Kapcsolat a D-vitamin gén polimorfizmusai és a tubuláris citrát kezelése között kalcium nephrolithiasisban

A Klinikai és Kísérleti Orvostudományi Osztályról;

Laboratóriumi Orvostan Tanszék, Federico II University Medical School, Nápoly, Olaszország; és

Klinikai Patológiai Osztály, II. Orvostudományi Kar, Nápolyi Egyetem, Olaszország

Laboratóriumi Orvostan Tanszék, Federico II University Medical School, Nápoly, Olaszország; és

A Klinikai és Kísérleti Orvostudományi Osztályról;

Laboratóriumi Orvostan Tanszék, Federico II University Medical School, Nápoly, Olaszország; és

Klinikai Patológiai Osztály, II. Orvostudományi Kar, Nápolyi Egyetem, Olaszország

Laboratóriumi Orvostan Tanszék, Federico II University Medical School, Nápoly, Olaszország; és

Klinikai és Kísérleti Orvostudományi Osztályról;

Absztrakt

Absztrakt. Mossetti G, Vuotto P, Rendina D, Numis FG, Viceconti R, Giordano F, Cioffi M, Scopacasa F, Nunziata V (Federico II University Medical School, Nápoly, Olaszország). Kapcsolat a D-vitamin gén polimorfizmusai és a tubuláris citrát kezelése között kalcium nephrolithiasisban. J Intern Med 2003; 253: 194–200.

Célkitűzések. A hypocitraturia a kalcium nephrolithiasis kockázati tényezője. Az 1,25 (OH) 2D3 befolyásolja a vese citrát kezelését és fokozza a citraturiát. A tanulmány célja a D-vitamin (VDR) allélváltozat és a vizelet-citrát kiválasztás közötti kapcsolat értékelése visszatérő kőképzőkben (SF).

Tervezés. Eset-kontroll tanulmány.

Tárgyak. Összesen 220 visszatérő kalcium-oxalát SF-beteg és 114 egészséges kontroll (C) alany vett részt e vizsgálatban. Húgyúti fertőzések, hiperparatiroidizmus,> 70 μmol/24 óra cisztinuria, köszvényes diatézis, vese tubuláris acidózis, veseelégtelenség, krónikus hasmenéses állapotok, tiazid-diuretikumok, angiotenzin-konvertáló enzim (ACE) -gátlók, glükokortikoidok vagy ösztrogének fogyasztása.

A szokásos állandó étrendet 7 napig adták. Kiértékelték a 24 órás vizelet-citrát kiválasztást és a szűrt citrát (tubulus) aktív felszívódását. A hypocitraturiát úgy határoztuk meg, hogy a vizelet-citrát kiválasztása kevesebb, mint 1,7 mmol/nap volt. A kőképző betegeket és a C-t BsmI és TaqI VDR allélokra genotipizáljuk. Kontingencia táblázat chi-square teszteket használtak a genotípus gyakoriságának összehasonlítására hypocitraturic SF-ben, normocitraturic SF-ben és C-ben.

Eredmények. A hypocitraturia előfordulása SF-betegeknél 32,7% volt (200-ból 72). A hipocitraturia ezeknél a betegeknél a normál citrátterhelés túlzott Rcit-értékéből származott. Más eloszlást találtunk (P

Bevezetés

A nephrolithiasis egy multifaktoriális patológia, amely a környezeti hatások, valamint a hormonális és genetikai tényezők közötti kölcsönhatásból ered. A kalcium-oxalát vesekövek kialakulására való hajlam közvetlenül összefügg a vizelet kalcium- és oxalát-koncentrációival, és fordítottan összefügg a magnézium és a citrát koncentrációjával [1-4].

A citrát közvetlenül gátolja a kalcium-oxalát spontán nukleációját. Ezenkívül a kalcium-oxalát és a kalcium-foszfát kristályok növekedésének, agglomerációjának és aggregációjának hatékony gátlója, amely a hypocitraturia-t a kalcium nephrolithiasis lehetséges okozójává teszi [2].

Ezek a megállapítások arra késztettek minket, hogy vizsgáljuk meg a VDR szerepét mint a hipocitraturia iránti érzékenység jelölt génjét visszatérő kőképző (SF) betegeknél.

Tantárgyak és módszerek

Tárgyak

220 visszatérő SF beteget (92 nő és 128 férfi; átlagéletkor 41,09 ± 14 év; BMI 26,51 ± 4,74 kg m −2) vettünk fel 2000 januárja és 2001 szeptembere között. Minden beteg arról számolt be, hogy két vagy több kalcium-oxalát kő ürült ki, ill. az elmúlt 4 évben eltávolították. Ugyanakkor 114, egymással nem összefüggő kontrollalanyot, ismert nephrolithiasis kórelőzmény nélkül (51 nő és 63 férfi; átlagéletkor 40,37 ± 14,07 év; BMI 26,35 ± 3,81 kg m −2) vettek fel a Nápolyi Orvostudományi Kar tagjaiból, családi referencia panel (családonként egy) és a betegek házastársai.

A betegek és a kontrollok kizárási kritériumai a következők voltak: húgyúti fertőzések, primer vagy szekunder hiperparatireózis, cystinuria> 70 μmol/24 óra, köszvényes diatézis, vese tubuláris acidózis (vizelet pH-ja> 6 és/vagy pozitív vizelet nettó töltete (UNC)), Smulders és munkatársai szerint [10]), a kreatinin-clearance −1 m −2 és −1 m −2 a nők, illetve a férfiak esetében, krónikus hasmenéses állapotok, tiazid diuretikumok, angiotenzin konvertáló enzim (ACE) bevitele - gátlók, glükokortikoidok vagy ösztrogének. A kontroll alanyok felvételének további kizárási kritériuma a nefrolithiasis egy vagy több metabolikus kockázati tényezőjének jelenléte volt, az utólagosan kitett diagnosztikai kritériumok szerint. A vizsgált populációkban nem voltak posztmenopauzás vagy terhes nők. A betegek és a kontrollalanyok Campania-ban, Olaszország déli részén születtek és élnek. A tanulmányt a nápolyi „Federico II” Egyetem Orvostudományi Etikai Bizottsága hagyta jóvá.

Mód

Valamennyi alanyot állandó metabolikus étrenden tartottunk napi 1000 mg kalcium, 100 mEq nátrium, 900 mg foszfor, 300 mg szénhidrát és 70 g fehérje (összesen 2200 kalória) összetétel mellett 7 napig. A 8. napon, 09:00 órakor, az éhomi vizeletmintát 3 órával az elsődleges üreg után vettük, és meghatároztuk annak pH-ját. Huszonnégy órás vizeletmintákat gyűjtöttünk, és elemeztük kalcium (uCa), magnézium (uMg), foszfát (uPO4), nátrium (uNa), kálium (uK), klorid (uCl), citrát (uCit), kreatinin (uCrea) szempontjából. ), oxalát (uOx), urát (uUr) és cisztin (uCys) koncentrációk. Böjt vénás vérmintákat vettünk a szérum ionizált kalcium (sCa), az összes kalcium (tCa), a magnézium (sMg), a foszfát (sPO4), a klorid (sCl), a nátrium (sNa), a kálium (sK), a parathormon meghatározására is. (PTH), 25-hidroxi-kolekalciferol [25 (OH) D3], 1,25-dihidroxi-kolekalciferol [1,25 (OH) 2D3], citrát (sCit), urát (sUr) és kreatinin (sCrea) szintek.

A citrát tubuláris visszaszívódását (rCit) rCit = 100 × 1 - [(sCrea) × (uCit)]/[(uCrea) × (sCit)] számítottuk ki Rudman és munkatársai szerint [11]. Az UNC-t az UNC = uNa + uK - uCl [10].

A tCa, uCa, uMg és sMg értékeket atomabszorpciós spektrofotometriával határoztuk meg. Az sCa-t ionszelektív elektród segítségével határoztuk meg. A szérum és a vizelet citrátszintjét (sCit és uCit) citromsav UV-módszerrel határoztuk meg (Boehringer, Mannheim, Németország). A PTH szérumszinteket immunometrikus vizsgálattal (Immulite intact PTH; Diagnostic Products Corporation, Los Angeles, CA, USA) mértük. A 25 (OH) D3 szérumszinteket egy módosított kompetitív fehérje-kötési vizsgálattal (D3-vitamin szkrínelés; Buhlmann Laboratories AG; Allschwill, Svájc) becsültük. Az 1,25 (OH) 2D3 szérumszintet RIA teszttel becsültük meg (Nichols Institute Diagnostics, San Juan, Kalifornia, USA). A cisztin vizeletszintjét nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával becsültük meg. Az oxalát vizeletszintjét ionkromatográfia segítségével becsültük meg. Az uNa és az uK értékét lángfotometriával becsültük meg. Egyéb vér- és vizeletparamétereket Hitachi 747 automatikus analizátorral kaptunk. Minden paramétert a gyártó utasításainak megfelelően mértünk.

Diagnosztikai kritériumok

A hipocitraturiát a vizelet citrátjának kiválasztódásaként definiáljuk −1 [2]; hiperkalciuria vizelettel történő teljes kalciumkiválasztásként> 7,5 mmol nap –1 férfiaknál,> 6 mmol nap –1 nőknél vagy> 0,1 mmol kg –1 nap -1, 1000 mg/nap kalciumtartalmú étrenden [1]; hiperoxaluria vizelettel történő oxalát kiválasztásként> 444 μmol nap −1 [2]; hyperuricuria vizeletürítéssel> 4,8 mmol −1 férfiaknál és> 4,5 mmol −1 nőknél [1] és hipomagnéziuria vizelet magnézium kiválasztásként −1 [2].

DNS-vizsgálatok

A genomi DNS-t a perifériás vérmintákból Miller és munkatársai által leírt „sózási” eljárással extrahálták [12]. A VDR gén polimorfizmusainak genotípusos elemzését polimeráz láncreakció (PCR) amplifikációval és a termékek enzimatikus emésztésével határoztuk meg Bsmén és TaqI. A Bsmén és TaqA polimorfizmusok 5'CAACCAAGACTACAAGTACCGCGTCAGTGA3 'voltak [13]. A BsmI polimorfizmus reverz primerje 5'AACCAGCGGGAAGAGGTCAAGGG3 '[14] volt. A TaqI polimorfizmus reverz primerje a következő volt: 5′CACTTCGAGCACAAGGGGCGTTAGC3 ′ [13].

A PCR-t Techne Progene Thermal Cycler-rel (Techne, Cambridge, Egyesült Királyság) végeztük standard körülmények között, 30 ciklus alatt, 65 ° C-os hőkezelési hőmérsékleten. A DNS-t BsmI-vel és TaqI-vel emésztettük standard körülmények között; a termékeket elektroforézissel elemeztük etidium-bromidot tartalmazó agarózgélen. A genotípusokat „T” és „B” (a restrikciós hely hiányában) vagy „t” és „b” (a restrikciós hely jelenlétében) definiálta. Az összes beteget és az egészséges kontroll alanyokat genotipizáltuk.

Statisztikai analízis

Minden adatot átlag ± standard deviációval (SD) fejezünk ki. A statisztikai elemzést egy SPSS statisztikai csomaggal, 9.0 verzióval végeztük. A VDR genotípus gyakoriságainak és más kvalitatív adatoknak az összehasonlítására kontingenciatáblázat chi-square teszteket használtak. anova tesztet alkalmaztunk a kvantitatív adatok összehasonlítására. A haplotípus frekvenciák becsléséhez az Estimated Haplotype (EH) számítógépes programot (Linkage Program 5.1 verzió) használtuk [15]. Minden statisztikai teszt kétoldalas volt. A statisztikai szignifikanciát a következők szerint határoztuk meg P

Eredmények

A korábban leírt diagnosztikai kritériumok szerint a metabolikus kockázati tényezők prevalenciáját a visszatérő SF-betegeknél az 1. táblázatban közöljük. 75 SF-betegnek (34,1%) egyetlen dokumentált metabolikus kockázati tényezője volt.

Betegek (%) M: F arány Életkor a (évek) BMI a (kg m −2)

Hypocitraturia b	72 (32,7)	45: 27	40,87 ± 14,95	26,42 ± 3,88
Hypercalciuria c	108. (49.1.)	64: 44	41,52 ± 13,68	26,87 ± 4,01
Hyperoxaluria d	35 (15.9)	22: 13	40,25 ± 13,92	26,51 ± 3,77
Hyperuricuria e	45 (20.5)	37: 8	42,32 ± 14,77	27,17 ± 4,21
Hypomagnesiuria f	21. (9.5)	11: 10	40,57 ± 13,97	26,68 ± 4,09
Nincs anyagcserezavar	12 (5,5)	6: 6	39,98 ± 15,08	25,98 ± 5,01

a megadott értékek átlagok
± ± SD.
b Citraturia - 1 .
c Calciuria> 7,5 mmol nap - 1 férfiaknál,> 6 mmol nap - 1 nőnél vagy> 0,1 mmol kg - 1 nap - 1 .
d Oxalaturia> 444 μmol nap - 1 .
e Uricuria> 4,8 mmol nap −1 férfiaknál és> 4,5 mmol nap −1 nőknél.
f Magnesiuria −1 .

A hipocitraturikus kőképző (Hc) betegek között 26 hypercalciuriás (36,1%), 18 hyperuricuriás (20,8%), 13 hyperoxaluriás (18,1%) és kilenc hypomagnesiuria (12,5%) beteget találtunk. Kilenc SF-betegnél (12,5%) hypocitraturia volt az egyetlen metabolikus rizikófaktor a kalcium nephrolithiasisban.

A Hc-betegek, normocitraturikus kőképző betegek (Nc) és egészséges kontroll alanyok (C) szérum- és vizeletparamétereit a 2., illetve a 3. táblázat mutatja be. A vizelettel történő 24 órás kalcium kiválasztás Hc és Nc betegeknél (6,60 ± 2,51 és 6,21 ± 1,72 mmol/24 óra, Hc és Nc esetén) szignifikánsan magasabb volt, mint a C-ben (4,34 ± 1,61 mmol/24 óra). A citrát, a PTH, a 25OHD3 és az 1,25 (OH) 2D3 szérumszintjei nem különböztek szignifikánsan a három vizsgált csoport között. Ennek ellenére a Hc betegek szignifikánsan magasabbak voltak (P 2. táblázat: Hypocitraturicus kőt alkotó betegek, normocitraturicus kőt alkotó betegek és kontroll alanyok klinikai jellemzői

Kőalkotó betegek Hypocitraturic Normocitraturic Controls

Életkor (év)	40,87 ± 14,95	41,21 ± 13,58	40,37 ± 14,07
BMI (kg m −2)	26,42 ± 3,88	26,56 ± 5,09	26,35 ± 3,81
M: F arány	45: 27	83: 65	63: 51
Összes Ca (mmol L -1)	2,37 ± 0,12	2,36 ± 0,10	2,37 ± 0,11
Ionizált Ca 2+ (mmol L -1)	1,25 ± 0,06	1,24 ± 0,05	1,24 ± 0,06
Mg (mmol L -1)	0,98 ± 0,09	0,99 ± 0,11	0,99 ± 0,10
PO4 (nmol L-1)	1,14 ± 0,19	1,11 ± 0,20	1,11 ± 0,19
Cl (mmol L -1)	106,2 ± 2,6	106,1 ± 3,0	106 ± 2,5
Na (mmol L -1)	139,7 ± 2,1	139,8 ± 2,2	139,8 ± 2,3
K (mmol L -1)	4,29 ± 0,39	4,30 ± 0,40	4,26 ± 0,35
PTH (pmol L −1)	4,22 ± 1,95	4,25 ± 2,04	4,20 ± 1,83
25 (OH) D3 (nmol L-1)	73,73 ± 19,59	72,95 ± 19,81	81,38 ± 19,76
1,25 (OH) 2D3 (pmol L-1)	91,25 ± 14,7	89,86 ± 21,4	100,81 ± 13,2
Citrát (mmol L -1)	0,28 ± 0,17	0,29 ± 0,14	0,30 ± 0,16
Urát (mmol L -1)	0,27 ± 0,06	0,27 ± 0,07	0,28 ± 0,07

Kőképző betegek Hypocitraturic Normocitraturic Controls

Ca (mmol/24 óra)	6,60 ± 2,51 a	6,21 ± 1,72 a	4,34 ± 1,61
Mg (mmol/24 óra)	3,78 ± 1,93	3,76 ± 1,28	3,80 ± 1,41
PO4 (mmol/24 óra)	22,8 ± 9,3	23,8 ± 8,1	23,6 ± 8,5
Citrát (mmol/24 óra)	1,15 ± 0,24 b	3,01 ± 0,95	2,74 ± 0,98
TR Cit (%)	95,36 ± 2,92 b	91,45 ± 4,02	90,04 ± 5,03
Oxalát (μmol/24 óra)	335,4 ± 249,9	326,9 ± 180,9	274,1 ± 95,4
Urát (mmol/24 óra)	2,81 ± 1,12	2,79 ± 0,88	2,75 ± 1,04

A megadott értékek átlagok ± SD.
a Jelentősen különbözik a kontroll alanyoktól (P b Jelentősen eltér a normocitraturikus kőképző betegektől és a kontrollalP 4. táblázat: A D-vitamin-genotípusok elterjedtsége hipocitraturikus kőképző betegeknél, normocitraturikus kőképző betegeknél és kontroll alanyoknál

Kőképző betegek Hypocitraturic Normocitraturic Controls P-Értékek

BsmI
BB (%)	8. (11.12)	46 (31.08)	38 (33.33)	0,05).

A b allél gyakorisága szignifikánsan magasabb volt a Hc betegeknél az Nc betegeknél és a C esetén (69,4, 46,6 és 46,5%; P 16]. A BsmI és TaqI VDR genotípusok megoszlása és a kapcsolódó VDR allélek prevalenciája kilenc olyan Hc betegnél, akiknél hipocitraturia volt az egyetlen metabolikus rendellenesség, nem különbözött szignifikánsan a metabolikus rendellenességek kombinációival kombinált 63 Hc betegnél megfigyeltektől (az adatokat nem közöltük).

Vita

A BsmI és TaqI polimorfizmusok a VDR gén vége közelében vagy 3 'átírhatatlan régióban helyezkednek el. Feltételezik, hogy ezen a területen az allélvariáció felelős a transzlációs hatékonyság vagy a messenger RNS-stabilitás különbségéért, ami változásokat eredményez a VDR expressziójában [13, 40]. A VDR expressziójának és/vagy funkciójának finom eltérései hozzájárulhatnak a többi célgén szabályozásának jelentős különbségeihez [40]. Ezenkívül a VDR gén mutációi szelektíven és specifikusan megváltoztatják a VDR szubcelluláris eloszlását [41].

Az 1,25 (OH) 2D3/VDR rendszer képes szabályozni számos gén expresszióját, amelyek rengeteg biológiai hatásban vesznek részt. Valójában az irodalomban dokumentálták, hogy a VDR genotípusok összefüggenek a csont ásványi sűrűségével, az elsődleges és másodlagos hiperparatireoidizmusra és a 2-es típusú cukorbetegségre való hajlammal, a prosztata és az emlő karcinóma előfordulási gyakoriságával, valamint a D-vitamin és a biszfoszfonát terápiára adott válaszokkal [ 7, 40, 42–44].

Másrészt a VDR és az idiopátiás hypocitraturia közötti genetikai asszociáció a kalcium-oxalátot visszatérő SF-betegeknél szintén tükrözheti a BsmI és TaqI VDR polimorfizmusok kapcsolódását a VDR-lokusz közeli génjével, amely a vese-citrát kezelésében vesz részt. Ezek a megállapítások indokolttá teszik a TaqI és BsmI VDR polimorfizmusok további vizsgálatát, valamint annak kapcsolatát a citrát vesekezeléssel kalcium nephrolithiasisban. Összefoglalva, a VDR génpolimorfizmusok és a citrát kiválasztás közötti összefüggést a nephrolithiasis elősegítő metabolikus és genetikai tényezők közötti kapcsolatok komplex puzzle-jának további részének tekinthetjük.