A doxiciklin stabilitása a takarmányban és a vízben, valamint a minimális hatékony dózis a tetraciklin által indukálható rendszerekben

Irka M Redelsperger

1 három intézményes képzési program a laboratóriumi állatgyógyászatban és a tudományban, a Sloan Kettering Memorial Cancer Center, a Weill Cornell Orvosi Főiskola és a Rockefeller Egyetem

takarmányban

Tony Taldone

2 Emlékhely a Sloan Kettering Rákközpontra

Elyn R Riedel

2 Memorial Sloan Kettering Cancer Center

Michelle L Lepherd

1 három intézményes képzési program a laboratóriumi állatgyógyászatban és a tudományban, a Memorial Sloan Kettering Rákközpont, a Weill Cornell Orvosi Főiskola és a Rockefeller Egyetem

2 Memorial Sloan Kettering Cancer Center

3 A Rockefeller Egyetem és

4 Weill Cornell Medical College, New York, New York

Neil S Lipman

1 három intézményes képzési program a laboratóriumi állatgyógyászatban és a tudományban, a Memorial Sloan Kettering Rákközpont, a Weill Cornell Orvosi Főiskola és a Rockefeller Egyetem

2 Emlékhely a Sloan Kettering Rákközpontra

4 Weill Cornell Medical College, New York, New York

Felix R Wolf

1 három intézményes képzési program a laboratóriumi állatgyógyászatban és a tudományban, a Memorial Sloan Kettering Rákközpont, a Weill Cornell Orvosi Főiskola és a Rockefeller Egyetem

2 Emlékhely a Sloan Kettering Rákközpontra

4 Weill Cornell Medical College, New York, New York

Absztrakt

A géntechnológiával módosított egerekben az 1990-es évek közepétől a tetraciklin (tet) -függő szabályozó rendszereket általában 1990-es évek közepétől használják olyan gének működésének tanulmányozására, amelyeket géninaktivációval vagy transzgén-expresszióval nem lehetett tanulmányozni. 18 Ezeket a rendszereket alaposan felülvizsgálták. 24, 39, 40 A doxiciklin előnyösebb, mint indukálószer a tetraciklinnel ezekben a rendszerekben, a doxiciklin nagy hatékonysága, kiváló szöveti penetrációja és széles körű elérhetősége miatt. 23, 3 Általában takarmányban vagy ivóvízben adják be. 39 A doxiciklin által indukálható konstrukciók széles körű elterjedtsége ellenére a jelenleg alkalmazott feltételes mutáns egérmodellek többségénél sem bizonyítékokon alapuló doxiciklin dózist, sem annak tárolására és felhasználására vonatkozó szabványt nem tettek közzé.

Egyes források szerint a takarmányban a leggyakrabban használt doxiciklin-koncentráció 200 ppm, szárazanyagra vonatkoztatva. 39, 40 Tapasztalataink és az irodalomban hivatkozott koncentrációk alapján azonban 625 ppm-et használnak legalább ilyen gyakran, ha nem is gyakrabban. 31, 37, 41 Nagy dózisokat adnak be a maximális indukció biztosítása érdekében. Bár a nagy dózisok igazolhatók a rossz behatolású szövetekbe (például agyba) történő elosztás esetén (például az agyban), 26, 31, a doxiciklin könnyen behatolhat és megfelelő koncentrációt érhet el a legtöbb szövetben. 1, 38, 47. Például a doxiciklin 2 emlős sejtvonalban 0,2 és 20 ug/ml koncentrációban kezdte gátolni a sejtek szaporodását és kolóniák képződését. 17.

A doxiciklin biológiai hatásai meghaladják az antimikrobiális aktivitást. 15, 33, 46 Valószínű, hogy a doxiciklin általánosan alkalmazott koncentrációinak némelyike, a beadás időtartamával együtt, váratlan biológiai hatásokkal járhat in vivo. Körülbelül napi 15 mg/kg dózisban adva 21 napig, a doxiciklin gátolhatja a tumorsejtek szaporodását, 15 és napi 50 mg/kg dózisok (alacsonyabb dózis, mint 625 ppm takarmányban vagy 2 mg/kg adagban). ml ivóvízben) csökkentheti az egerek hasi aneurizmájának méretét. Ezeket a megállapításokat a doxiciklin azon képességének tulajdonították, hogy gátolja a mátrix metalloproteinázokat. 46

Néhány specifikus tetraciklin-transzaktivátor (tTA, „tet-off”) mutáns esetében közzétett dózis-válasz görbék azt mutatták, hogy a minimális hatásos dózis ezeknél a konstrukcióknál lényegesen alacsonyabb (20-25 µg/ml ivóvízben), mint a jelenleg használtak. 10, 22 Annak a hipotézisnek a tesztelésére, hogy a jelenleg alkalmazott nagy dózisoknál alacsonyabb doxiciklin dózisok (ivóvízben 2 mg/ml) képesek hatékonyan kiváltani a tet-indukálható rendszereket, 2 különböző feltételes egérmutánt használtunk, amelyek mindegyikének különböző promotere és transzaktivátora volt ( R26-rtTA/TG-Ren.713 és R26-CAGS-rtTA3/TG-Ren.713), a génaktiváláshoz szükséges minimális doxiciklin-dózis meghatározásához. Mindkét mutáns vonal tartalmaz egy reverz tetraciklin transzaktivátor (rtTA, ‘tet-on’) rendszert, amelyek gyakoribbak, mint a tet-on rendszerek, és sokkal kevésbé érzékenyek a doxiciklin indukciójára. 3, 10, 14, 17, 22, 40

A beadott dózis különbségei mellett a doxiciklin kezelése a tárolás és a helyettesítés szempontjából nagyon eltérő. Bár különféle források szerint a doxiciklin tartalmú vizet 3 naponta cserélik, 10, 19, 22 minden kutató arról számolt be, hogy a vizet 48 óránként cserélik, 8 és mások hetente cserélik a vizet. 29 Tágabb értelemben gyakran ajánlott a doxiciklinnel kezelt takarmány cseréje legalább hetente. 8 A kutatók gyakran alkalmazzák ezt a követelményt a víz- és takarmánytartályok alacsony szinten tartásának igazolására a hulladék minimalizálása érdekében, és fokozott éberséget igényelnek az állattartók és a nyomozó személyzet annak biztosítása érdekében, hogy az állatok mindig elegendő élelemhez és vízhez juthassanak. Bizonyítékokon alapuló ajánlásokra van szükség a kísérletek során pazarolt élelmiszer- és vízmennyiség minimalizálása érdekében.

A tetraciklinek elnyelik az UVA fényt, és általánosságban fényérzékenynek és vízben instabilnak tekinthetők. 11, 46 Ezek a jellemzők azt eredményezik, hogy a doxiciklin oldatokat fényvédett (színezett palackokba) kell helyezni, és a vizet néhány naponta cserélni kell. 3, 39 Egy tanulmány megállapította, hogy a doxiciklin 37 ° C-os vízben, színezett palackokban stabil maradt 1 hétig. 20 Beszámoltak arról, hogy a víz savasodása nagymértékben javítja a doxiciklin stabilitását. 27 E megállapítások fényében arra kerestük a választ, hogy a doxiciklin stabilitása fordított ozmózis-tisztított (RO) vízben történik, amelyet szobahőmérsékleten (23 ° C; az a hőmérséklet, amelyen a vizet általában egereknek adagolják) egy 14-d periódus. Ezt az időkeretet annak figyelembevételével választottuk ki, hogy a legutóbbi tendencia szerint a vizes palackokat 2 hétenként cseréljük több intézményben, köztük a miénk is.

Bebizonyosodott, hogy a doxiciklin orális adagolás után széles körben eloszlik a szövetekben, különféle fajokban, 1, 2, 38, és vannak adatok a doxiciklin plazmakoncentrációiról az egereknek vízben történő beadása után, 27 a gyógyszert egereknek adják takarmányban. Mivel a kereskedelemben kapható takarmányokban a doxiciklin koncentrációit nem a vízben általában alkalmazott dózisok elérésére fejlesztették ki, nem tudni, hogy a két adagolási módszer összehasonlítható-e. Az egerek általában átlagosan 4,5 g takarmányt és 6 ml vizet fogyasztanak naponta. 4 Ezen információk felhasználásával megkíséreltük a doxiciklint vízben előállítani oly módon, hogy a takarmány 200 és 625 ppm dózisával megegyező dózist kapjon, és ezt követően megmérje az egerekben elért doxiciklin plazmakoncentrációt.

Anyagok és metódusok

Állatok.

Az állatok felhasználását az Memorial Sloan Kettering Cancer Center IACUC jóváhagyta, ahol az állatgondozási és -használati program AAALAC-akkreditációval rendelkezik, és minden állatot fenntartanak és felhasználnak az Útmutatóban megadott ajánlásoknak megfelelően. 21

Vérgyűjtés.

A vért minden nap ugyanabban az időben gyűjtötték. Az összes vérmintát összegyűjtöttük az egerekből, fékezőgépekben, az oldalsó farokvénának venipunktúrájával, miután hőforrás alatt 2–5 percig melegítettük. A maximális térfogat 100 μL vért gyűjtöttük egy EDTA-t tartalmazó kúpos csőbe (Microvette 100, Kent Scientific, Torrington, CT).

Doxiciklint tartalmazó takarmány és víz.

Kereskedelmi forgalomban kapható, 2 gyártótól (Harlan Teklad, Indianapolis, IN és PMI) vásárolt doxiciklint tartalmazó γ-besugárzott rágcsálók takarmánya az őrléstől számított 30 napon belül megkapta. 625 ppm doxiciklint tartalmazó takarmányt (TD.01306 katalógusszám, TestDiet 5053, 625 ppm doxiciklint tartalmazó PMI) használtunk a doxiciklin stabilitásának értékelésére őrlés, besugárzás, szállítás és tárolás után. 625 ppm (TD.01306) és 200 ppm (TD.00502, Harlan Teklad) doxiciklint tartalmazó takarmányt használtunk fel a génexpresszió és a plazmakoncentráció értékelésére 2 géntechnológiával módosított indukálható egér törzsben.

A doxiciklin vízben való stabilitásának értékeléséhez 500 ml oldatokat készítettünk, amelyek 2 mg/ml doxiciklint (D9891, Sigma Aldrich, St Louis, MO) és 5% szacharózt (S9378, Sigma Aldrich) tartalmaztak, bármelyik RO víz (pH 6,0) felhasználásával. ) vagy sósavval savanyított RO vízzel (pH 2,7), 450 ml-t zöld színű vagy színtelen, 473 ml-es poliszulfon palackokba (Thoren Caging Systems) helyezünk, és a leírás szerint elemezzük. A hatékony dózisokat kiértékelő vizsgálatokhoz a savanyított RO vízhez változó koncentrációjú doxiciklint és szacharózt adtak a doxiciklin: 2 mg/ml szacharózkoncentráció: 5%, 467 µg/ml: 2%, 150 µg/ml: 1% és 25 µg/ml: 0,23%.

A doxiciklin koncentrációjának meghatározása.

A pelleteket külön-külön őrölték egy kávédarálóban (Fresh Grind, Hamilton Beach, Southern Pines, NC). Körülbelül 25 mg őrölt pelletet tettünk egy 15 ml-es csőbe; 0,5 ml 75% víz + 25% acetonitril + 0,1% hangyasav keverékét adtuk hozzá, és az elegyet 5 percig vortexeltük, majd további 40 percig ultrahanggal kezeltük. A csövet 5 percig 180 x g-vel centrifugáltuk, a felülúszót egy új, 15 ml-es csőbe helyeztük, és egy részt (0,45 um; Sun SRI, Rockwood, TN) egy másik csőbe szűrtünk. Egy 50 µl-es alikvot részt 96 lyukú lemez mélyedésébe helyeztünk HPLC-tandem tömegspektrometriával (LC-MS/MS) történő elemzés céljából.

Vérplazma.

Plazmát (50 ul) adtunk egy 1,5 ml-es mikrocentrifuga csőbe (Eppendorf Safe-Lock, USA Scientific, Ocala, FL), majd 250 ul acetonitrilt. A mintát körülbelül 45 másodpercig vortexeltük, 5 percig centrifugáltuk 19 445 x g sebességgel, és a felülúszót egy másik mikrocentrifuga csőbe helyeztük. A mintát centrifugális bepárlón (GeneVac, Stone Ridge, NJ) bepároljuk, és a maradékot 100 ul oldószerben (75% H2O + 25% acetonitril + 0,1% hangyasav) oldjuk. Az oldatot körülbelül 15 másodpercig vortexeltük, és 5 percig centrifugáltuk 19 445 x g sebességgel; 50 µl felülúszót vittünk egy 96-lyukú lemez lyukába LC-MS/MS analízis céljából.

Víz.

Minden egyes vízmintát (50 ul) hozzáadunk 950 ul 75% víz + 25% acetonitril + 0,1% hangyasav (hígító) keverékéhez egy mikrotárcsőben, és 10 másodpercig vortexeljük; Ennek az elegynek 20 ul-jét 980 ul hígítószerhez adtuk, és 10 másodpercig vortexeltük; A végső keverék 50 ul-jét 96 lyukú lemez mélyedésébe helyeztük LC-MS/MS analízissel.

Doxiciklin elemzés.

A doxiciklin koncentrációját a takarmányban, a vízben és a plazmában LC-MS/MS (6410 modell LC-MS/MS rendszer, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) alkalmazásával határoztuk meg. Az elemzés doxiciklinen alapult (hiklátsója helyett; 1 mg doxiciklin egyenértékű 1,154 mg doxiciklinhikláttal). Az elemzést többszörös reakció monitorozási módban végeztük, pozitív ionos elektrospray ionizációval. A HPLC elválasztást 4,6 mm × 50 mm, 5 µm oszlopon (Zorbax Eclipse XDB-C18 oszlop, Agilent Technologies) végeztük, és az analitet izokratikus körülmények között (75% H2O + 0,1% HCOOH: 25% CH3CN) eluáltuk. 5 percig 0,5 ml/perc áramlási sebességgel. Doxiciklin-hiklát-standardokat alkalmaztunk egy standard görbe előállításához 50 pg/ml kimutatási határral minden típusú mintához.

Áramlási citometria.

Kísérleti terv.

A doxiciklin stabilitása a vízben.

Annak értékelésére, hogy a helyiség megvilágítási viszonyai (750 ± 110 lx a világítás alatt; 12: 12-órás fény: sötét ciklus) milyen hatással vannak a doxiciklinre egérketrecekben lévő vizes palackokban, zöld színű poliszulfon palackokból mintákat gyűjtöttek, és standard, színezetlen poliszulfon palackok (Thoren Caging Systems). A 0. napon doxiciklint tartalmazó vizet állítottunk elő RO vagy savanyított RO víz felhasználásával, a leírtak szerint. Mindegyik oldatot 3 színezett és 3 színtelen üveg között osztottuk el. Mindegyik palackból 1 ml-es mintát vettek, mielőtt azokat ketrecbe helyezték. Ezt követően minden 7-es és 14-es palackból 1 ml-es vízmintát gyűjtöttek a kihelyezés után vagy korábban (ha a víz fogyasztásra alkalmatlanná vált; például penész vagy csapadék volt jelen). A vízmintákat elemzésig –80 ° C-on tároltuk.

A doxiciklin stabilitása a takarmányban őrlés közben és tárolás után.