A Helicobacter pylori fertőzés súlyosbítja a bél mikrobiomjának diszbiózisát gyomorhurutban szenvedő gyermekeknél

Lu Yang

1 Emésztési betegség osztály, Qilu Gyermekkórház, Shandong Egyetem, Jinan, Kína

Jiaming Zhang

2 Shandong Gyermek Mikrobiom Központ, Qilu Gyermekkórház, Shandong Egyetem, Jinan, Kína

Junjie Xu

1 Emésztési betegség osztály, Qilu Gyermekkórház, Shandong Egyetem, Jinan, Kína

Xuxia Wei

1 Emésztési betegség osztály, Qilu Gyermekkórház, Shandong Egyetem, Jinan, Kína

Junjie Yang

3 Élettudományi Főiskola, Qilu Normal University, Jinan, Kína

Yi Liu

2 Shandong Gyermek Mikrobiom Központ, Qilu Gyermekkórház, Shandong Egyetem, Jinan, Kína

4 Gyermekgyógyászati Kutatóintézet, Qilu Gyermekkórház, Shandong Egyetem, Jinan, Kína

Hua Li

1 Emésztési betegség osztály, Qilu Gyermekkórház, Shandong Egyetem, Jinan, Kína

Zhao megváltoztatása

2 Shandong Gyermek Mikrobiom Központ, Qilu Gyermekkórház, Shandong Egyetem, Jinan, Kína

Ying Wang

2 Shandong Gyermek Mikrobiom Központ, Qilu Gyermekkórház, Shandong Egyetem, Jinan, Kína

4 Gyermekgyógyászati Kutatóintézet, Qilu Gyermekkórház, Shandong Egyetem, Jinan, Kína

Lei Zhang

2 Shandong Gyermek Mikrobiom Központ, Qilu Gyermekkórház, Shandong Egyetem, Jinan, Kína

5 Pekingi Advanced Data-Based Precision Medicine Innovációs Központ, Beihang Egyetem, Peking, Kína

Zhongtao Gai

2 Shandong Gyermek Mikrobiom Központ, Qilu Gyermekkórház, Shandong Egyetem, Jinan, Kína

4 Gyermekgyógyászati Kutatóintézet, Qilu Gyermekkórház, Shandong Egyetem, Jinan, Kína

Társított adatok

A tanulmányhoz kapcsolódó összes szekvenálási adatot feltöltötte az NCBI SRA adatbázisába (hozzáférési szám: PRJNA544571). Az SRA adatbázis honlapja: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra.

Absztrakt

Bevezetés: A Helicobacter pylori fertőzés következetesen krónikus és alacsony fokú gyulladásos reakcióhoz vezet a gyomor nyálkahártyájában, és szorosan összefügg a gyomor-bélrendszeri és a gyomoron kívüli betegségekkel. A helyi mikrobiom hatásait a gyomorban H. pylori fertőzésben szenvedő felnőtteknél és gyermekeknél tanulmányozták. Nem ismert azonban, hogy a bél mikrobiális közössége eltér-e a változó H. pylori fertőzésben szenvedő gyermekeknél. A tanulmány célja a H. pylori fertőzés által kiváltott mikrobiom összetételének és gastritisben történő jellemzése.

Anyagok és metódusok: Ebben a tanulmányban 154 személy vett részt, köztük 50, H. pylori által kiváltott gyomorhurut által érintett gyermek, 42 H. pylori-negatív gyomorhurutban szenvedő gyermek és 62 egészséges kontroll. A bél mikrobiom összetételét 16S rRNS génalapú piroszekvenálással elemeztük. Ezután összehasonlítottuk a széklet baktériumok sokféleségét és összetételét.

Eredmények: A hasonlóságok és különbségek elemzése alapján azt találtuk, hogy a H. pylori által kiváltott gyomorhurutban szenvedő gyermekek bélbaktériumok diszbiózist mutattak ki. A Firmicutes/Bacteroidetes (F: B) aránya a törzs szintjén drámai módon csökkent a H. pylori-pozitív gastritis csoportban (HPG) és a H. pylori-negatív gastritis csoportban (HNG), összehasonlítva az egészséges kontroll csoporttal (HCG) . Családi és nemzetségi szinten a Bacteroidaceae és az Enterobacteriaceae relatív bősége elterjedt a HPG és HNG esetében, míg a Lachnospiraceae, a Bifidobacteriaceae és a Lactobacillaceae relatív bőségét a HCG-ben. A bélmikrobiom különböző taxonjainak elterjedtségét osztály, rend, család és nemzetség szintjén is megfigyelték a három csoport között.

Következtetések: A gyomorhurut megváltoztathatja a széklet mikrobiomjának összetételét, amelyet a H. pylori fertőzés súlyosbít. A bél mikrobiomjának ezek a változások összefüggésben lehetnek a gyógyszerrezisztenciával és a krónikus emésztőrendszeri betegségek kialakulásával.

Bevezetés

Anyagok és metódusok

Tanulmányterv és résztvevők

A tanulmány folyamatábra. Kezdetben 210, dyspeptikus tünetekkel küzdő gyermeket és 64 egészséges gyermeket szűrtek át a vizsgálat céljából. 95 személy megtagadta a székletminták adományozását, és további 15 gyermeknek orális kábítószer-kórtörténete volt. Mindet kizárták. A tesztek második részében öt beteg nem volt hajlandó folytatni az összes tesztet, és további három, a gyomor-bélrendszeri fekélyben és/vagy vérzésben szenvedő beteg kimaradt. Az egészséges gyermekek csoportjában a gyermek egyik székletmintája hiányzott, és egy másik orális drogtörténettel rendelkező gyermek kizárt.

Mintagyűjtés, DNS kivonás és szekvenálás

A székletmintákat sterilizált 2 ml-es csövekkel, tiszta jéget tartalmazó jégen, azonnal fagyasztva (30 percen belül) és -80 ° C-on tároltuk az elemzésig. A genomi DNS-t cetil-trimetil-ammónium-bromid (CTAB) módszerrel extraháltuk (Wang X. és mtsai, 2018). Mindegyik mintából 1 μl egyenértékű mennyiséget használtunk fel a DNS mennyiségi meghatározásához a NanoDrop 2000 (Thermo Scientific) alkalmazásával. A bakteriális populáció és a variábilis régió amplifikációjának elemzéséhez a 16S rRNS gén V1 – V2-ét hajtottuk végre. A PCR-t bakteriális univerzális 27F (5'AGAGTTTGATCMTGGCTCAG3 ') 355R (5'GCTGCCTCCCG TAGGAGT 3') primerek alkalmazásával végeztük. A PCR termékeket elektroforézissel ellenőriztük 1% (w/v) agaróz gélben TBE pufferben (Tris, bórsav és EDTA), Genecolour I ™ -nel (Gene-bio) festve és UV-fényben láthatóvá téve. Az amplikonokat először a QIA gyors PCR tisztító készlet (Qiagen, Barcelona, Spanyolország) segítségével tisztítottuk, a NanoDrop 2000 (Thermo Scientific) alkalmazásával számszerűsítettük, majd azonos koncentrációban egyesítettük. Az egyesített amplikonokat (2 nM) ezután szekvenálásnak vetettük alá, az Illumina HiSeq 2500 felhasználásával, az Illumina platform szokásos protokolljainak megfelelően.

A 16S rRNS génszekvencia elemzése

A 16S rRNS génszekvencia páros végű adatsort összeillesztettük és a minőséget FLASH módszerrel szűrtük. Az összes szekvenciaelemzést a Quantitative Insights Into Microbial Ecology (QIIME, 1.9.1 verzió) szoftvercsomagban (Caporaso et al., 2010) végeztük, a QIIME oktatóanyagnak (http://qiime.org/) megfelelően. A kiméra szekvenciákat az usearch61 alkalmazásával távolítottuk el de novo modellekkel. A szekvenciákat a 2013-as Green genes (13_8 kibocsátás) riboszomális adatbázisba csoportosítottuk, 97% -os referenciaadatkészlet. Azokat a szekvenciákat, amelyek nem feleltek meg a referencia egyetlen bejegyzésének sem, ezt követően de novo operatív taxonómiai egységekbe (OTU-k) csoportosították, 97% -os hasonlósággal az UCLUST-szal. A taxonómiát az összes OTU-hoz rendelték a QIIME-n belüli RDP osztályozó és a Greengenes referenciaadatkészlet segítségével (Cole et al., 2009).

Statisztikai analízis

A bél mikrobiómájának sokfélesége három gyermekcsoportban

Összehasonlítottuk a baktériumközösség gazdagságát (bőség-alapú lefedettség-becslő [ACE]) és sokféleségét (Shannon) a HNG, a HPG és a HCG között (2. ábra). Három csoport összehasonlításában nem volt szignifikáns különbség a Shannon és az ACE indexben, kivéve az ACE indexet a HNG és a HCG összehasonlításában (P = 0,0042, 2A. Ábra).

Az alfa sokféleség összehasonlítása (A, Shannon index; és B, ACE index) az OTU profil alapján. A HPG, a HNG és a HCG színe piros, kék és zöld színű. A P-értéket a Wilcoxon rang-összeg teszt segítségével számoltuk ki. HPG, Helicobacter pylori által kiváltott gastritis csoport; HNG, H. pylori-negatív gastritis csoport; HCG, egészséges kontrollcsoport; OUT, operatív taxonómiai egység.

A három csoport béta változatosságát is értékeltük PCoA alkalmazásával, a súlyozatlan UniFrac távolságok alapján. A PCoA kimutatta a mikrobaközösségek klaszterezését a HNG és a HPG (3A. Ábra), a HCG és HNG (3B. Ábra), valamint a HCG és a HPG (3C. Ábra) között. A hasonlóságok elemzésével (ANOSIM) teszteltük, hogy két csoport különbözik-e szignifikánsan a PCoA-ban. Az eredmények azt mutatták, hogy a bél mikrobiómájának szerkezetében szignifikáns különbség volt a HNG és a HPG (P = 0,002, R = 0,055, ANOSIM), a HCG és a HNG (P = 0,001, R = 0,178, ANOSIM), valamint a HCG és HPG (P = 0,001) között. 0,001, R = 0,187, ANOSIM).

A baktériumok béta változatosságának PCoA-ja a súlyozatlan UniFrac távolság alapján. (A) A HPG és a HNG között. (B) HNG és HCG között. (C) A HPG és a HCG között. PCoA, fő koordináta-elemzés; HPG, Helicobacter pylori által kiváltott gastritis csoport; HNG, H. pylori-negatív gastritis csoport; HCG, egészséges kontrollcsoport.

A gyermekek bélmikrobiómájának összetétele mindhárom csoportban

A relatív taxon bőség összehasonlítása a HPG, HNG és HCG között. (A) A relatív taxonok bőségének összehasonlítása a HPG, HNG és HCG között menekültügyi szinten. (B) A relatív taxonok bőségének összehasonlítása a HPG, HNG és HCG között a nemzetség szintjén. (C) Venn-diagram. HPG, Helicobacter pylori által kiváltott gastritis csoport; HNG, H. pylori-negatív gastritis csoport; HCG, egészséges kontrollcsoport.

Differenciális taxonómiai bőség három gyermekcsoportban

A bélmikrobioma prediktív funkciója három gyermekcsoportban

Megjósolt metagenóma funkció a KEGG útvonal elemzése alapján. A kiterjesztett hibasáv diagramok a KEGG útvonalak jelentősen eltérő bőségét mutatják. (A) A HPG és a HNG között. (B) HNG és HCG között. (C) A HPG és a HCG között. Az arány (bal oldal) jelzi az egyes funkcionális jellemzőkkel rendelkező mikrobák lehetséges sokaságát és az egyes jellemzők arányainak különbségét. A körök (jobb oldalon) a baktériumok átlagos aránya (a hatás nagysága) közötti különbséget jelentik, a szomszédos CI-vel (hibasávok). KEGG, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes; HPG, Helicobacter pylori által kiváltott gastritis csoport; HNG, H. pylori-negatív gastritis csoport; HCG, egészséges kontrollcsoport.

Beszélgetések

A mikrobiomák dysbiosisát összefüggésbe hozták a gyomor-bélrendszeri betegségekkel, ideértve a gyomorhurutot is, amelyben a Helicobacter pylori fontos szerepet játszik (He et al., 2016; Minalyan et al., 2017; Sgambato et al., 2017; Gorkiewicz és Moschen, 2018). Bár számos tanulmány foglalkozik a baktériumok biodiverzitásával a felső emésztőrendszerben, a H. pylori fertőzés és a gyomorhurut szerepe a bélbaktériumok közösségében, különösen gyermekeknél, nem ismert. Egy előzetes tanulmány három gyermekgyógyászati csoport összehasonlításával, 16S rRNS génszekvencia-elemzéssel értékelte a H. pylori fertőzés és a gastritis hatását a széklet mikrobiomjára. Ez a tanulmány feltárta (i) a béta diverzitás elemzésének szignifikáns különbségeit a három csoportban, különösen a HPG, HNG és HCG esetében; (ii) Az F: B arány drámai módon csökkent mind a HPG, mind a HNG esetében, magasabb Bacteroidaceae és Enterobacteriaceae, valamint alacsonyabb Lachnospiraceae, Bifidobacteriaceae és Lactobacillaceae mennyiségben, amely szintén megtalálható a HPG-ben és a HNG-ben; és (iii) a HPG-ben nagyobb volt a Betaproteobacteriumok, a Lactobacillales és a Streptococcusok száma, alacsonyabb az Alphaproteobacteriumok, a Megasphaera, mint a HNG. Az eredmények azt mutatják, hogy a H. pylori fertőzés és a gyomorhurut megváltoztathatja a bél mikrobiomját.

Összefoglalva: a fekális mikrobiómát H. pylori befolyásolta gyomorhurutban szenvedő betegeknél. A bélmikrobiom HPG-ben és HCG-ben lévő összetételeinek összehasonlítása azonban megerősítette a székletmikrobiom fenti változását gastritis és H. pylori fertőzés esetén is. Ugyanakkor azt is mutatja, hogy a bélflóra legtöbb változását a gyomorfertőzés okozza. A H. pylori fertőzés okozta tényezők azonban bizonyos speciális baktériumok kvantumában is változásokat okozhatnak. A Streptococcust és a Megasphaera-t bőségesen találták a HPG-ben és a HNG-ben. Ez összhangban áll az emésztési zavarok tüneteivel, amelyeket H. pylori okozta gyomorhurutban és gyakori gyomorhurutban szenvedő betegeknél észleltek (Correa Silva et al., 2016; Jones et al., 2017).

Összegzésképpen: ez a tanulmány először a H. pylori által okozott gastritisben a széklet mikrobiomjának szerkezeti, összetételi és funkcionális dysbiosisát mutatta be. Jelezte, hogy a jelenlegi kezelések a bél mikrobiomját moduláló stratégiákkal kombinálva javíthatják a H. pylori által kiváltott gastritis klinikai eredményét. Az eredmények egyengethetik az utat a nagyobb kohorszú klinikai validációk megkezdésének és a probiotikumokkal végzett terápiás stratégiák kidolgozásának. A tanulmánynak azonban van néhány hiányossága is; például a technológia csak néhány faj esetében pontos, és a gyomornyálkahártya megfelelő mintáját és az egyének vérmintáit nem gyűjtötték össze, hogy összehasonlíthassák ugyanazzal a székletmintával. Ezenkívül az érintett gyermekek száma kevesebb volt. A jövőben nagyobb vizsgálatra van szükség, és részletes klinikai adatokat kell gyűjteni ezen eredmények megerősítésére.

Adatelérhetőségi nyilatkozat

A tanulmányhoz kapcsolódó összes szekvenálási adatot feltöltötte az NCBI SRA adatbázisába (hozzáférési szám: PRJNA544571). Az SRA adatbázis honlapja: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra.

Etikai nyilatkozat

Az emberi résztvevők bevonásával végzett vizsgálatokat a Shandong Egyetem Qilu Gyermekkórházának orvosi etikai bizottsága felülvizsgálta és jóváhagyta. A vizsgálatban való részvételhez írásbeli beleegyező beleegyezést adott a résztvevők törvényes gondviselője/rokonai.