Geobacillus stearothermophilus T-6-ból származó 43-β-d-xilozidáz család kristályosítása és előzetes kristálytani elemzése

Christian Brüx

Biokémiai Intézet, Kölni Egyetem, Németország

Karsten Niefind

Biokémiai Intézet, Kölni Egyetem, Németország

Alon Ben-David

b Biotechnológiai és Élelmiszeripari Tanszék és Katalízistudományi és Technológiai Intézet, Technion – Izraeli Műszaki Intézet, Haifa, Izrael

Maya Leon

b Biotechnológiai és Élelmiszeripari Tanszék és Katalízistudományi és Technológiai Intézet, Technion – Izraeli Műszaki Intézet, Haifa, Izrael

Gil Shoham

c Szervetlen kémia tanszék, valamint a szerkezeti kémia és biológia laboratóriuma, Jeruzsálem Héber Egyetem, Jeruzsálem, Izrael

Yuval Shoham

b Biotechnológiai és Élelmiszeripari Tanszék és Katalízistudományi és Technológiai Intézet, Technion – Izraeli Műszaki Intézet, Haifa, Izrael

Dietmar Schomburg

Biokémiai Intézet, Kölni Egyetem, Németország

Absztrakt

A β-d-xilozidázok (EC 3.2.1.37) olyan hemicellulázok, amelyek egyetlen xilózegységet hasítanak a xiloligomerek nem redukáló végéből. Ebben a tanulmányban a 43-as család glikozid-hidrolázából származó Geobacillus stearothermophilus T-6-ból (XynB3) származó β-d-xilozidáz kristályosítását és előzetes röntgenelemzését írják le. A XynB3 egy 535 aminosav fehérje, amelynek számított molekulatömege 61 891 Da. A tisztított rekombináns natív és katalitikus inaktív mutáns fehérjéket xilobiózzal kristályosítottuk és együtt kristályosítottuk két különböző tércsoportban: P21212 (egységsejt-paraméterek a = 98,32, b = 99,36, c = 258,64 Å) és P41212 (vagy P43212 enantiomorf tércsoport; egység; egység) -cell paraméterek a = b = 140,15, c = 233,11 Å), a mosószertől függően. A kristályok kriokondíciókba történő átvitele nagyon gondos protokollt igényelt. Az ortorhombikus kristályok 2,5 Å-re, a tetragonális kristályok pedig 2,2 Å-re diffrakcionálódnak.

1. Bemutatkozás

A Xylan a növény sejtfalában a leggyakoribb hemicellulóz-poliszacharid, amely teljes száraz tömegének akár 30–35% -át is képviseli. Ez a heteropoliszacharid egy β-1,4-kapcsolt xilopiranozil gerincből áll, amely különböző csoportokkal szubsztituálva van, például a-l-arabinofuranozil-, d-glükuronopiranozil-, 4-O-metil-d-glükuronopiranozil- és acetilcsoportokkal. A xilán teljes lebomlása kulcsfontosságú lépés a szén-dioxid körforgásában a természetben, és szerkezeti összetettsége miatt több hemicelluláz szinergikus hatását igényli (Shallom & Shoham, 2003 ▶; Beg és mtsai, 2001 ▶; Collins és mtsai., 2005 ▶). Ezen enzimek közül a β-d-xilozidázok (EC 3.2.1.37) felelősek a xilóz egységek végső felszabadulásáért az endo-1,4-β-xilanázok által létrehozott xiloligomerekből (EC 3.2.1.8), amelyek hidrolizálják a xilán gerincét.

A hemicellulázok elsősorban glikozid-hidrolázok (EC 3.2.1–3.2.3), egy olyan enzimek széles körű csoportja, amelyek hidrolizálják a glikozidos kötést két vagy több szénhidrát vagy egy szénhidrát és egy nem szénhidrát rész között (Henrissat et al., 1995 ▶). A glikozidos kötés hidrolízise két mechanizmus egyikével hajtható végre, ami a szubsztrát anomer konfigurációjának megtartásához vagy megfordításához vezet. Mindkét mechanizmushoz két karbonsav szükséges. A visszatartó glikozidázok kettős helyettesítési mechanizmust alkalmaznak, ahol az egyik katalitikus maradék nukleofilként, a másik általános sav-bázisként működik. A glikozidázok inverziója egyetlen helyettesítő mechanizmust alkalmaz, amelyben az egyik karbonsav általános savként, egy pedig általános bázisként működik (Sinnott, 1990 ▶). Jelenleg több mint 17 000 glikozidáz-szekvencia ismert, és katalitikus doménjeik szekvenciaalapú osztályozása glikozid-hidroláz (GH) családokba és klánokba elérhető a folyamatosan frissülő szénhidrát-aktív enzimek (CAZY) szerveren (http: // afmb. cnrs-mrs.fr/CAZY/). A β-xilozidázok megtalálhatók a visszatartó GH 3, 39, 51, 52 és 54 családokban és az invertáló GH családokban 43.

2. Kísérleti

2.1. Kifejezés és tisztítás

A G. stearothermophilus T-6-ból származó xynB3 gént (GenBank hozzáférési szám> AAT98625) a pET9d vektorba (Novagen) klónoztuk, Espressichia coli BL21-ben (DE3) (Novagen) túlexpresszáltuk és a korábban leírt módon megtisztítottuk (Shallom et al., 2005 ▶). Röviden, a Terrific Broth táptalaj egyik napról a másikra történő növekedését követően a tenyészetet összegyűjtöttük, újraszuszpendáltuk és megszakítottuk egy francia sajtón keresztüli két átjárással. A sejtkivonatot centrifugáltuk, és az oldható frakciót hőkezeltük (333 K, 30 perc), majd újra centrifugáltuk. Az oldható frakcióban lévő rekombináns XynB3-at tovább tisztítottuk gélszűréssel, Superdex 200 26/60 oszlop alkalmazásával.

2.2. Kristályosítási kísérletek

A kristályosítási kísérleteket 285 K hőmérsékleten végeztük, 24-lyukú lemezeken a gőz-diffúziós módszer ülő-csepp beállításával. A kezdeti kristályosodási körülményeket a ritka-mátrixos megközelítéssel (Jancarik & Kim, 1991 ▶) szkríneltük, és tovább javítottuk a Hampton Research mosó- és adalékanyag-szűrőkkel. A kezdeti cseppeket úgy állítottuk elő, hogy 2 µl fehérjeoldatot összekevertünk 2 µl tartályoldattal, és egyensúlyba hoztuk őket 300 µl tartályoldattal. A kristályosodási körülmények javulása után a csepp 5 µl fehérjeoldatból áll, 22–30 mg ml-1 koncentrációban, 5 µl tartályoldatból és 1 µl detergensoldatból, és a tartály térfogatát 500 µl-re növeljük. Kokristályosítás esetén 0,4 µl 500 mM xilobióz-oldatot adunk a cseppekhez.

2.3. Krioprotektáló puffer és diffrakciós kísérletek

Kriogén hőmérsékleten végzett röntgendiffrakciós kísérletekhez a kristályokat krioprotektorként glicerint tartalmazó oldatba helyeztük. Ez a lépés nagyon érzékenynek tűnt, mivel a kristályok megbomlottak, ha közvetlenül a krioprotektáló pufferbe vitték őket. Az ilyen zavarok megelőzése érdekében a krioprotektáns koncentrációját fokozatosan növelték. Miután az oldat 17% (v/v) glicerint tartalmazott, a kristályokat egy nejlon hurokra rögzítettük és folyékony nitrogénben gyorshűtéssel hagytuk. A nyers diffrakciós adatokat indexeltük, integráltuk és skáláztuk a HKL csomag DENZO-jával és SCALEPACK-jával (Otwinowski & Minor, 1997 ▶).

2.4. Molekulapótló számítás

Az önforgatási számításokat a GLRF programmal végeztük (Tong & Rossmann, 1997 ▶). Kereszt-rotációs és fordítási keresésekhez a CCP4 programcsomag MOLREP és AMoRe programjait használták (Collaborative Computational Project, 4. szám, 1994 ▶).

3. Eredmények és megbeszélés

3.1. Kristályosítás és kristályoptimalizálás

Képek a XynB3 kristályairól (a) primitív ortorombikus kristály formában DDAO detergenssel és (b) primitív tetragonális kristály formában HEGA-8 detergenssel polarizált fény alatt növesztve.

3.2. Krioprezervációs protokoll

A végső krioprotektáló oldat 17% (v/v) glicerint, 19% (w/v) PEG 6000-t, 0,1 M MES-t (pH 5,4) tartalmazott, és mint fentebb említettük, a kristályok krioprotektánsba történő átvitelét nagyon apró lépések. Ha a krioprotektáns koncentrációja túl gyorsan növekedett, mindkét típusú kristály azonnal megszakadt, és nem volt használható további diffrakciós kísérletekhez. A kielégítő kriokondíciók eléréséhez módosított protokollt kellett alkalmazni (Garman & Doublié, 2003 ▶). Kis mennyiségű krioprotektorként glicerint tartalmazó oldatot (2–5 µl) adtunk a kristálycsepphez, majd a kristályokat legalább 2 órán át hagytuk egyensúlyban lenni, mielőtt új, magasabb glicerin-koncentrációt tartalmazó oldatot adtunk volna hozzá. Annak érdekében, hogy a csepp térfogata állandó maradjon, nem sokkal korábban eltávolítottuk ugyanazt a térfogatot, amelyet a csepphez adtunk. Az XynB3 kristályokhoz használt módosított protokollt 4 nap alatt végeztük, amíg el nem értük a végső kriofeltételeket. A glicerin mint krioprotektáns PEG-vel, MPD-vel, paraffinolajjal vagy glükózzal történő helyettesítése nem javította a krioprotokolot.

3.3. Adatgyűjtés és -feldolgozás

A DDAO-val tenyésztett kristályok diffrakciós adatait a Berliner Elektronenspeicherring Gesellschaft für Synchrotronstrahlung (BESSY, Berlin) BL1 sugárvonalán gyűjtöttük a Protein Structure Factory (PSF). A legjobb adatokat 2,5 Å felbontással mértük (1. táblázat ▶). A diffrakciós mintázat ortorombos egységcellát jelez, az egységsejt-paraméterekkel a = 98,318, b = 99,358, c = 258,642 Å. A gélszűréssel végzett korábbi biokémiai jellemzések azt mutatják, hogy az XynB3 egy oldatban lévő trimer. A legvalószínűbb V M érték (Matthews-együttható) azonban 2,5 Å 3 Da −1, feltételezve, hogy az aszimmetrikus egységben négy xilozidáz monomer van (246,5 kDa; 51,4% oldószertartalom; Matthews, 1968 ▶). Ennek a kristályformának az önforgatási funkciója összhangban áll az enzim tetramer kvaterner szerkezetével, 222 pont szimmetriával (2. ábra ▶ a). A várható kristálytani csúcsok mellett az önforgatás nyolc nem krisztallográfiai csúcsot mutat κ = 180 ° szelekcióban. Ezek közül a csúcsok közül kettő tartozik egy 222 rendszerbe, amely három két tengelyre merőleges, egymásra merőleges. Mindegyik 222 rendszer harmadik kettős tengelye párhuzamos a kristályrajzi c tengellyel. Nem figyeltünk meg olyan 120 ° -os forgástengelyeket, amelyek trimer kvaterner szerkezetet jeleztek volna.

(a) Önforgatási függvény az ortorombos tércsoport számára, κ = 180 ° szakasz. (b) Önforgatási funkció a tetragonális tércsoport számára, κ = 180 ° szakasz.

Asztal 1

A zárójelben lévő értékek a külső héjra vonatkoznak.

Kristály forma Ortorombos (DDAO detergens) Tetragonális (HEGA-8 detergens)

Szinkrotron	BL1, PSF, BESSY, Berlin	X13, EMBL Outstation, Hamburg
Hullámhossz (Å)	0,9797	0,8048
Egységcellás paraméterek
a (Å)	98,32	140.15
b (Å)	99,36	140.15
c (Å)	258,64	233.11
Űrcsoport	P21212	P41212 (vagy P43212)
Nem monomerek AU-ban	4	4
VM (Å 3 Da −1)	2.5	2.3
Oszcillációs szög keretenként (°)	0,3	0.1
Keretek száma	823	772
Adatgyűjtési hőmérséklet (K)	100	100
Felbontás (Å)	2,5 (2,54–2,50)	2,2 (2,23–2,20)
Mozaikosság (°)	0,36	0,41
Visszaverődések száma	3044731	5966877
Az elutasított gondolatok száma	9600	5096
Egyedi reflexiók száma	88547	116620
Teljesség (%)	99,9 (99,1)	99,5 (97,8)
Rmerge (%)	6,6 (12,4)	7,1 (19,6)
〈I/σ (I)〉	22,7 (12,3)	12,0 (6,5)

A HEGA-8 detergenssel növesztett második kristályforma adatait X13 gerenda vonalon gyűjtöttük a hamburgi EMBL Outstationben (1. táblázat ▶). A teljes adatkészlet 2,2 Å felbontású volt. Az adatokat a primitív tetragonális P41212 (vagy P43212) tércsoportban lehet indexelni, az egység-cella paraméterekkel a = b = 140,15, c = 233,11 Å. A Matthews-együttható kiszámítása azt sugallja, hogy az aszimmetrikus egységben négy monomer van, V V 2,3 Å 3 Da −1 és oldószertartalom 46,4%. Akárcsak az ortorombos tércsoportban, az önforgatási funkció összhangban van egy tetramer kvaterner szerkezettel (2. ábra ▶ b). Ebben az esetben a nem kristálytani 422 rendszerek is láthatók, a három két tengely egyikével párhuzamosan a kristálytengelyes c tengellyel.

3.4. Szerkezeti megoldás

Az XynB3 szerkezetét molekuláris helyettesítési technikák alkalmazásával oldottuk meg, a Bacillus subtilis-ból származó 43-β-d-xilozidáz család felépítésével (PDB kód: 1yif; Patskovsky & Almo, 2005 ▶). Ez a fehérje 65% -os szekvencia-hasonlóságot mutat az XynB3-mal. A CCP4 programcsomag MOLREP és AMoRe programjainak felhasználásával (Collaborative Computational Project, 4. szám, 1994 ▶) jelentős rotációs és transzlációs függvény csúcsokat lehetett találni, amelyek a két kristályforma mindegyikéhez elfogadható kristálytömlődéshez vezettek. A teljes szerkezetelemzés folyamatban van.

Köszönetnyilvánítás

Ezt a tanulmányt a GIF (a Német – Izraeli Tudományos Kutatási és Fejlesztési Alapítvány, az YS, a DS és a GS részére) és az Izraeli Tudományos Alapítvány (a GS és az YS) támogatásával támogatta. További támogatást nyújtott az Otto Meyerhof Minerva Biotechnológiai Központ, Technion, amelyet a Minerva Alapítvány hozott létre (München, Németország).