Határok az endokrinológiában

Klinikai cukorbetegség

Szerkesztette
Gaetano Santulli

Columbia Egyetem, Egyesült Államok

Felülvizsgálta
Maria Felice Brizzi

Torinói Egyetem, Olaszország

Eija K. Laakkonen

Jyväskylä Egyetem, Finnország

A szerkesztő és a lektorok kapcsolatai a legfrissebbek a Loop kutatási profiljukban, és nem feltétlenül tükrözik a felülvizsgálat idején fennálló helyzetüket.

cukorbetegsége

  • Cikk letöltése
    • PDF letöltése
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Kiegészítő
      Anyag
  • Exportálás
    • EndNote
    • Referencia menedzser
    • Egyszerű TEXT fájl
    • BibTex
OSZD MEG

Eredeti kutatás CIKK

  • 1 Fiziológiai és Biofizikai Tanszék, Orvosbiológiai Intézet, São Paulo Egyetem, São Paulo, Brazília
  • 2 Instituto de Medicina Molecular, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, Lisszabon, Portugália

A 2. oldott hordozócsalád, az elősegített 4. glükóz transzporter tag (GLUT4) és a hexokináz-2 (HK2) csökkent expressziója a vázizomzatban részt vesz a diabetes mellitus (DM) inzulinrezisztenciájában. A mikroRNS-ek (miRNS-ek) az mRNS/fehérje expresszió fontos modulátoraként jelentek meg, de szerepük a DM-ben nem világos. Megvizsgáltuk a miRNS-eket, amelyek hipotetikusan részt vesznek a GLUT4/HK2 expressziójában az 1-es típusú cukorbetegség-szerű patkányok egyetlen izomában. In silico az elemzés 651 miRNS-t mutatott ki, amelyekre a jelek szerint szabályozódnak oldott anyag hordozó család 2. tagja 4 (Slc2a4) mRNS, közülük többen is szabályozásra számítottak Hk2 mRNS-t és 16 miRNS-t választottunk ki a mennyiségi meghatározáshoz. A cukorbetegség csökkent Slc2a4/ GLUT4 és Hk2/ HK2 expresszió (50–77%), a miR-29b-3p és a miR-29c-3p szabályozása (50–100%), és a miR-93-5p, miR-150-5p, miR-199a-5p, miR szabályozása -345-3p és miR-532-3p (

30%) expresszió. Emellett a GLUT4 és a HK2 fehérjék korreláltak (P ®, Cristália, Itapira, SP, Brazília). Tizenhárom nappal később az állatokat lemértük, és 24 órán át metabolikus ketrecekben tartottuk a vizelet térfogatának, a glycosuria és a glycaemia értékelésére; ezeket a változókat használtuk fel a cukorbetegség állapotának megerősítésére és a három kísérleti csoport kialakítására: nem cukorbetegek (ND), 0,9% NaCl-val injekcióval bevitt cukorbetegek (D) és NPH inzulinnal (ID) kezelt cukorbetegek. Az inzulinkezelést naponta kétszer hajtották végre (2 U 8:00 órakor és 4 U 17:00 órakor; Humulin®, Eli Lilly and Company, Indianapolis); és a placebót egyidejűleg injektálták. A kezeléseket 7 napig folytattuk, összesen 21 napos cukorbetegséggel.

A kísérleti időszak végén az állatokat ismét metabolikus ketrecekben tartottuk 24 órás vizeletgyűjtés céljából. Ezt követően 8: 00-10: 00 óra között (3-4 órás táplálékhiány után) az állatokat 50 mg/kg nátrium-tiopentallal (Cristália, Itapira, São Paulo, Brazília) altattuk, farokvért gyűjtöttünk glükózért mérést, és a soleus vázizmokat óvatosan összegyűjtöttük, súlyoztuk és -70 ° C-on tároltuk a további elemzés céljából. Ezenkívül laparotómiát hajtottak végre az alsó vena cava vérének összegyűjtésére, hogy plazmát kapjanak a fruktozamin elemzéséhez.

Valamennyi kísérleti eljárást a São Paulo Egyetem Orvosbiológiai Tudományok Intézetének Állatkutatási Etikai Bizottsága hagyta jóvá (157/2012. Jegyzőkönyv), és összhangban vannak a vonatkozó iránymutatásokkal és előírásokkal.

Vérglükóz, 24 órás vizelettel történő glükóz kiválasztás és plazma fruktozamin

A vércukor-koncentrációt glükométerrel (Accu-Check Active Basel, Svájc) mértük. 24 órás vizeletből vett mintát alkalmaztunk a glükózkoncentráció enzimatikus-kolorimetrikus módszerrel történő mérésére (Glicose Liquiform, Labtest Diagnóstico S.A., Lagoa Santa, MG, Brazília); a vizelet térfogatát használtuk a 24 órás glükóz kiválasztás kiszámításához. A plazma fruktozamin-koncentrációt kinetikai-kolorimetriás módszerrel mértük (Frutosamina, Labtest Diagnóstico S.A., Lagoa Santa, MG, Brazília).

Fehérjeelemzés Western Blotting módszerrel

A fehérje expresszió kiértékelését a korábban leírtak szerint végeztük (11, 28). Röviden, a fagyasztott izommintákat szacharóz-pufferben (pH 7,4) (10 mmol/l Tris-HCl, 1 mmol/l EDTA és 250 mmol/l szacharóz) homogenizáltuk, 760 g-on 10 percig 4 ° C-on centrifugáltuk, és a felülúszót teljes sejtfehérje-frakcióként használják. A fehérjekoncentrációt Bradford módszerrel határoztuk meg (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA).

Egyenlő mennyiségű fehérjét (a célfehérje szerint 20–50 μg) elektroforézissel vittünk át, nitrocellulóz membránra vittük, és anti-GLUT4-gyel (1: 3500, EMD Millipore, Billerica, MA, USA, # 07-1404), -HK2 (1: 1000, Cell Signaling Technology, Boston, MA, USA, # 2867S), anti-NFKB1 (1: 1000, Cell Signaling Technology, Boston, MA, USA, # 12540S) vagy anti-RELA (1: 450), Abcam, Cambridge, MA, USA, # 7970). A membránokat megfelelő szekunder konjugált antitesttel inkubáltuk, a gyártó előírásainak megfelelően, és a jelet fokozott kemilumineszcencia eljárással detektáltuk. A blotok optikai sűrűségét denzitometriával (ImageScanner III, GE Healthcare, Uppsala, Svédország) számszerűsítettük, és a Ponceau S festett membránban mért megfelelő sáv denzitometriájával normalizáltuk (29). Az eredményeket tetszőleges egységekben (AU) fejezzük ki μg fehérje esetében, és a kontrollértékek átlagát 100-nak tekintjük.

Gén expressziós elemzés RT-qPCR segítségével

Az mRNS expressziójának értékelését reverz transzkripciós kvantitatív valós idejű polimeráz láncreakcióval (RT-qPCR) végeztük, amint azt korábban leírtuk (30). Röviden, a fagyasztott izommintákból származó teljes RNS-t TRIzol® reagenssel (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) izoláltuk a gyártó specifikációinak megfelelően. Az egyes minták összes RNS-koncentrációját spektrofotometriásan (Epoch, BioTek Instruments, Winooski, VT, USA) számszerűsítettük, és az RNS tisztaságát az A260/A280 arány alapján becsültük meg. Az RNS integritását 18% -os és 28S sávok jelenlétével ellenőriztük ultraibolya fénynek kitett 1% -os denaturáló agaróz gélelektroforézisben (Epi Chemi II Darkroom, UVP BioImaging Systems, Upland, Kalifornia, CA, USA).

Asztal 1. A kvantitatív valós idejű polimeráz láncreakcióhoz (qPCR) használt TaqMan gén expressziós vizsgálatok primereinek és azonosító (ID) kódjainak részletei.

miRNS expressziós elemzés RT-qPCR segítségével

A miRNS expressziójának kiértékelését a korábban leírtak szerint végeztük (32). Röviden, a teljes RNS-mintákat (100 ng) reverz átírással írtuk át TaqMan® MicroRNA Reverse Transcription Kit és a TaqMan® MicroRNA Assay-k (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, USA) specifikus miRNS-primereivel. A szobahőmérséklet körülményei: 30 perc 16 ° C-on, 30 perc 42 ° C-on, 5 perc 85 ° C-on, majd hűtés 4 ° C-on. Az egyes miRNS-ek cDNS-ét TaqMan® 2X Universal PCR Master Mix, No AmpErase® UNG és a célzott miRNS-ek specifikus próbáival (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, USA), StepOne Plus Instrument (Applied Biosystems Inc.) alkalmazásával amplifikáltuk. (Foster City, Kalifornia, USA). A PCR-körülmények között 1 ciklus volt 10 perc 95 ° C-on, és 45 ciklus 15 másodpercig 95 ° C-on és 1 perc 60 ° C-on. A miRNS-ek és referenciagének célszekvenciáit és vizsgálati azonosítóit a 2. táblázatban mutatjuk be. A RefFinder algoritmuselemzés szerint a kiválasztott referenciagén U6 snRNS volt. A 2 −ΔΔ módszereCt elemzésre elfogadták (31).

2. táblázat. A miRNS-ek és referenciagének célszekvenciái és Taqman assay-azonosítói.

In silico A miRNS-ek elemzése a célgének szabályozását jósolja

Az mRNS-eket megcélzó miRNS-ek keresése Slc2a4, Hk2, Nfkb1 és Rela a miRWalk adatbázis 2.0 segítségével, a jósolt és validált miRNS – cél kölcsönhatások átfogó atlaszának felhasználásával (33). Az elemzés a patkány mRNS 3′-UTR régiójára korlátozódott Slc2a4, Hk2 és Rela gének és az emberi NFKB1 gén, mivel nincsenek patkányra utaló adatok Nfkb1 gén a miRWalk adatbázisban. A miRNS-ek hivatalos nómenklatúrája és szekvencia-megjegyzései a „miRBase Sequence Database-Release 21” -en alapulnak.

Statisztikai analízis

Az összes adatot átlag ± standard hiba átlag (SEM) értékben fejeztük ki. Az átlagok összehasonlítását az adateloszlás normalitása szerint (Shapiro-Wilk teszt) egyirányú varianciaanalízissel (ANOVA) vagy Kruskal-Wallis teszttel végeztük, amelyet Bonferroni vagy Dunn követett. post hoc teszt, ill. A fehérjék és a miRNS-ek, illetve a metabolikus változók és a miRNS-ek közötti korrelációt Pearson (r) vagy Spearman (ρ) korrelációs együttható-analízissel végeztük. Az összehasonlításokat statisztikailag szignifikánsnak tekintették a o # P ### P # P ## P # P # P −ΔΔCT Módszer. Mód (2001) 25: 402–8. doi: 10.1006/meth.2001.1262

32. Gerlinger-Romero F, Yonamine CY, Junior DC, Esteves JV, Machado UF. Diszreguláció a TRIM63/FBXO32 expresszió és az egyetlen izomveszteség között cukorbeteg patkányokban: a miR-1-3p, −29a/b-3p és − 133a/b-3p potenciális szerepe. Mol Cell Biochem. (2017) 427: 187–99. doi: 10.1007/s11010-016-2910-z

33. Dweep H, Gretz N. miRWalk2.0: a mikroRNS-cél kölcsönhatások átfogó atlasza. Nat Methods (2015) 12: 697. doi: 10.1038/nmeth.3485

34. He A, Zhu L, Gupta N, Chang Y, Fang F. A diabéteszes patkányokban erősen szabályozott mikro ribonukleinsav 29 túlzott expressziója inzulinrezisztenciához vezet a 3T3-L1 adipocytákban. Mol Endocrinol. (2007) 21: 2785–94. doi: 10.1210/me.2007-0167

35. Massart J, Sjögren RJO, Lundell LS, Mudry JM, Franck N, O'Gorman DJ és mtsai. A megváltozott miR-29 expresszió a 2-es típusú cukorbetegségben befolyásolja a glükóz és a lipid anyagcserét a vázizomzatban. Cukorbetegség (2017) 66: 1807–18. doi: 10.2337/db17-0141

36. Chen YH, Heneidi S, Lee JM, Layman LC, Stepp DW, Gamboa GM és mtsai. A miRNS-93 gátolja a GLUT4-et, és túlzottan expresszálódik policisztás petefészek-szindrómás betegek és inzulinrezisztenciában szenvedő nők zsírszövetében. Cukorbetegség (2013) 62: 2278–86. doi: 10.2337/db12-0963

37. Chavali V., Tyagi SC, Mishra PK. Dicer, miRNS és gyulladásos markerek differenciális expressziója diabéteszes Ins2 +/- Akita szívekben. Cell Biochem Biophys. (2014) 68: 25–35. doi: 10.1007/s12013-013-9679-4

38. Punga T, Le Panse R, Andersson M, Truffault F, Berrih-Aknin S, Punga AR. Keringő miRNS-ek a myasthenia gravisban: miR-150-5p mint új potenciális biomarker. Ann Clin Transl Neurol. (2014) 1: 49–58. doi: 10.1002/acn3.24

39. Yan ST, Li CL, Tian H, Li J, Pei Y, Liu Y és mtsai. A MiR-199a túlzottan expresszálódik a 2-es típusú cukorbetegek plazmájában, ami hozzájárul a 2-es típusú cukorbetegséghez a GLUT4 célzásával. Mol Cell Biochem. (2014) 397: 45–51. doi: 10.1007/s11010-014-2170-8

40. Barsanti C, Trivella MG, D'Aurizio R, El Baroudi M, Baumgart M, Groth M és mtsai. A mikro-RNS-ek differenciális szabályozása a végstádiumban lévő, nem megfelelő szívekben a bal kamrai segédeszköz kirakodásával jár. Biomed Res Int. (2015) 2015: 592512. doi: 10.1155/2015/592512

41. Chen L, Chen Y, Zhang S, Ye L, Cui J, Sun Q és mtsai. A MiR-540 mint új adipogén inhibitor gátolja az adipogenezist a PPARy elnyomásán keresztül. J Cell Biochem. (2015) 116: 969–76. doi: 10.1002/jcb.25050

42. Lee KP, Shin YJ, Panda AC, Abdelmohsen K, Kim JY, Lee SM és mtsai. A miR-431 a Smad4 megcélzásával elősegíti a régi vázizom differenciálódását és regenerálódását. Genes Dev (2015) 29: 1605–17. doi: 10.1101/gad.263574.115

43. Wang JX, Zhang XJ, Feng C, Sun T, Wang K, Wang Y és mtsai. A mikroRNS-532-3p a mitokondriális hasadást szabályozza az apoptózis-represszor célzása révén, kaszpáz-toborzási doménnel doxorubicin kardiotoxicitásban. Cell Death Dis. (2015) 6: e1677. doi: 10.1038/cddis.2015.41

44. Kushwaha P, Khedgikar V, Sharma D, Yuen T, Gautam J, Ahmad N és mtsai. A MicroRNS 874-3p epigenetikusan fejti ki csontváz anabolikus hatásait az elválasztás során a Hdac1 expressziójának elnyomásával. J Biol Chem. (2016) 291: 3959–66. doi: 10.1074/jb.M115.687152

45. Wang KJ, Zhao X, Liu YZ, Zeng QT, Mao XB, Li SN és mtsai. A keringő MiR-19b-3p, MiR-134-5p és MiR-186-5p ígéretes új biomarkerek az akut miokardiális infarktus korai diagnosztizálására. Cell Physiol Biochem. (2016) 38: 1015–29. doi: 10.1159/000443053

46. ​​Zhou T, Zhou T, Meng X, Che H, Shen N, Xiao D, Song X és mtsai. az inzulinrezisztencia szabályozása több MiRNS-sel a GLUT4 jelátviteli út célzásán keresztül. Cell Physiol Biochem. (2016) 38: 2063–78. doi: 10.1159/000445565

47. Zhu XD, Chi JY, Liang HH, Huangfu LT, Guo ZD, Zou H és mtsai. A MicroRNS-377 a ciklosporin A által kiváltott kardiomiocita apoptózist közvetíti. Lehet J Cardiol. (2016) 32: 1249–59. doi: 10.1016/j.cjca.2015.11.012

48. Wallberg-Henriksson H, Zierath JR. GLUT4: kulcsszereplő a glükóz homeosztázis szabályozásában? Betekintés a transzgénikus és a knockout egerekből (áttekintés). Mol Membr Biol. (2001) 18: 205–11. doi: 10.1080/09687680110072131

49. Krook A. Az inzulindózis és az inzulinérzékenység optimalizálásának kiegyenlítő hatása 1-es típusú cukorbetegségben. J Endocrinol. (2011) 211: 1–2. doi: 10.1530/JOE-11-0263

50. Patel OV, Casey T, Dover H, Plaut K. Homeorhetikus alkalmazkodás a laktációhoz: emlő-, máj- és zsírszövet összehasonlító transzkriptómanalízise patkányokban a vemhesség és a laktáció közötti átmenet során. Funct Integr Genomics (2011) 11: 193–202. doi: 10.1007/s10142-010-0193-0

51. Ruan H, Zarnowski MJ, Cushman SW, Lodish HF. Az elsődleges zsírsejtek standard izolálása az egér epididimális zsírpárnákból gyulladásos mediátorokat indukál és lefelé szabályozza az adipocita géneket. J Biol Chem. (2003) 278: 47585–93. doi: 10.1074/jb. M305257200

52. Kahn BB, Rosen AS, Bak JF, Andersen PH, Damsbo P, Lund S és mtsai. A GLUT1 és GLUT4 glükóz transzporterek expressziója inzulinfüggő diabetes mellitusban szenvedő emberek vázizomzatában: metabolikus faktorok szabályozó hatása. J Clin Endocrinol Metab. (1992) 74: 1101–9.

53. Klip A, Tsakiridis T, Marette A, Ortiz PA. A glükóz transzporterek expressziójának szabályozása glükóz segítségével: tanulmányok áttekintése in vivo és sejttenyészetekben. FASEB J. (1994) 8: 43–53.

54. Neufer PD, Carey JO, Dohm GL. A glutóz transzporter GLUT4 génjének transzkripciós szabályozása a vázizomban. A cukorbetegség és az éhezés hatásai. J Biol Chem. (1993) 268: 13824–9.

55. Hager SR, Pastorek D, Jochen AL, Meier D. A GLUT4 mRNS és az inzulinrezisztens patkányok vázizomzatának fehérje-bősége közötti eltérés. Biochem Biophys Res Commun. (1991) 181: 240–5.

56. Szerafim miniszterelnök, Nunes MT, Giannocco G, Machado UF. Az életkorral összefüggő elhízás okozta GLUT4 mRNS poli (A) farokhosszának rövidülése patkány gastrocnemius vázizomzatában. Mol Cell Endocrinol. (2007) 276: 80–7. doi: 10.1016/j.mce.2007.07.004

57. Zhou Y, Gu P, Shi W, Li J, Hao Q, Cao X és mtsai. A MicroRNS-29a inzulinrezisztenciát vált ki azzal, hogy a PPARδ-t a vázizomsejtekbe irányítja. Int J Mol Med. (2016) 37: 931–8. doi: 10.3892/ijmm.2016.2499

58. Guedes EC, França GS, Lino CA, Koyama FC, Moreira Ldo N, Alexandre JG és mtsai. A magas zsírtartalmú diéták által kiváltott szív-átalakításban megváltozik a mikroRNS-expresszió aláírása. J Cell Physiol. (2016) 231: 1771–83. doi: 10.1002/jcp.25280

59. Song H, Ding L, Zhang S, Wang W. A MiR-29 családtagok kölcsönhatásba lépnek a SPARC-val a glükóz metabolizmusának szabályozása érdekében. A MiR-29 családtagok kölcsönhatásba lépnek a SPARC-val a glükóz metabolizmusának szabályozása érdekében. Biochem Biophys Res Commun. (2018) 497: 667–674. doi: 10.1016/j.bbrc.2018.02.129

60. Guo W, Qiu Z, Wang Z, Wang Q, Tan N, Chen T és mtsai. A MiR-199a-5p negatívan kapcsolódik a rosszindulatú daganatokhoz, és szabályozza a glikolízist és a laktáttermelést a hexokináz 2 célzásával májrákban. Hepatológia (2015) 62: 1132–44. doi: 10.1002/hep.27929

61. Zhou Y, Zheng X, Lu J, Chen W, Li X, Zhao L. Cell Physiol Biochem. (2018) 45: 2548–2559. doi: 10.1159/000488273

62. Valinezhad Orang A, Safaralizadeh R, Kazemzadeh-Bavili M. A miRNS által közvetített génszabályozás mechanizmusai a közös downregulációtól az mRNS-specifikus upregulációig. Int J Genomics (2014) 2014: 970607. doi: 10.1155/2014/970607

63. Furuya DT, Neri EA, Poletto AC, Anhê GF, Freitas HS, Campello RS és mtsai. A magfaktor-KB helyek azonosítása az Slc2a4 gén promoterben. Mol Cell Endocrinol. (2013) 370: 87–95. doi: 10.1016/j.mce.2013.01.019

64. Hassan T, Carroll TP, Buckley PG, Cummins R, O'Neill SJ, McElvaney NG és mtsai. Az miR-199a-5p csendesítés szabályozza a kibontakozott fehérje választ krónikus obstruktív tüdőbetegségben és α1-antitripszin hiányban. Am J Respir Crit Care Med. (2014) 189: 263–73. doi: 10.1164/rccm.201306-1151OC

Kulcsszavak: mikroRNS, vázizom, GLUT4, hexokináz, glükóz metabolizmus, glükózfelvétel, NFKB, sztreptozotocin

Idézet: Esteves JV, Yonamine CY, Pinto-Junior DC, Gerlinger-Romero F, Enguita FJ és Machado UF (2018) Diabetes modulálja a 29b-3p, 29c-3p, 199a-5p és 532-3p expressziót az izmokban: lehetséges szerep a GLUT4 és a HK2 Represszióban. Elülső. Endokrinol. 9: 536. doi: 10.3389/fendo.2018.00536

Beérkezett: 2018. június 25 .; Elfogadva: 2018. augusztus 23 .;
Publikálva: 2018. szeptember 12.

Gaetano Santulli, Columbia Egyetem, Egyesült Államok

Maria Felice Brizzi, Università degli Studi di Torino, Olaszország
Eija K. Laakkonen, Jyväskylä Egyetem, Finnország