szor alacsonyabb dózisokat alkalmazva Liu és mtsai. (1) szerint a celastrol egy erős leptin-szenzibilizátor, amely gátolja a táplálékfelvételt (FI), csökkenti a testtömeget és javítja a glükóz toleranciát azáltal, hogy csökkenti a hipotalamusz endoplazmatikus retikulum (ER) stresszét az étrend okozta elhízott egerekben, de sovány egerekben és leptinben nem ( receptor) -hiányos Lep ob vagy Lep db egerek. A celastrol beadása csökkentette a máj steatosisát a megnövekedett Sirt1 expresszió révén egerekben (4), és ez károsodott adipocita differenciálódáshoz, de fokozott lipolízishez vezetett in vitro a 3T3 adipocita sejtekben (5). A Celastrol emellett javasolta a BW csökkentését az 1. hősokk-faktor (HSF1) –peroxiszóma-proliferátor-aktivált receptor γ-koaktivátor 1-α (PGC-1α) tengelyén keresztül és mitokondriális génprogramokon keresztül, amelyek megnövekedett izom- és barna zsírszövethez (BAT) vezetnek termogenezis és inguinalis fehér zsírszövet (iWAT) barnulás (6).

A Celastrol több megerősített molekuláris céllal rendelkezik. Gátolja az IκB kinázt (IKK) -a és az IKK-β-t azáltal, hogy a kináz aktivációs hurokban lévő cisztein (Cys) maradékhoz kötődik (7). A celastrol tovább gátolja a Hsp90 interakcióját a košaperonokkal, például a sejtosztódási 37. ciklussal (Cdc37) azáltal, hogy a Cdc37-ben lévő Cys-maradékokhoz (8,9) vagy a Hsp90 (10) dimer-határfelületéhez kötődik, ezáltal destabilizálja a Hsp90-Cdc37-IKK komplexet és gátolja az IKK jelátvitelt. Ezenkívül a celastrol közvetlenül gátolja a proteaszóma aktivitást (11), aktiválja a HSF1-et és kiváltja a hősokk-választ (12, 13), de a molekuláris mechanizmusok nem ismertek. A celastrol leptin-szenzibilizáló tulajdonságait az ER stressz csökkenésének tulajdonítják, de a közvetlen molekuláris alapok továbbra is megfoghatatlanok (1).

Célunk az volt, hogy megvizsgáljuk a celastrol által kiváltott súlycsökkenést a celastrol leptin-szenzibilizáló molekuláris mechanizmusának és termogén potenciáljának felmérésével. Külön hangsúlyt kaptak a protein tirozin-foszfatáz (PTP) 1B (PTP1B) szerepe, mint a leptin működésének negatív szabályozója, és az 1-es protein (UCP1) leválasztása, mint a barna/bézs zsír termogenezisének fő mozgatórugója. A PTP1B-re való összpontosításunkat a következő indoklás vezérelte: Egy nemrégiben triterpenoidokkal végzett kísérlet a celastrol több fehérje-foszfatáz, köztük a PTP1B gátló aktivitásáról számolt be (14); és a PTP1B az inzulin és leptin szignalizációjának ismert visszacsatoló szabályozója a Janus kináz 2 (JAK2) (15), az inzulinreceptor és az 1 inzulinreceptor szubsztrát (IRS1) defoszforilezésén keresztül (16). Az UCP1-re összpontosítottunk egy nemrégiben készített jelentésből, amely a celastrol súlycsökkentő hatásait az UCP1 transzkripciós aktiválásának tulajdonította, fokozott BAT-aktivációval, iWAT-barnával és megnövekedett energiafelhasználással (6).

Kutatási tervezés és módszerek

Állatok

A C57BL/6J egereket a Janvier Laboratories-tól (Saint-Berthevin Cedex, Franciaország) szereztük be. A C57BL/6J genetikai háttérrel rendelkező UCP1 knockout (KO), Lep ob és Lep db egereket eredetileg a The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) cégtől kapták (törzsnevek: B6.129-Ucp1tm1Kz/J; B6.Cg-Lepob/J/+; BKS.Cg-Dock7m +/+ Leprdb/J). A globális PTP1B KO egerek (B6.129S4-Ptpn1 tm1Bbk/Mmjax) Prof. Melanie Brinckmann (Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung GmbH, Braunschweig, Németország) ajándékai voltak. Az összes vizsgálatot hím egereken végezték, amelyeket 12 órás sötét-fény ciklusban tartottak, és szabadon hozzáférhettek az étrendhez és a vízhez. Az egereket normál rágcsáló-chow-val (# 1314; Altromin) vagy 58% magas zsírtartalmú étrenddel (HFD) etették (D12331; Research Diets). A Celastrolt (# 34157-83-0; BOC Science, Shirley, NY) tiszta DMSO-ban oldjuk, és PBS-sel hígítjuk 0,02 mg/ml végkoncentrációig 1% DMSO-ban injekcióhoz. Celastrolt (100 ug/ttkg) vagy PBS-t 1% DMSO-val, mivel a vivőanyagot hasonló térfogatban injektáltuk. A HFD-vel táplált étrend-indukált elhízás (DIO) egereket és a chow-táplált egereket i.p. UCP1 WT és KO egereket, Lep ob WT és KO egereket, Lep db WT és KO egereket, valamint PTP1B WT és KO egereket injektáltunk szubkután (s.c.). A Celastrol injekciókat 1-2 órával a sötét megjelenés előtt végezték. A post-portem analízishez az egereket 100 µg/kg testtömegű celastrollal vagy hordozóval injektáltuk 1-2 órával az elpusztítás előtt.

Az egereket kezdő BW-jük alapján kezelési csoportokba osztottuk, hogy biztosítsuk a kiinduló BW-k egyenlő eloszlását, lehetővé téve a longitudinális kezelések BW-re gyakorolt hatásainak jobb boncolását. Az in vivo kísérleteket a kutatók elvakítása nélkül hajtották végre. Valamennyi tanulmány a megfelelő mintanagyság biztosítása érdekében teljesítményelemzéseken alapult, és a bajor állam, Németország jóváhagyta.

Testösszetétel és indirekt kalorimetria

A zsír- és sovány tömegeket magmágneses rezonancia (NMR) technológiával (EchoMRI, Houston, TX) értékeltük. Az energiafelhasználást, a mozgásszervi aktivitást és a pontos FI méréseket kombinált közvetett kalorimetriás rendszer (TSE System, Bad Homburg, Németország) elemezte. Az egereket legalább 24 órán át akklimatizáljuk a kalorimetriás rendszerbe, az adatgyűjtés előtt 3 napig és 21 órán át 23 ° C-on. A celastrol bazális anyagcserére és a maximális légzésre gyakorolt hatásának értékeléséhez a ház hőmérsékletét 17 órán át 30 ° C-ra változtattuk. Ezt követően az egereknek 0,5 µg/g testtömeg-noradrenalin-infúziót (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) injektáltunk 0,9% NaCl-ban 2,5 óra múlva a fény beindulása után, és értékeltük az 1 órán belül megfigyelt maximális energiaköltség-növekedést. Meghatároztuk a 30 ° C-on tartott vivőanyaggal és celastrollal kezelt egerek bazális anyagcsere-sebességét az energiafogyasztási értékek átlagának 4,5-6,5 órás átlagával a fény bekövetkezése után, egy olyan időszakban, amikor az egerek a legkevesebb napi fizikai aktivitást mutatták. A maximális légzés mérésére egy egeret kizártak a kihagyott noradrenalin injekció miatt, és egy egeret kizártak a FI elemzésekből a kiömlés miatt.

Glükóz tolerancia tesztek

Az egereket 6 napig celastrollal (100 μg/testtömeg-kg) vagy hordozóval kezeltük, majd a 7. napon glükóztolerancia-teszten esett át. 6 órás böjt után glükózt (1,5 g/ttkg) injektáltunk ip-ben, és a farok vércukorszintjét kézi glükométerrel (FreeStyle Freedom Lite; Abbott Diabetes Care, Alameda, Kalifornia) mértük a glükózinjekció előtt (0 perc) és 15, 30, 60 és 120 perccel.

RNS izolálás és kvantitatív PCR elemzés

Az RNS-t a szövetekből egy kereskedelemben kapható készlet segítségével izoláltuk (Macherey-Nagel, Düren, Németország). A QuantiTect reverz transzkripciós készlet (Qiagen, Hilden, Németország) segítségével azonos mennyiségű RNS-t írtunk át a cDNS-be. A génexpressziót egyedi gyártású primerek (Sigma-Aldrich), TaqMan szondák (Thermo Fischer Scientific, Rockford, IL) és SYBR Green vagy TaqMan Master Mix (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) alkalmazásával elemeztük. A génexpressziót ΔΔCt módszerrel értékeltük, és Hprt-t használtunk háztartási génként. Az alkalmazott alapozó párokat és TaqMan szondákat a Kiegészítő táblázatok sorolják fel. A hipotalamusz gyulladásos markereinek Ct-értékei 32 és 36 között voltak.

Western blotting és denzitometrikus elemzések

Proteáz és foszfatáz inhibitor koktélt (Thermo Fisher Scientific) és 1 mmol/l fenil-metán-szulfonil-fluoridot (PMSF) tartalmazó radioimmunprecipitációs vizsgálati puffert használtunk a fehérje extrakciójához. A Trans Blot Turbo transzfer készülék (Bio-Rad, Hercules, CA) fehérjéket vitt át az előre elkészített poliakrilamid gélekből (Bio-Rad) a nitrocellulóz membránokba. A membránokat anti-foszforilált jelátalakítóval és a 3. transzkripció aktivátorával (pSTAT3 T705) (nyúl poliklonális, 1: 2500; Cat # 9145), anti-STAT3-val (egér monoklonális, 1: 2500; Cat # 9139), anti-STAT5-vel inkubáltuk. (nyúl poliklonális, 1: 1000; Cat # 9363), anti-UCP1 (nyúl monoklonális, 1: 1 000; Cat # 14670) és anti-β-aktin (nyúl poliklonális, 1: 20 000; Cat # 4970). Az összes antitestet a Cell Signaling Technology-tól (Danvers, MA) szereztük be. A membránokat detektáltuk egy Odyssey infravörös képalkotó rendszeren (LI-COR, Lincoln, NE) fokozott kemilumineszcencia (Bio-Rad) alkalmazásával, és a densitometriai kvantifikációkat belső LI-COR Odyssey szoftverrel hajtottuk végre.

Immunhisztokémia

Az íves magot (ARC) minden szeletben meghatároztuk DAPI és POMC festéssel, valamint az Allen Brain Atlas segítségével (http://mouse.brain-map.org/static/atlas) orientálva. Az ARC-ban zöld és vörös festést, valamint zöld-vörös kolokalizációkat számláltunk, és a pSTAT3 és POMC kettős pozitív sejteket normalizáltuk az ARC-ben lévő összes POMC-pozitív sejt számához. A pSTAT3- és POMC-pozitív sejtek összes számát normalizáltuk ARC területére.

Folyadékkromatográfia kvantitatív repülési idő tömegspektrometria

1H-NMR

10 mmol/l (4,5 g/ml) celasztrol törzsoldatot készítünk tiszta deuterált DMSO-ban (DMSO-d6). Ebből az állományból a következő oldatokat készítettük: 1) celastrol 177,5 μmol/L (0,08 mg/ml) végső koncentrációban DMSO-d6-ban; 2) celasztrol PBS-ben 50% DMSO-d6-val; 3) celasztrol PBS-ben 10% DMSO-d6-val és 4) celastrol PBS-ben 5% DMSO-d6-tal. A DMSO-d6-ban lévő 177,5 μmol/l celasztrol mintát használtuk referenciaként, ahol a celastrol oldhatóságát 100% -nak tekintjük. Az összes minta alikvot részeit ezután 37 ° C-on inkubáltuk, és a 0., a 7. és a 14. napon mértük. A mintákat ezután egydimenziós (1D) 1H-NMR-nek vetettük alá 37 ° C-on Bruker 600 MHz-es spektrométeren, amely egy QCI CryoProbe (1 H, 31 P, 13 C, 15 N), amely Z-gradiensekkel van ellátva. 1D 1 H kísérleteket WATERGATE impulzus-szekvenciával, 19 k időtartománnyal és 128 szkenneléssel hajtottunk végre, 177,5 μmol/l Celastrol mintákat használva 100% DMSO-d6-ban és PBS pufferben (pH 7,4) és 5%, 10% és 50% DMSO-d6. A celastrol oldhatóságát a tiszta DMSO-d6-ban a celastrol aromás 6 protonjának csúcsintenzitásának 0-os idő és az ugyanazon celastrol-proton PBS-oldatban mért csúcsintenzitásának aránya alapján számítottuk.

Statisztikai elemzések

A celastrol első rendű célpontjainak azonosítása érdekében a következőkben felmértük azokat a kulcsfontosságú hipotalamusz jelzőhálózatokat, amelyek összehangolják a glükóz és az energia homeosztázisát. Meglepő módon a celastrol DIO egereknek (36 ± 1 hét, a HFD 32 hete) történő beadása jelentősen megnövelte az Agouti-val kapcsolatos fehérje (AgRP) mRNS expresszióját, de nem volt hatással más neuropeptidek, valamint a leptin és a melanokortin szignáljának komponenseinek mRNS expressziójára (Kiegészítő 4A és B ábra). Ezenkívül a celastrol csekély hatást gyakorolt a hipotalamusz ER stresszében és a hipotalamusz gyulladásában szerepet játszó gének mRNS szintjére (Kiegészítő 4C. Ábra). A celastrol-kezelés után a hipotalamusz AgRP expressziójának majdnem azonos és kissé paradox növekedéséről Liu és mtsai. (1), ami valószínűtlenné teszi, hogy véletlen vagy műtárgy legyen. Inkább ellensúlyozó válasz lehet a celastrollal kezelt egerek negatív energiamérlegére. Összességében azonban az AgRP mRNS szintjének növekedésének oka továbbra is megfoghatatlan.

A celastrol beadása nem vezetett a hipotalamuszban a leptinre reagáló idegsejtek további aktiválódásához, amint azt a pSTAT3-pozitív POMC neuronok hasonló száma mutatja (3A és B ábra). Ennek ellenére és összhangban áll Liu és mtsai. (1), a leptin target STAT3 foszforilációs szintje (3C. És D ábra), valamint az alap STAT3 és STAT5 fehérje szintje (3C és E ábra) megemelkedett celastrol injekcióval ellátott egerekben. Ezek az adatok arra utalnak, hogy a celastrol ösztönözheti a leptinre reagáló POMC neuronok további aktiválódását, vagy további LepRb-t expresszáló neuronális szubpopulációk toborzását és aktivációját indukálhatja a hipotalamuszban. A leptin-szignalizáció súlyosbodását a leptinre reagáló idegsejtekben megkönnyítheti a JAK-STAT visszacsatolás gátlásának közvetlen celastrol-vezérelt megszakítása.

A leptinrezisztencia kialakulásának feltételezett molekuláris szereplője a leptin negatív visszacsatolás-szabályozó, a PTP1B. Nemrégiben beszámoltak arról, hogy a Celastrol közvetlen gátló aktivitással rendelkezik a PTP1B ellen egy in vitro foszfatázvizsgálatban (14). Ugyanakkor mind a WT, mind a globális PTP1B-hiányos egerekben celastrol által kiváltott súlycsökkenést találtunk, jelezve, hogy vannak PTP1B-független celastrol-hatásmechanizmusok. A PTP1B és a T-sejtes PTP (TCPTP) közötti nagy szekvenciájú homológia azonban valószínűvé teszi, hogy a TCPTP is a celastrol célpontja. Ez egybecseng a legújabb tanulmányokkal, amelyek azt mutatják, hogy a PTP1B és a TCPTP jelátvitelnek csak a POMC idegsejtekben történő egyidejű törlése blokkolja a hipotalamusz leptin hatásait az iWAT barnulással és a BAT aktivációval (24). Ennek megfelelően az iWAT barnulással és a BAT UCP1 expresszióval kapcsolatos eredményeink rámutathatnak mind a PTP1B, mind a TCPTP celastrol általi gátlására. A kompenzáló hipotalamusz TCPTP jelátvitel megmagyarázhatja a celastrol zavartalan fogyás hatékonyságát globális PTP1B KO egerekben. Azonban, hogy a celastrol valóban gátolja-e a TCPTP-t, azt in vitro kötési vizsgálatokkal vagy in vivo egér funkcióvesztési modellekkel kell megvizsgálni.

A hipofágia, mint a celastrol által kiváltott fogyás fő mozgatórugója, a központi idegrendszert mint elsődleges celastrol célszövetet vonja maga után. Konkrétan a leptin-függő lenyelési magatartást irányító központi idegrendszeri központok tűnnek a legígéretesebbnek a celastrol hatásának. A jövőbeni tanulmányoknak meg kell határozniuk ezeknek a központi idegrendszeri területeknek a viszonylagos hozzájárulását a celastrol működéséhez. A Celastrol kémiai instabilitása vizes pufferekben, különösen DMSO jelenlétében az oldhatóságának növelése érdekében, azonban megnehezítheti a celastrol központi idegrendszerben végzett katabolikus hatásainak krónikus tanulmányait. Az ilyen vizsgálatok a központi idegrendszeri celastrol hatásaira irányulhatnak a leptin-melanocortin jelátvitelre a hipotalamusz AgRP és/vagy POMC neuronokban, de a hipotalamuszon kívüli neurokeringés ugyanolyan fontos lehet. A jövőbeni tanulmányok segítenek megkülönböztetni a celastrol központi idegrendszerre gyakorolt közvetlen hatásait a celastrol által kiváltott fogyás okozta közvetett hatásoktól vagy a perifériás célpontok, például a hasnyálmirigy β-sejtjei elleni potenciálisan közvetlen hatásoktól (3).

Összefoglalva, az UCP1 funkcióvesztés modelljeiben elért eredményeink a celastrol által kiváltott iWAT vagy BAT barnulás és az UCP1-függő vagy -független termogenezis (25–28) ellen érvelnek, amelyek a celastrol okozta súlyvesztés elsődleges okai. Inkább úgy tűnik, hogy a celastrol súlycsökkenésre gyakorolt fő hatása a FI központi idegrendszeri vezérlésén keresztül valósul meg. Az életkor vagy a LepRb szignalizáció feltételezett szenzibilizálása kulcsfontosságú tényezőnek tűnik a celastrol katabolikus hatásainak hiányában felnőtt egerekben, de normális fogyás esetén a fiatal Lep ob egerekben. A leptin jelátvitelének módja és pontos szerepe azonban továbbra is megfoghatatlan. Összességében megerősítjük a celastrol mint elhízás elleni gyógyszer jelentős potenciálját. Egy páros táplálkozási vizsgálatból kiderült, hogy a test adipozitásának elvesztését és a sovány tömeg kismértékű elvesztését a celastrol-kezelés után kizárólag az FI csökkentése eredményezte. Ennek megfelelően a celastrol biztonságosnak és hatékonynak tűnik az elhízás preklinikai modelljeiben és sovány egerekben. Ezek a felfedezések ösztönzik a leptin-szenzibilizátorok, mint az anyagcsere-diszfunkció elleni gyógyszerek felülvizsgálatát. Ezenkívül a celastrol molekuláris hatásának meghatározásával új fényt vethetünk arra a rejtélyre, amely a leptin-rezisztencia.

Cikk információk

Köszönetnyilvánítás. A szerzők köszönetet mondanak Emily Baumgartnak, Heidi Hofmannnak, Laura Sehrernek és Luisa Müllernek (Helmholtz Zentrum München, München, Németország) ügyes technikai segítségükért.