Határok a molekuláris idegtudományban

Szerkesztette
Andrej Szurgucov

Kansas Egyetem Orvosi Központ, Egyesült Államok

Felülvizsgálta
David Ruskin

Trinity College, Egyesült Államok

Mustapha U. Imam

Zhengzhou Egyetem, Kína

A szerkesztő és a lektorok kapcsolatai a legfrissebbek a Loop kutatási profiljukban, és nem feltétlenül tükrözik a felülvizsgálat idején fennálló helyzetüket.

javítja

  • Cikk letöltése
    • PDF letöltése
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Kiegészítő
      Anyag
  • Exportálás
    • EndNote
    • Referencia menedzser
    • Egyszerű TEXT fájl
    • BibTex
OSZD MEG

Eredeti kutatás CIKK

  • 1 Neurológiai Osztály, Huashan Kórház, Fudan Egyetem, Sanghaj, Kína
  • 2 Neurológiai Osztály, Sanghaji Tizedik Népkórház, Tongji Egyetem, Sanghaj, Kína
  • 3 Állami Géntechnikai Laboratórium, Genetikai és Fejlesztési Együttműködési Innovációs Központ, Élettudományi Iskola, Fudan Egyetem, Sanghaj, Kína
  • 4 Fudani Egyetem Taizhou Egészségtudományi Intézete, Taizhou, Kína

Háttér: A stroke-modellekben beszámoltak a ketogén étrendek (KD) neuroprotektív hatásairól, és a stroke patogenezisében a nukleotid-kötő doménhez (NOD) hasonló receptor fehérje 3 (NLRP3) gyulladásos sejtek is bekapcsolódtak. Ennek a tanulmánynak a célja a KD NLRP3-gyulladásra gyakorolt ​​hatásainak vizsgálata és a lehetséges molekuláris mechanizmusok feltárása volt.

Mód: Ban ben in vivo vizsgálatban az egereket 3 hétig KD-vel etették, majd középső agyi artéria elzáródás/reperfúzió (MCAO/R) sérülésnek vetették alá. Ban ben in vitro vizsgálat során az SH-SY-5Y sejteket β-hidroxi-butiráttal (BHB) kezeltük, majd oxigén – glükóz-nélkülözés/reoxigenáció (OGD/R) következett. Kiértékeltük az NLRP3 gyulladásos aktivációját és a kapcsolódó szabályozási mechanizmusokat.

Eredmények: A KD-vel táplált egereknél nagyobb volt a tolerancia az MCAO/R iránt. A KD gátolta az endoplazmatikus retikulum (ER) stresszt és elnyomta a TXNIP/NLRP3 gyulladásos aktiválódását az agyban. A in vitro tanulmány kimutatta, hogy a BHB (10 mM) megakadályozta a dinaminnal kapcsolatos protein 1 (Drp1) mitokondriális transzlokációját a mitokondriális hasadás gátlásában. Továbbá a BHB csökkentette a reaktív oxigénfajok (ROS) képződését, gátolta az OGD/R-vel kezelt sejtekben az ROS-NLRP3 útvonalat, és elnyomta az ER stressz okozta NLRP3 gyulladásos aktiválódását.

Következtetések: A KD elnyomhatja az ER stresszt és megvédi a mitokondriális integritást azáltal, hogy elnyomja a Drp1 mitokondriális transzlokációját, hogy gátolja az NLRP3 gyulladásos aktivációját, és ezzel neuroprotektív hatásokat fejtsen ki. Eredményeink bizonyítékot szolgáltatnak a KD potenciális alkalmazására az iszkémiás stroke megelőzésében.

Bevezetés

Az iszkémiás stroke-ot, a destruktív agyi érrendszeri megbetegedések egyik vezető okát a zavart véráramlás és az agysejtek glükóz-/oxigénhiánya jellemzi, ami sejtdiszfunkciót eredményezhet (Fisher és Saver, 2015). Az ischaemiás stroke jelenlegi kezelése komplex molekuláris mechanizmusai miatt korlátozott (Barrett et al., 2015). A gyulladás fontos szerepet játszik az ischaemiás stroke patogenezisében, és a jelenlegi vizsgálatokban a nukleotid-kötő domén (NOD) -szerű receptor protein 3 (NLRP3) gyulladásos szerepe volt a stroke-ban (Kawabori és Yenari, 2015). Az NLRP3 gyulladásmolekula egy olyan molekuláris platform, amelyben a gyulladás kiváltására aktiválódnak a gyulladásgátló citokinek (például kaszpáz-1 és interleukin-1β [IL-1β]) (Ogura et al., 2006). Megerősítették, hogy az NLRP3 gyulladásos betegség az ischaemiás stroke kialakulása óta aktiválódik (Fann és mtsai, 2013b), és az NLRP3 gyulladásos betegeket célzó kezelések ígéretesnek bizonyultak a stroke kezelésében (Yang és mtsai, 2014).

Fiziológiai körülmények között az NLRP3 általában az endoplazmatikus retikulumban (ER) lokalizálódik. Aktiválás után az NLRP3 és annak adapterrel apoptózishoz kapcsolódó Speck-szerű fehérje (ASC) transzlokálódik a perinukleáris térbe, ahol együtt lokalizálódnak az ER és a mitokondriális organelle-klaszterekkel (Jo és mtsai, 2016). A mitokondriumok rendkívül dinamikus organellák, amelyek képesek közlekedni, osztódni és összeolvadni. A mitokondriális hasadás és a fúzió ciklusai biztosítják a normális metabolikus és bioenergetikus funkciókat (Bertholet et al., 2016). A mitokondriális hasadás kiválthatja az NLRP3 gyulladást az RNS vírusfertőzés során, amelyben a dinaminnal összefüggő protein1 (Drp1), a mitokondriális hasadás kulcsszabályozója játszik fontos szerepet (Rayamajhi és Miao, 2014). Korábbi tanulmányunk kimutatta, hogy a mitokondriumba transzlokálódó Drp1 közvetítette a mitokondriális hasadást, a Drp1 transzlokáció farmakológiai gátlása pedig megakadályozta a mitokondriális töredezettséget, ezért megvédte az idegsejteket az oxigén – glükóz nélkülözés (OGD) által kiváltott sérüléstől (Zhao et al., 2013). Az a mechanizmus azonban, amely által a Drp1 szabályozza az iszkémiás stroke-ban az NLRP3 által közvetített gyulladást, továbbra sem tisztázott.

Az iszkémiát követően az újonnan szintetizált fehérjék felhalmozódnak, hogy növeljék a kibontakozott fehérje választ (UPR). A súlyos és tartós UPR ER stresszt okozhat. Az IRE1a ER stresszérzékelő tioredoxinnal kölcsönhatásba lépő fehérjét (TXNIP) indukálhat az NLRP3 által közvetített gyulladás és a programozott sejtpusztulás aktiválására (Lerner et al., 2012). A mitokondriális hasadásból keletkező reaktív oxigénfajok (ROS) aktiválhatják az NLRP3 gyulladásos rendszert, hogy súlyosbítsák az ER stresszt, ami tovább rontja a mitokondriális morfológiát és funkciót (Minutoli et al., 2016). Az ER stressz szupressziójáról és/vagy ROS generációjáról is megállapították, hogy enyhíti az NLRP3 által közvetített gyulladást a stroke-ban.

A véráramlás megzavarása és/vagy a vércukor-koncentráció csökkenése iszkémiás stroke-ban agykárosodást okozhat. A keton testek (KB), amelyek magukban foglalják az acetoacetátot és a β-hidroxi-butirátot (BHB), alternatív szubsztrátként szolgálhatnak az agy glükózjánál. A BHB a KB-k egyik fő tagja. Zsírsav oxidációval keletkezik, és a máj mitokondriumában ketogenezissel átalakulhat BHB-vé. Úgy találták, hogy a ketogén étrend (KD) vagy a BHB javítja az agy ödémáját és az infarktus térfogatát a stroke után (Suzuki és mtsai, 2001). Sőt, a BHB megakadályozhatja a glükózmegvonás vagy a hipoxia okozta idegsejtek halálát (Camberos-Luna és mtsai, 2016). A legújabb vizsgálatok azt is feltárják, hogy a BHB képes elnyomni az NLRP3 gyulladásos aktivációját humán hepatoma HepG2 sejtekben és monocitákban (Youm és mtsai, 2015; Bae és mtsai, 2016). Ugyanakkor a KB-k szerepe az iszkémia után az NLRP3 gyulladásos szabályozásában a központi idegrendszerben továbbra sem ismert.

Ebben a tanulmányban a KD és a BHB hatását vizsgálták az NLRP3 gyulladásos egereken, közepes agyi artéria elzáródással (MCAO), illetve OGD/reoxigenizációnak (OGD/R) alávetett SH-SY-5Y sejtekkel, és a potenciális mechanizmus tovább folytatódott feltárt. Eredményeinkből kiderült, hogy a KD és a BHB képes volt javítani az agyi ischaemiát az NLRP3 gyulladásos aktivációjának gátlásával, amelyet a Drp1-közvetített mitokondriális hasadás és az ER stressz gátlásának tulajdonítottak.

Anyagok és metódusok

Állatok és étrendi protokollok

A hím C57BL/6 egereket (4 hetes korban) a Fudani Egyetem Kísérleti Állatközpontjában helyezték el 26 ° C-on, 12 óra/12 óra világos/sötét ciklusokkal, és ad libitum élelmiszerhez és vízhez való hozzáférés. Az egereket véletlenszerűen négy csoportba soroltuk: kontroll csoportba (az egereket standard chow-val etettük [Teklab, 8664]); KD csoport (az egereket magas zsírtartalmú és alacsony szénhidráttartalmú étrenddel etették [ResearchDiets, D12369B]); magas szénhidráttartalmú (HC) étrendcsoport (az egereket alacsony zsírtartalmú, HC-diétával etették [ResearchDiets, D12359]); CP-456773 csoport (egerek egyetlen dózist kaptak orális CP-456773-ból [50 mg/kg, NLRP3 gyulladásgátló, Sigma PZ0280] 3 hétig standard chow-val). Az egereket kijelölt étrendekkel etettük (három étrend összetételét az 1. táblázat mutatja) 3 hétig. A randomizálás előtt az egyes csoportok egereit 18 órán át éheztettük a vércukorszint stabilizálása és a ketózis állapotának elindítása érdekében. Valamennyi eljárást a Kínai Népköztársaság Nemzeti Tudományos Tanácsának útmutatója szerint hajtották végre. A tanulmányt a kínai Sanghaji Fudan Egyetem Etikai Bizottsága hagyta jóvá. Az IRB jóváhagyási száma: „20150572A259”. Ez a kézirat az Animal Research: Reporting (Állatkutatás: Jelentés) szerint készült in vivo Kísérletek (ARRIVE) iránymutatás.

Asztal 1. A tanulmányban alkalmazott egér-diéták makrotápanyag-összetétele.

Az MCAO modell létrehozása

Az egereket ketamin 65 mg/kg és xilazin 6 mg/kg intraperitoneális injekcióval altattuk. Egy bevont filamentumot illesztettek a jobb középső agyi artériába (MCA) 45 perc elzáródáshoz, majd reperfúziót. A testhőmérsékletet 37 ° C-on tartottuk fűtőbetét és visszacsatoló vezérlő rendszer (Bowdoin, ME, USA) használatával. Lézeres Doppler szondát helyeztek a koponyára (5 mm oldalirányban és 2 mm hátul a bregmától), hogy ellenőrizzék az agyi véráramlást (CBF). 3 sejt/üreg egerek). Röviden, 20 μl MTT-oldatot (5 mg/ml) adtunk az egyes mélyedésekhez 0,5 mg/ml végkoncentrációban, majd 4 órán át inkubáltuk. A felülúszót eltávolítottuk, és minden egyes üregbe 150 μl dimetil-szulfoxid-oldatot adtunk, majd 20 percig inkubáltuk. Az abszorbanciát 570 nm-en, referencia hullámhosszon 630 nm-nél mértük. A kísérlet három példányban történt.

ATP mérése

Az ATP keletkezését nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával (HPLC) detektáltuk, amint arról korábban beszámoltunk (Cui és mtsai., 2010). Röviden, a táptalajt eltávolítottuk a sejtekből, és azonnal hozzáadtunk folyékony nitrogént. Jeges bepárlás után 300 µl jéghideg 0,4 mólos perklórsavat adunk mindegyik üreghez. A sejteket összegyűjtöttük, és 14 000-nél centrifugáltuk g 15 percig 4 ° C-on. A felülúszót 1 M K2CO3-tal semlegesítettük, -80 ° C-on tartottuk a perklorát kicsapása céljából, majd centrifugáltuk. A felülúszót HPLC-re gyűjtjük. Egy 12 csatornás CoulArray 5600A-t (ESA Inc.) és egy reverz fázisú oszlopot (Lichrospher-100, Merck) használtunk. A jeleket UV detektorral (# 526, ESA Inc.) detektáltuk 260 nm-en, és a CoulArray analóg bemeneti adapterrel átalakítottuk a CoulArray® szoftverrel végzett elemzés előtt. Minden csúcsterület a standard görbék lineáris tartományán belül volt.

A mitokondriális membránpotenciál mérése

A mitokondriális membránpotenciált (MMP; Δψm) konfokális mikroszkóppal határoztuk meg a tetrametil-rodamin-etil-észter (TMRE) festést követően, a korábban leírtak szerint (Zhao et al., 2013). A kezelés után az SH-SY-5Y sejteket TMRE-vel (végkoncentráció: 50 nM) inkubáltuk 20 percig 37 ° C-on. A fluoreszcenciát a BD FACS Canto ™ II áramlási citometriás rendszerrel (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) detektáltuk. A nem sejttörmelékeket és az elhalt sejteket kikapcsoltuk, és

30 000 eseményt gyűjtöttek elemzés céljából. A sejteket 20 μM karbonil-cianid-4- (trifluor-metoxi) -fenil-hidrazonnal (FCCP) kezeltük 20 percig, hogy Δψm összeomoljon, és a kapott TMRM-fluoreszcenciát használtuk a küszöbérték meghatározásához. Az adatokat a sejtek százalékában fejezzük ki, amelyeknél a jel meghaladja a küszöbértéket.

ROS Assay

Az SH-SY-5Y sejteket 80% -os összefolyásnál a fentiek szerint kezeltük. A sejteket ezután PBS-sel mostuk és ROS Fluorescent Probe-DHE-vel (Vigorous Biotechnology, Peking, Kína) inkubáltuk 30 percig 37 ° C-on. Háromszor hideg PBS-sel végzett mosás után a fluoreszcenciát mikrotányér-leolvasóval mértük 485 nm gerjesztési hullámhosszon és 525 nm emissziós hullámhosszon.

A mitokondriális morfológia értékelése

Az SH-SY-5Y sejteket poli-D-lizinnel bevont fedőlemezeken tenyésztettük. A mitokondriumokat DsRed-Mito (1 μg/60 mm-es edény, Clontech, USA) címkével láttuk el a gyártó utasításai szerint. A sejteket ezután 4% paraformaldehiddel rögzítettük, és a fedőlemezeket Prolong Gold Antifade Reagens és DAPI (Invitrogen) alkalmazásával szereltük fel. A képeket fordított epifluoreszcens mikroszkóppal rögzítettük (Olympus, Tokió, Japán). A túlnyomórészt ép tubuláris mitokondrium hálózattal rendelkező sejteket normálisnak találták. A megszakadt és túlnyomórészt gömb alakú mitokondriumokat tartalmazó sejteket a mitokondriális hasadással rendelkező sejtekként azonosították. A mitokondriumok méretét és alakját vak módon számszerűsítettük ImageJ (NIH kép) alkalmazásával.

Drp1 Translocation

SH-SY-5Y sejteket használtunk a Drp1 transzlokáció vizsgálatához. A sejteket poli-D-lizinnel bevont fedőlemezeken tenyésztettük, és 1 μg DsRed-Mito-val és 1 μg Drp1-myc-vel transzfektáltuk. Az OGD után a sejteket fixáltuk és immunfestést végeztünk anti-myc antitesttel, majd AlexaFluor 488 szekunder antitesttel (Invitrogen). A képeket konfokális mikroszkóppal rögzítettük és elemeztük. Körülbelül 60 sejtet elemeztek csoportonként négy független kísérletben.

Mitokondriális izoláció

A mitokondriumokat a mitokondriális izolációs készlet (Pierce, Rockford, IL, USA) segítségével izoláltuk a gyártó utasításainak megfelelően. Röviden: az SH-SY-5Y sejteket a Dounce homogenizátorban homogenizáltuk, majd 750 ° C-on centrifugáltuk. g 10 percig 4 ° C-on. A felülúszót tovább centrifugáltuk 12 000-nél g 15 percig 4 ° C-on, majd az üledéket mostuk és mitokondriális frakcióként visszatartottuk.

Enzimhez kapcsolt immunszorbens assay (ELISA) assay

Az agyszöveteket (az MCA által szállított agyi régiókat) a kezelés után összegyűjtöttük és 1x PBS-sel öblítettük. A kaszpáz-1 aktivitás vizsgálatához az agyszöveteket lízispufferben (BioVision, Inc., Milpitas, CA, USA) homogenizáltuk, majd 10 000-nél centrifugáltuk g 10 percig, majd a felülúszót összegyűjtjük. Mert in vitro kísérletekben körülbelül 5x106 sejtet gyűjtöttünk össze, szuszpendáltunk 50 μl előhideg lízispufferben, 10 percig jégen inkubáltuk, majd 10 000-nél centrifugáltuk g 1 percig, és a felülúszót összegyűjtjük. A felülúszó fehérjekoncentrációját Bradford-vizsgálattal határoztuk meg. A kaszpáz-1 aktivitás kimutatásához Caspase-1 fluorometriai vizsgálati készletet (BioVision Inc., Milpitas, CA, USA) használtak a gyártók utasításai szerint. Meghatároztuk a fluoreszcencia (kaszpáz-1 aktivitás) többszörös változását, mint a kontroll csoportban.

Az IL-1β méréséhez az agyszöveteket (az MCA által szállított agyi régiókat) 20 ml 1x PBS-ben homogenizáltuk, és a lizátumot összegyűjtöttük. Ezen kívül a sejttenyészet táptalaját is összegyűjtötték a méréshez. A mintákat 5000 ° C-on centrifugáltuk g 5 percig, és a felülúszót összegyűjtjük. Az IL-1β koncentrációt a RayBio ® Human IL-1 β enzimmel kapcsolt immunszorbens assay (ELISA) készlet (RayBiotech, Inc., Norcross, GA, USA) segítségével mértük a gyártó utasításainak megfelelően. Az abszorbanciát 450 nm-nél közvetlenül a stopoldat hozzáadása után mértük.

Western Blotting

Statisztikai analízis

Az adatokat átlagként ± az átlag standard hibájaként (SEM) fejezzük ki. Az összehasonlításokat egy- vagy kétirányú ANOVA-val végezték, amelyet Newman-Keuls követett post hoc páronkénti összehasonlítások tesztelése. A statisztikai elemzést az SPSS 22. verziójával (IBM, Armonk, NY, USA) végeztük. Értéke P # P # P # P 2/4π terület. A képarány a fő/mellék tengelyek mérése. Mindkét érték megközelíti az 1-et, amikor a részecske körkörösebbé válik. Három független kísérletben 10-15 véletlenszerűen kiválasztott sejt kvantifikálását végeztük. Az adatokat átlag ± SEM formában mutatjuk be; *P # P # P # P # P # P # P Kulcsszavak: ketogén diéta, β-hidroxi-butirát, mitokondriális hasadás, endoplazmatikus retikulum stressz, NLRP3 gyulladás, Drp1

Idézet: Guo M, Wang X, Zhao Y, Yang Q, Ding H, Dong Q, Chen X és Cui M (2018) A ketogén diéta javítja az agyi iszkémiás toleranciát és gátolja az NLRP3 gyulladásos aktiválódását a Drp1-közvetített mitokondriális hasadás és az endoplazmatikus retikuláris stressz megelőzésével. . Elülső. Mol. Neurosci. 11:86. doi: 10.3389/fnmol.2018.00086

Beérkezett: 2017. november 29 .; Elfogadva: 2018. március 05 .;
Publikálva: 2018. március 20.

Andrei Surguchov, a Kansasi Egyetem Orvosi Központja, Egyesült Államok

Mustapha Umar Imam, Zhengzhou Egyetem, Kína
David Ruskin, Trinity College, Egyesült Államok

† Ezek a szerzők egyformán járultak hozzá ehhez a munkához.