A Francisella komplex aminosav-diétája fertőzött makrofágokban

Monique Barel

1 Université Paris Descartes, Sorbonne Paris Cité, Párizs, Franciaország

2 INSERM U1151 - National National de la Recherche Scientifique UMR 8253, Institut Necker-Enfants Malades, Párizs, Franciaország

Elodie Ramond

1 Université Paris Descartes, Sorbonne Paris Cité, Párizs, Franciaország

2 INSERM U1151 - National National de la Recherche Scientifique UMR 8253, Institut Necker-Enfants Malades, Párizs, Franciaország

Gael Gesbert

1 Université Paris Descartes, Sorbonne Paris Cité, Párizs, Franciaország

2 INSERM U1151 - National National de la Recherche Scientifique UMR 8253, Institut Necker-Enfants Malades, Párizs, Franciaország

Alain Charbit

1 Université Paris Descartes, Sorbonne Paris Cité, Párizs, Franciaország

2 INSERM U1151 - National National de la Recherche Scientifique UMR 8253, Institut Necker-Enfants Malades, Párizs, Franciaország

Absztrakt

Bevezetés

A Francisella tularensis egy kicsi Gram-negatív bacillus, aerob, nem spóraképző és nem mozgékony. Ez a fakultatív intracelluláris kórokozó számos állatfajban a tuloonemia zoonózis-kórokozója. Ez a rendkívül fertőző bakteriális kórokozó számos módon átvihető az emberre (Sjostedt, 2011), beleértve a beteg állatokkal való közvetlen érintkezést, a belélegzést, a szennyezett víz vagy étel elfogyasztását, vagy a kullancsok, szúnyogok vagy legyek harapását. A F. tularensis négy különböző alfaja (alfaja) létezik, amelyek virulenciájában és földrajzi eloszlásában különböznek egymástól. tularensis, holarctica, mediasiatica és novicida. A legtöbb virulens tularensis alfajt a potenciális A osztályú ágensnek tekinti a bioterrorizmusban az Egyesült Államok Centers for Disease Control (CDC) (Oyston et al., 2004; Keim et al., 2007). F. tularensis subsp. a novicida (F. novicida) ritkán patogén a nem immunhiányos emberekre, de egereknél teljesen virulens, ezért széles körben használják modellként a Francisella intracelluláris parazitizmus vizsgálatára.

A F. novicida képes elkerülni a gazdaszervezet védekezését, és nagy számban képes szaporodni az eukarióta sejtek citoszoljában (Jones és mtsai, 2012). A baktérium képes sokféle sejt belsejében szaporodni, különösen a makrofágokban. A phagosomális rekesz átmeneti áthaladása után a baktériumok 30–60 percen belül felszabadulnak a gazdasejt citoszoljában, ahol több aktív replikációs körön mennek keresztül (Celli és Zahrt, 2013). A genom legalább 20% -a részt vesz bizonyos mértékben a Francisella virulenciában (Meibom és Charbit, 2010b), beleértve az anyagcsere és a táplálkozási funkciókkal kapcsolatos gének jelentős hányadát. A táplálkozás és a Francisella in vivo életciklusa közötti kapcsolat megértése azonban még mindig kevéssé ismert.

Az előrejelzések szerint a Francisella számos tápanyagfelvevő rendszerrel rendelkezik a szükséges gazdaszervezetből származó tápanyagok befogására, amelyek közül néhány valószínűleg korlátozó koncentrációban áll rendelkezésre. Itt áttekintjük a két Francisella aminosav megszerző rendszerrel kapcsolatos legújabb megállapításokat, valamint azok fontosságát a Francisella fiziológiájában és intracelluláris életciklusában. Megbeszéljük továbbá a Francisel-fertőzés által kiváltott, a mai napig azonosított főbb válaszokat, amelyek hozzájárulnak a citoszolos rekesz táplálásához.

A Francisella aminosav transzporterek kritikus szerepet játszanak az intracelluláris szaporodásban

Korábban kimutattuk, hogy Francisella a ciszteintartalmú tripeptid glutationt (GSH) használta cisztein forrásaként a fertőzött makrofágok replikációjához (Alkhuder et al., 2009), ezzel arra utalva, hogy ez a baktérium a GSH természetes bőségének kiaknázásával fejlődött ki. a gazdasejtben citoszolban, hogy kompenzálja a cisztein természetes auxotrófiáját. Újabban úgy döntöttünk, hogy értékeljük az aminosav-transzport rendszerek szerepét a Francisella intracelluláris fejlődésének képességében.

Az alábbiakban a GadC-ről és az AnsP-ről nemrégiben szerzett adatokat fogjuk megvitatni, két másodlagos transzporter transzporter kifejezetten részt vesz a fagosomális szökésben és a citoszolos szaporodásban.

Az APC családtagjai

A F. tularensis genomok az aminosav-poliamin-organokáció (APC) szupercsalád-transzporterek 11 előre jelzett tagját kódolják, amelyek kifejezetten részt vesznek az aminosavakban ionmentes ioncserében. Figyelemre méltó, hogy a 11 APC-tag közül 8-at legalább egyszer azonosítottak a korábbi genetikai vizsgálatokban (in vitro vagy in vivo). Egyikük, a glutamát transzporter GadC funkcionális szerepét laboratóriumunkban tisztázták (Ramond et al., 2014), és igazolták annak alapvető hozzájárulását a Francisella fagosomális meneküléshez.

A glutamát felvétele kritikus a phagosomában

Az MFS szállítmányozók

Az MFS család jelentőségét az intracelluláris baktériumok virulenciájában először a Legionella pneumophila esetében mutatták ki. Valóban, egy treonin transzportert (Phagoma Transporter A esetében PhtA-nak neveznek) úgy találták, hogy nem képes a makrofágokban replikatív formába differenciálódni, és a transzmisszív formához vezető tényezők korai szakaszát fejezi ki a táptalajban (Sauer et al., 2005) . Az L. pneumophila genom 10 további PhtA paralogust kódol (Sauer et al., 2005), amelyekre némelyik szintén szükséges az intracelluláris replikáció során (Fonseca és Swanson, 2014). A valin megszerzéséhez PhtJ szükséges, a PhtC és a PhtD pedig nemrégiben kimutatták, hogy hozzájárulnak az L. pneumophila védelméhez a dTMP éhezéstől (Fonseca és mtsai, 2014).

Meglepő módon a Pht-transzporterek az MFS-transzporterek egy alcsoportját alkotják, amelyek kizárólag intracelluláris kórokozókban és különösen az alfa- és gamma-proteobaktériumokban találhatók meg (ideértve az L. pneumophila, Coxiella burnetii, Rickettsiella grylli, Francisella tularensis, Wolbachia, Anaplasma, Ehrlichia, Protochlamidia amooco marinus és Zymomonas mobilis (Chen et al., 2008).

Ez arra késztetett minket, hogy kiemelten foglalkozzunk a Pht alcsaládtagok szerepével a Francisella patogenezisben. A Francisella-ban azonosított hat Pht-transzporter nagyon konzervált a különböző altípusokban (> 95% aminosav-azonosság). Ezekről a transzporterekről kiderült, hogy hozzájárulnak az F. tularensis virulenciához (Qin és Mann, 2006; Weiss et al., 2007; Kraemer et al., 2009; Asare és Abu Kwaik, 2010; Asare és Kwaik, 2010; Moule et al., 2010; Peng és Monack, 2010; Llewellyn et al., 2011).

A F. tularensis két Pht transzporterének funkcionális szerepét laboratóriumunkban nemrégiben tisztázták (Gesbert et al., 2014, 2015). Az alábbiakban az egyikre, az aszparagin transzporterre, az AnsP-re koncentrálunk, amely kizárólag a kórokozó citoszolos szaporodásához járul hozzá.

Az aszparaginfelvétel kritikus a citoszolos szaporodás szempontjából

Az ansP gén inaktiválása F. tularensis subsp tularensis SCHU S4, F. tularensis subsp holarctica LVS vagy F. tularensis subsp novicida U112-ben az intracelluláris szaporodás csökkenését okozza különböző sejtmodellekben, például HepG2 humán hepatocytákban, elsődleges egér makrofágokban és egér makrofágokban. J774 (Qin és Mann, 2006; Marohn és mtsai, 2012; Gesbert és mtsai, 2014). In vivo az ansP gén inaktiválása a F. tularensis subsp novicida U112 virulenciájának jelentős csökkenését okozza Drosophilában (Asare és Abu Kwaik, 2010); és F. tularensis subsp holarctica LVS BALB/c egerekben (Marohn et al., 2012).

Valószínű, hogy az MFS és az APC családok más tagjai (és esetleg más családok), amelyeket még nem fedeztek fel, részt vehetnek a Francisella intracelluláris életciklusában (ábra (1. ábra).

Az aminosav felhasználása intracelluláris Francisella segítségével. (A) A makrofágokba kerülve Francisella átmenetileg egy fagosomális rekeszben tartózkodik. Ebben a rekeszben a GadC glutamát-permeáz segíti a baktériumot abban, hogy ellenálljon a NADPH-oxidáz által generált oxidatív stressznek. Ez a transzporter kritikusan szükséges a megfelelő bakteriális fagosomális meneküléshez. Ezzel egyidejűleg az SLC1A5 gazdasejtes semleges aminosav transzporter szintézise gyorsan fel van szabályozva, ami elősegíti az aminosavak bejutását a fertőzött gazdasejtbe. (B) A gazda citoszoljában a baktériumok megkezdik aktív replikációjukat, ezért számos további gazdaszervezetből származó tápanyag ellátására van szükségük. Az AnsP permeáz hozzájárul a baktériumok szaporodásához azáltal, hogy aszparagint biztosít a fehérjeszintézishez. Az ATG-5-független autofágia hozzájárul az aminosavak bejuttatásához, gazdagítja a citoszolos baktériumok étrendjét. Mindkét szakaszban más aminosav transzporterek hozzájárulnak a baktérium megfelelő táplálásához.

Gazdaszármazékú aminosavforrások

A korábban biztonságos tápanyag-utánpótlásnak tekintett gazda-citoszol (Ray és mtsai., 2009) mára életveszélyes tápanyaghiányos környezetté vált a behatoló baktériumok számára (Abu Kwaik és Bumann, 2013). Állandó háború zajlik a befogadó és a kórokozó között. Valójában az intracelluláris kórokozók megpróbálják megvonni a tápanyagokat a gazdájuktól, míg a gazdasejt megpróbálja a tápanyagtól megfosztani a behatoló baktériumokat. Ezt a jelenséget általában „táplálkozási immunitásnak” nevezik (Barel és Charbit, 2013).

Host aminosav transzporterek

Az SLC1A5 eukarióta glutamin transzporter bevonását nemrégiben írták le az F. tularensis LVS fertőzés során (Barel et al., 2012). A F. tularensis LVS mind a mRNS, mind a fehérje szintjén indukálja ennek a transzporternek a szabályozását. Ezenkívül a baktériumfertőzés indukálja ezen aminosav transzporter deglikozilezését. Ez a deglikozilezési folyamat a fertőzés időtartamával növekszik, és összefüggésben van az SLC1A5 expresszió növekedésével. Az IglC mutáns, amely nem lép ki a fagosómából és nem mulipulálódik a citoszolban, nem indukálja ezt a deglikozilezést. Ezért ezt a deglikozilezést csak olyan baktériumok indukálják, amelyek képesek elkerülni a fagosómát és szaporodni a citoszolba.

Ugyanakkor az SLC7A5 mRNS és a fehérje expressziója alacsonyan szabályozott. Az SLC7A5 az SLC1A5 partnere, mivel együtt dolgoznak a citoplazmatikus aminosav-készlet (Fuchs és Bode, 2005), és különösen a glutamin (Gln) egyensúlyának kiegyenlítésén. Az F. tularensis LVS fertőzés differenciális hatása az SLC1A5/SLC7A5 expressziójára ezért a glutamin intracelluláris koncentrációjának növekedését indukálhatja. Ez a tápanyag fontos szerepet játszik a génexpresszió, a fehérjeforgalom, az antioxidáns funkció, a tápanyagcsere, az immunitás és a sav-bázis egyensúly szabályozásában. A glutamin emberi sejtek általi felhasználását a Francisella fertőzés szabályozására még tanulmányozni kell. Megállapítottuk (Barel és Charbit, 2013), hogy a glutamin hozzáadása növelte az F. tularensis LVS képességét, hogy szaporodjon a fertőzött THP-1 sejtek citoszoljában. Noha a „nem esszenciális” kategóriába sorolják, a glutamin elengedhetetlennek tűnik a szövetkultúrában fenntartott sejtek életképességéhez és növekedéséhez azáltal, hogy metabolikus prekurzorként szolgál számos bioszintetikus úton, vagy közvetlenül a fehérjeszintézishez (Neu et al., 1996). A Helicobacter bilis γ-glutamil-transzpeptidáz által közvetített glutamin-nélkülözésről kiderült, hogy felelős a hámsejtek gyulladásos rendellenességeinek kiváltásáért (Javed et al., 2013).

Megjegyzendő, hogy az SLC1A5 gént az inzulin aktiválja az SGK1, SGK3 és PKB kináz aktiváció révén, ami serkenti az aminosav felszívódását (Palmada et al., 2005). Jó párkapcsolatban valóban azt tapasztaltuk, hogy az inzulin hozzáadása szintén növeli az F. tularensis LVS intracelluláris szaporodását (Barel és mtsai, 2012). A glutamin átalakulhat glutamáttá, amely viszont akár a baktériumok, akár az emberi sejtek által felhasználható metabolikus előnyök biztosítására és a Francisella-fertőzés megelőzésére. Mint fentebb tárgyaltuk, a Francisella (GadC) glutamát-transzportere kritikusnak bizonyult az oxidatív stressz elleni védekezés szempontjából a fagosomában (Ramond et al., 2014).

Úgy tűnik, hogy az SLC1A5 deglikozilezése általános mechanizmus, amelyet F. tularensis fertőzés indukál, mivel egy másik erősen glikozilezett fehérje (CD147) deglikozilezését is megfigyelték. Az intracelluláris Francisella által kiváltott fehérje deglikoziláció ezért tápanyagforrásként is szolgálhat. Az előállított glikán olyan hálózatokban szolgálhat, amelyek szabályozzák a sejtek részvételét az intracelluláris baktériumok túlélése érdekében.

Autofágia

Nemrégiben kimutatták, hogy az autofágia útjának felhasználása a baktériumok adaptációjának másik mechanizmusát képezi, hozzájárulva az intracelluláris Francisella túléléséhez és táplálkozásához (Steele és mtsai, 2013). Érdekes módon Kawula és munkatársa megállapította, hogy az intracelluláris F. tularensis subsp tularensis SCHU S4 az ATG5-től független autofágiára támaszkodott a szaporodáshoz. A felesleges piruvát vagy aminosavak ellátása elnyomta az autofágiahiányos sejtek baktériumnövekedési hibáját, ami arra utal, hogy ennek a folyamatnak közvetlen szerepe van az aminosav ellátásában. A F. tularensis subsp holarctica LVS intracelluláris növekedése azonban jelentősen károsodott az ATG5 -/- makrofágokban. Ezért valószínű, hogy ez az alfaj mind az ATG5-től függő, mind az ATG5-től független autofágia-folyamatokat felhasználhatja a hatékony intracelluláris növekedés támogatására. Összességében ezek az adatok azt mutatják, hogy a vad típusú intracelluláris F. tularensis általában elkerüli a klasszikus autofagosómák által történő elnyelődést, de autofágia felhasználásával elősegítheti a citoszolos baktériumok aminosavval történő replikációját. Lehetséges, hogy ez a folyamat más tápanyagokat juttat az intracelluláris baktériumokhoz (például szénhidrátok vagy lipidek).

Ez a fertőzéskor kiváltott két gazdaszervezet az intracelluláris Francisella azon képességét tükrözi, hogy az eukarióta mechanizmust felhasználhatja aminosavak és glikán-maradékok előállítására, ami a saját túlélésére szolgálhat.

Záró megjegyzések

Megmutattuk, hogy két aszparagin és glutamát felvételében részt vevő Francisella transzporter fontos szerepet játszott a baktériumok intracelluláris életciklusában. Figyelemre méltó, hogy ez a két aminosav két nem esszenciális aminosav, ami azt jelenti, hogy a húsleves prototrófiája nem feltétlenül jósolja meg a függetlenséget a gazda aminosav-forrásokkal szemben a fertőzés során. Az emlős kórokozók jósolt tápanyag-felhasználásának és bioszintetikus útvonalainak összehasonlítása alátámasztja azt az elképzelést, hogy a legtöbb kórokozó képes több nitrogén- és szénforrás egyidejű hasznosítására (Abu Kwaik és Bumann, 2013; Steeb és mtsai, 2013). Folyamatban lévő vizsgálataink azt mutatják, hogy a Francisella számos más gazdaszervezetből származó aminosavforrásra támaszkodik a fertőzött makrofágok belsejében történő szaporodáshoz (Gesbert et al., 2015, nem publikált).

Összeférhetetlenségi nyilatkozat

A szerzők kijelentik, hogy a kutatást bármilyen kereskedelmi vagy pénzügyi kapcsolat hiányában végezték, amely potenciális összeférhetetlenségként értelmezhető.

Köszönetnyilvánítás

Ezeket a tanulmányokat az INSERM, a CNRS és az Université Paris Descartes Paris Cité Sorbonne támogatta. Gael Gesbertet a „Délégation Générale à l'Armement” (DGA) ösztöndíja és Elodie Ramond finanszírozta a „Région Ile de France” ösztöndíjával.