Iridoid glikozid frakció rákellenes hatása Dipsacus fullonum L. Levelek

Cikk információk

Merike Vaher, a Tallinn Műszaki Egyetem Kémiai és Biotechnológiai Tanszéke, Akadeemia tee 15, 12618, Tallinn, Észtország; [e-mail védett]

dipsacus

Absztrakt

A népi gyógyászatban a gyógynövénykivonatokat a korok során széles körben alkalmazták különböző betegségek kezelésére, míg a modern fitokémiai és farmakológiai vizsgálatok további ismereteket szolgáltattak a gyógynövények használatáról. A nemzetség Dipsacus 15 fajt foglal magában, amelyek Európában, Nyugat-Ázsiában és Észak-Afrikában elterjedtek, 1 és a népi gyógyászatban alkalmazott népszerű növényi gyógyszerek. A Dipsacus faj, D. asper és D. asperoides a gyökereket és a magokat vizsgálták a legalaposabban. Régóta használják derékfájás, traumás haematoma, csonttörések és gyulladások kezelésére. 2-5 A kiválasztott kivonatok, valamint izolátumok Dipsacus fajok kimutatták, hogy különféle bioaktivitást mutatnak, beleértve a neuroprotektív, 6 antioszteoporotikus, 7 antioxidáns, 2 antikomplementer, 8 és antibakteriális hatást. Ezenkívül ezekről a fajokról beszámoltak arról, hogy terápiás hatást gyakorolnak az allergiás asztmára 10 és a különböző bőrbetegségekre. 11-15 Nemrégiben végzett tanulmány több tucat bioaktív vegyületet tárt fel Dipsacus fajok, beleértve a triterpenoidokat, a triterpenoid szaponinokat, az iridoid glikozidokat, a fenolsavakat és az alkaloidokat. 16.

Annak ellenére, hogy Dipsacus hosszú népi múltja van a rák kezelésében, a citotoxikus és daganatellenes tevékenységekre vonatkozóan 13 adat kevés. Csak néhány tanulmány készült teljes gyökérkivonatának 17 és az izolált aktív vegyületek, például vízoldható poliszacharid (16 kDa), 18 indolalkaloidok, 19 és szaponinok antiproliferatív aktivitásáról. 9,20 -22

Az iridoidok, a növényi eredetű bioaktív vegyületek másik típusa, az izoprénből bioszintetizált ciklopentano [c] pirán-monoterpenoidok nagy csoportja. Ezek az iridoidok és glikozidjaik számos növénycsalád alkotóelemei, beleértve a Dipsacus faj. A fent említett vegyületek biogenetikai és kemotaxonómiai jelentőséggel bírnak, mivel strukturális kapcsolatot teremtenek a terpének és az alkaloidok között. Az iridoid glikozidok jelentős tumorellenes aktivitásáról számos kutató számolt be. 23 -28

A mai napig körülbelül 30 iridoidot izoláltak D. asper, D. laciniatus, D. fullonum, D. japonicus, és D. ferox, 16,29, de citotoxikus hatásukat csak néhány kutató értékelte. A. Széles körű elterjedése és figyelemre méltó farmakológiai aktivitásai Dipsacus fajok jelzik az új természetes gyógyszerek felfedezésének és kifejlesztésének lehetőségét. Korábban a levelei és a gyökérkivonat D. fullonum csak az α-amiláz gátlására vizsgálták, 32 míg terápiás tulajdonságainak leírása leginkább enciklopédiákban található. 12,15 A D. fullonum a rák kezelésére a népi gyógyászatban néhány publikációban említést tettek. 13,14

Ez a tanulmány a D. fullonum rákellenes aktivitású vegyületek felkutatása céljából távozik. Ezért a metanolos kivonat iridoid glikozid frakcióját jellemeztük, és in vitro citotoxicitását igazoltuk egér fibroblaszt NIH/3T3, egér melanoma B16F10, HeLa humán méhnyakrák, valamint emberi mellrák MCF7 és MDB-MB-231 sejtek ellen.

Eredmények és vita

A bisz-iridoid glikozid frakció szétválasztása és azonosítása

A kvalitatív értékeléshez az összes összegyűjtött frakciót vékonyréteg-kromatográfiával (TLC) elemeztük, UV-besugárzással 254 és 312 nm hullámhosszon, hogy láthatóvá tegyük a vegyületek jelenlétét. A 312 nm-es besugárzási hullámhosszt alkalmaztuk az iridoid glikozid frakció kiválasztásához, kiküszöbölve a klorofill sávot, amelyről ismert, hogy rákellenes hatású. 33 A TLC eredmények alapján az azonos retenciós tényezővel rendelkező foltokat tartalmazó frakciókat 1 frakcióvá egyesítettük, bepároltuk és nagy teljesítményű folyadékkromatográfia-diódasorozat detektálás-tömegspektrometriával (HPLC-DAD-MS) elemeztük. Az elemzés azt mutatta, hogy az iridoidok a 9-27. Frakciókban voltak jelen. A további kísérletekhez azonban a kombinált iridoid frakciót választották, amely a többi komponens közül a legszabadabb, beleértve a klorofillt.

A második fő csúcs a 9-11. Frakcióra kapott vegyület 2) szilvestrozid III– (IV) dietil-acetálként azonosították, C31H46O15 molekulaképlettel és 658,2837 Da monoizotópos molekulatömeggel. A HRMS elemzés feltárta a deprotonált ion megjelenését a m/z 657,2746 (számítva: m/z 657,2759). A pszeudomolekuláris ion töredezése 2 szülőiont termelt a m/z 625,2487 (számítva: m/z 625.2493) és m/z 447,1853 (számítva: m/z 447,1866), amelyek megfelelnek a metoxicsoport (−32 Da) és az iridoid (−120 Da) veszteségének. A spektrális vonal a m/z 267,1224 (számítva: m/z 267.1233) a molekulatöredékhez tartozott, amely elveszítette az iridoidot (-120 Da), a glükozidot (-162 Da) és a vizet (-18 Da). Valószínűleg ennek a vegyületnek nincs természetes eredete, és az acetilezési reakció során keletkezett a frakció etanollal történő kezelése során, ezért műtárgynak kell tekinteni.

Citotoxicitási teszt

1. ábra Az elhalt sejtek mennyiségének meghatározása az iridoid glikozid frakcióval végzett 72 órás inkubálás után. A PI felvétel becslésének eredményeit 72 óra múlva az (A) és (B) ábrák mutatják. Az 1: 5-szörös hígított frakcióval kapott eredményeket az (A) ábrán mutatjuk be, a hígítatlan frakció citotoxicitását a (B) ábra mutatja be. (A) és (B) az átlag ± szórást mutatja; legalább 3 független kísérletet hajtottak végre 3 párhuzamban; *P

A PI vizsgálati eredmények alapján a hígítatlan iridoid glikozid frakció citotoxicitását a WST-1 teszttel csak 72 órás inkubálás után becsültük meg. Az eredmények azt mutatták, hogy a frakció statisztikailag szignifikáns csökkenést váltott ki (P A 2. ábra), míg a nem rákos NIH 3T3 sejtekkel szembeni toxicitás alacsony volt, 92,8% ± 0,5%, összehasonlítva a kontrollal. A HeLa sejtek statisztikailag szignifikáns érzékenységet mutattak az iridoid glikozid frakció toxicitása iránt (78,9% ± 4,7%), ami a sejtek metabolikus aktivitásának korai változásainak tulajdonítható, míg a PI vizsgálat még mindig nem mutatott az elhalt sejtek számának növekedése.

2. ábra A hígítatlan frakció WST-1 életképességi vizsgálati eredményei 72 órán át különböző sejtvonalaknál. Az ábra mutatja az átlag ± szórást; legalább 3 független kísérletet hajtottak végre 3 párhuzamban; **P

Nemrégiben az acilezett iridoidok a Premna odorata (Lamiaceae) kimutatták, hogy erős antiproliferatív aktivitással rendelkeznek a különböző emlőrákos sejtvonalak, köztük az MCF 7 és az MDB-MB-231 ellen, a sejtvonal ERα és c-Met expressziójától függően. 35 Jelen tanulmányban a kutatók kimutatták, hogy nem módosított iridoid glikozidokat izoláltak D. fullonum a levelek szelektív citotoxikus hatást gyakoroltak ugyanazokra a tumorsejtvonalakra, míg a normál NIH3T3 sejtvonalat sokkal kevésbé.

Következtetések

A jelenlegi vizsgálatban a bisz-iridoid glikozid frakció a D. fullonum leveleket elválasztottuk és jellemeztük. A HPLC-MS elemzések azt mutatták, hogy a frakció főleg bisz-iridoidokból áll. A vizsgálat eredményei azt mutatták, hogy az iridoidok szelektív citotoxikus hatást fejtettek ki a különböző rákos sejtekre, míg a normál sejtekre ilyen hatást nem figyeltek meg. A WST-1 vizsgálat megállapította az MCF7 és MDB-MD-231 sejtek szignifikáns érzékenységét az iridoid glikozidokkal szemben. D. fullonum levélkivonatok. A WST-1 assay a mitokondriális funkció csökkenését is bizonyította, míg a PI növekvő számú elhalt sejtet mutatott ki. További tanulmányokra lesz szükség az iridoidok mellrákellenes molekuláris mechanizmusának alaposabb megértéséhez.

Kísérleti

Anyagok

Az összes reagens analitikai minőségű volt, és a kapott állapotban használtuk fel. Kloroform, n-butanolt, acetonitrilt, hangyasavat (FA), PI-t és foszfáttal pufferolt sóoldatot (PBS) a Sigma & Aldrich-től (Németország) szereztünk be. A metanolt és az etanolt (EtOH) a Fluka (Svájc) cégtől szerezték be. Deionizált vizet (Milli Q, Millipore S AS, Molsheim, Franciaország) használtunk az összes oldat elkészítéséhez.

Kivonás

A levelek Dipsacus fullonum, Az észtországi Saaremaában gyűjtött, 2017. június-augusztus folyamán Milli Q vízzel mostuk, szobahőmérsékleten szárítottuk és mechanikus darálóban porítottuk.

A növényi azonosítást autentikus Dipsacus fullonum mintával történő összehasonlítással végeztük, és az utalványmintát letétbe helyeztük az Észt Élettudományi Egyetem (TAA) Mezőgazdasági és Környezettudományi Intézetének herbáriumában, TAA0153271-TAA0153274.

Az extrakció körülményeit és oldószerét egy korábban publikált tanulmány szerint választottuk meg. 36 Tíz gramm levegőn szárított porított levél D. fullonum 200 ml 80% -os metanollal áztattuk egy kupakkal ellátott palackban szobahőmérsékleten 1 órán át, és ultrahangos fürdővel 40 ° C-on 30 percig extraháltuk. Az elegyeket 10 percig 8000 fordulat/perc sebességgel centrifugáltuk, majd 0,45 um-es cellulózszűrőn átszűrtük. Egy alikvot részt előzetes azonosítási elemzésnek vetettek alá. Az extraktum fő részét rotációs bepárlóban szárazra pároljuk, majd lemérjük.

Az iridoid glikozidok keverékének izolálása

A száraz nyers extraktum D. fullonum oszlopkromatográfiának vetettük alá egy üvegoszlopot (15 cmx2,5 cm), szilikagél szuszpenzióval (40, 100 um) kloroformban töltve, nyers kivonat/szilikagél arányban 1:20. A nyers extraktum száraz feltöltési módszerét alkalmaztuk. Ehhez a nyers extraktum bizonyos részét feloldjuk metanolban, és kis mennyiségű szilikagélen adszorbeáljuk, rotációs bepárlóval szárítjuk és az oszlopra visszük. Az oszlopot lépés-gradiens elúciós technikával eluáljuk kloroformtól metanolig.

Az oszlopot úgy alakítottuk ki, hogy mindegyik eluenshez 10 ml-t adtunk, miközben 3 ml-es frakciókat gyűjtöttünk; a frakciókat vékonyréteg-kromatográfiával értékeltük, víz: etanol: mozgófázis alkalmazásával.n-butanol (1: 1: 4). Összesen 54 frakciót gyűjtöttünk össze. Az azonos foltokkal és azonos retenciós faktorokkal rendelkező frakciókat 1 frakcióra egyesítettük. Az iridoid glikozid frakciót szárazra pároljuk. Szárítás után 5 mg szilárd maradékot feloldottunk 500 ul etanolban, és HPLC-MS elemzésnek vetettük alá.

Kromatográfiai elemzés

A kromatográfiás elválasztásokat egy Agilent Technologies 6540 UHD Accurate-Mass Q-TOF LC/MS spektrométeren végeztük, amely diódasoros detektorral és AJ-ESI ionizációs forrással volt felszerelve (Agilent Technologies, Santa Clara, Kalifornia, USA). Az optimális elválasztást Eclipse Plus C18 oszlopon (150 × 2,1 mm, 3,5 um; Agilent Technologies, USA) végeztük, 0,1% vizes FA-ból és 0,1% FA-t tartalmazó acetonitrilből álló mozgófázissal. A HPLC elválasztást folyamatos gradiens elúciós módszerrel végeztük. A gradiens program a következő volt: 0 perc - 0% B, 20 perc - 50% B, 25 perc - 95% B, 5 percig izokratikus. Ezután a rendszert 5 percig egyensúlyban tartjuk. A detektálási hullámhosszat, az áramlási sebességet, az oszlop hőmérsékletét és az injektálási térfogatot 254 nm-re, 0,6 ml/perc, 20 ° C-ra és 5 µl-re állítottuk be. Az MS elemzés paramétereit negatív ion módban állítottuk be, a spektrumokat 100 és 1000 közötti tartományban kaptuk m/z. Nitrogént használtak porlasztáshoz és a gáz szárításához, ütközési gázként pedig héliumot. A csúcsazonosítást MS 2 analízissel érték el.

Sejtkultúrák

Egér fibroblaszt NIH/3T3, egér melanoma B16F10, HeLa humán méhnyakrák sejtek, humán emlőrák MCF7 és MDB-MB-231 sejtvonalakat az American Type Culture Collection-ből kaptunk. A sejteket Dulbecco módosított Eagle táptalajában (DMEM) (Gibco) szaporítottuk, 10% szarvasmarha borjúszérummal (Gibco) és 5% penicillinnel/sztreptomicinnel kiegészítve. Az összes sejtvonalat 37 ° C-on, nedvesített 5% CO2 és 95% levegő atmoszférában inkubáltuk.

Kezelési eljárások és a minta előkészítése

A sejteket 2,5x105 sejt/üreg sűrűséggel (The Countess Automated Cell Counter, Invitrogen) szélesztettük 96 lyukú lemezekre, és egy éjszakán át inkubáltuk. 24 órás inkubálás után 100 µL friss táptalajt vagy a bisz-iridoid frakciót tartalmazó friss táptalajt (1 µL EtOH bisz-iridoid frakcióval 1: 5-re hígítva, vagy 1 µL hígítatlan bisz-iridoid frakciót) adtunk hozzá. minden üregbe, és további 48 és 72 órán át inkubáljuk.

PI assay

A PI egy vörös fluoreszcens DNS-kötő festék, amelyet olyan életképtelen sejtek detektálására használnak, amelyeknek megszakadt a sejtmembránja, mivel nem képes keresztezni az ép sejtmembránokat. 100 ul sejttenyészethez 0,5 mM PI-t adunk PBS-ben, hozzáadunk 0,5 ul/üreg mennyiséget, és 10 percig inkubáljuk 37 ° C-on. A sejteket 1 µl 96% EtOH hozzáadásával negatív kontrollként használtuk, és PI fluoreszcenciájukat 1-nek számítottuk. A fluoreszcencia intenzitását TECAN Genios Pro mikrolemez-olvasóval mértük (gerjesztés 540 nm, emisszió 612 nm). a kivonatokkal végzett kezelések után 48 és 72 órával. A normalizált eredmények a kontroll szigetek számának növekedését jelentették.

A sejtek életképességét a WST-1 méri

Az extraktumok sejtek életképességére gyakorolt ​​hatását a WST-1 (Roche) sejt életképességi vizsgálattal határoztuk meg. A WST-1 lehetővé tette a sejtek életképességének kolorimetriás mérését, mivel az életképes sejtek a tetrazóliumsókat vízben oldható formazanná redukálták. A képződött formazán festék mennyisége korrelált az életképes sejtek számával. A méréseket a sejtkezelések után 72 órával fejeztük be. A kísérleteket 1 µl 96% EtOH hozzáadásával negatív kontrollként használtuk. Öt mikroliter lyukonként WST-1 reagenst adunk 100 µL sejttenyésztő tápközeghez, 37 ° C-on 2 órán át inkubáljuk, majd TECAN Genios Pro mikrolemez-olvasóval mértük az abszorbanciát 450 nm-en.

Statisztikai analízis

A statisztikai elemzést egyirányú varianciaanalízissel, Dunnett post hoc többszörös összehasonlító tesztjével végeztük. A grafikonok legalább 3 független kísérlet adatait ábrázolják, mindhárom példányban elvégezve, átlag ± szórásként. A sejtek életképességi vizsgálatában a pozitív sejteket 100% -ra normalizáltuk a negatív kontrollban. A PI vizsgálatban az eredmények a kontroll szigetek feletti növekedést mutatták. A statisztikai szignifikancia P

Nyilatkozat az ütköző érdekekről
A szerző (k) nem nyilatkoztak potenciális összeférhetetlenségről a cikk kutatásával, szerzőségével és/vagy publikációjával kapcsolatban.

Finanszírozás
A szerző (k) nyilvánosságra hozták a következő pénzügyi támogatás kézhezvételét a cikk kutatásához, szerzőségéhez és/vagy publikációjához: Ezt a kutatást az Észt Kutatási Tanács (Intézményi Kutatási Alap 33-20. Sz.