A koleszterin közvetlen hatása az inzulin szekréciójára

Újszerű mechanizmus a hasnyálmirigy β-sejtek diszfunkciójához

  1. Mingming Hao,
  2. W. Steven Head,
  3. Subhadra C. Gunawardana,
  4. Alyssa H. Hasty és
  5. David W. Piston
  1. A Vanderbilt Egyetem Orvosi Központ Molekuláris Élettani és Biofizikai Tanszékéről, Nashville, Tennessee
  1. Levelezési és újranyomtatási kérelmek David W. Pistonhez, a Vanderbilt Egyetem Orvosi Központ Molekuláris Fiziológiai és Biofizikai Tanszékéhez, 735 Light Hall, Nashville, TN 37232. E-mail: dave.pistonvanderbilt.edu

Újszerű mechanizmus a hasnyálmirigy β-sejtek diszfunkciójához

Absztrakt

CÉLKITŰZÉS—A 2-es típusú cukorbetegséget gyakran abnormális vér-lipid- és lipoprotein-szint kíséri, de a hiperlipidémia és a cukorbetegség kapcsolatáról szóló legtöbb tanulmány a szabad zsírsavakra (FFA-k) összpontosított. Ebben a tanulmányban megvizsgáltuk a koleszterin és a hasnyálmirigy-β-sejtek inzulinszekréciójának kapcsolatát, amely független az FFA-k hatásaitól.

hatása

KUTATÁSI TERVEZÉS ÉS MÓDSZEREK- Számos módszert alkalmaztak a koleszterinszint modulálására ép szigetecskékben és tenyésztett β-sejtekben, beleértve egy nemrégiben kifejlesztett egérmodellt, amely magas koleszterinszintet, de normális FFA-szintet mutat. A koleszterin akut és metabolikus megváltoztatását farmakológiai reagensek alkalmazásával végeztük.

EREDMÉNYEK- Közvetlen kapcsolatot találtunk a megnövekedett szérum koleszterinszint és a csökkent inzulin szekréció között, a normális szekréciót a koleszterinszint csökkentése állította helyre. Továbbá bebizonyítjuk, hogy a felesleges koleszterin az anyagcsere csökkentésével szabályozza a szekréciót a megnövekedett neuronális nitrogén-oxid szintáz dimerizáció révén.

KÖVETKEZTETÉSEK- Ez a koleszterin közvetlen hatása a β-sejt anyagcserére új mechanizmusokat nyit meg, amelyek hozzájárulhatnak a β-sejtek diszfunkciójához és a cukorbetegség kialakulásához elhízott betegeknél.

  • 2-DG, 2-dezoxi-glükóz
  • apoE, apolipoprotein E
  • FFA, szabad zsírsav
  • GK, glükokináz
  • GSIS, glükóz-stimulált inzulin szekréció
  • MβCD, metil-β-ciklodextrin
  • nNOS, neuronális nitrogén-oxid szintáz

A koleszterin képes szabályozni a membrán mikrodomainjein keresztüli jelátvitelt és a koleszterin-aktivált transzkripciós faktorok révén a génexpressziót (6). Például az intracelluláris koleszterin szabályozza a glükóz metabolizmusát és a génexpressziót az adipocytákban (7). A GSIS egy bonyolult folyamat, amely a szabályozási tényezők lépcsőjét foglalja magában. A koleszterin téves szabályozása bármely út megszakadásához vezethet, és a szekréciós funkció részleges vagy csaknem teljes elvesztéséhez vezethet. Ez a tanulmány a koleszterinben gazdag membrán mikrodomének működésére összpontosít a GSIS-ben.

Az emlőssejtek plazmamembránjai 30-50% moláris frakciót tartalmaznak a koleszterinből (8). A koleszterin a belső membránokban is gazdagodik (9). A koleszterin alapvető szerepet játszik a membrán szerveződésében, dinamikájában és működésében. Úgy gondolják, hogy hozzájárul a lipidek szoros csomagolásához azáltal, hogy kitölti a lipidmolekulák közötti intersticiális tereket. A membrán mikrodomének kicsi, koleszterinben és szfingolipidekben gazdag membránösszetételek, és telítetlen szénhidrogénláncokkal foszfolipidekben dúsított több folyadékdomainnal együtt léteznek (10). Ezeknek a membrán mikrodoméneknek a képződése csak a koleszterin kritikus koncentrációin belül látható (11). Köztudott, hogy a membrán folyékonyságát és görbületét is erősen modulálja a membránban jelen lévő koleszterin mennyisége (12). A membrán mikrodomainek fokozhatják a sejtek szignalizációját azáltal, hogy lokálisan koncentrálják vagy kizárják a kiválasztott fehérjekomponenseket a membrán meghatározott helyein. Ebben a tanulmányban a GSIS-t vizsgáljuk olyan β-sejtekben, ahol a membrán tulajdonságai megváltoztak a koleszterin kimerülésével vagy túlterhelésével.

A hasnyálmirigy β-sejtjeinek membrán mikrodomainjeinek GSIS-ben való részvételére vonatkozó korlátozott vizsgálatok eddig csak a plazmamembránon lévő fehérjékre összpontosítottak. Kimutatták, hogy a koleszterin kimerülés a K + csatorna KV2.1 és az oldható N-etil-maleimid-érzékeny faktor kötődési fehérjereceptor fehérjék újraeloszlásához vezet a p-sejtekben az oldható doménekben detergens-rezisztensekhez képest, és ezáltal fokozza a GSIS-t (13, 14). A membrán mikrodomainek szintén alapvető szerepet játszanak az interleukin-1β-indukált nitrogén-oxid (NO) felszabadulásában a β-sejtekből (15). E tanulmány eredményeink azt mutatják, hogy a plazmamembránon jelenlévő fehérjék változásain túl a glükokináz (GK) bevonatú glükóz metabolizmust is befolyásolja a koleszterin változás. Itt megmutatjuk, hogy a felesleges sejtkoleszterin közvetlenül kapcsolódik a csökkent GSIS-hez, és hogy a normális szekréció helyreállítható a koleszterin kimerülésével. Továbbá bemutatjuk a GSIS koleszterin-szabályozásának egyik lehetséges mechanizmusát, amely magában foglalja az idegsejt NO-szintáz (nNOS) és a GK aktivitásának módosítását az inzulingranulák koleszterinben gazdag membrán mikrodomainjein keresztül.

KUTATÁSI TERVEZÉS ÉS MÓDSZEREK

Egerek, sejtek és szigetek.

C57BL/6J egereket (Harlan Laboratories, Indianapolis, IN) használtunk, hacsak másképp nem jelezzük. Apolipoprotein E (apoE) -hiányos egereket (ApoE -/-) (B6.129P2-Apoe tm1Unc/J), megfelelő kontroll egereket (C57BL/6J) és nNOS knockout egereket (B6.129S4-Nos1 tm1Plh/J) vásároltunk. a Jackson laboratóriumtól (Bar Harbor, ME). ob/ob; apoE -/- egereket (C57BL/6J háttérrel) ob/+ és apoE -/- egerek keresztezésével állítottunk elő (16). Az összes egeret rágcsáló-chow-n tartottuk (LabDiet 5001, a zsírból származó kalória 12% -a), és a Vanderbilt Intézményi Állattenyésztési és Felhasználási Bizottság irányelveinek megfelelően gondoztuk őket. A 832/13 INS-1 sejtek Dr. Newgard (Duke University, Durham, NC) szíves ajándékai voltak. βTC3 és 832/13 INS-1 inzulinoma sejteket tenyésztettünk és előkészítettük a kísérletekhez, ahogy azt korábban leírtuk (17, 18). A hasnyálmirigy-szigeteket izoláltuk és tenyésztettük laboratóriumunkban kifejlesztett módszerekkel (19).

Koleszterinvizsgálat szigeteken.

A koleszterintartalmat egy 96 üreges lemezen fluorometrikus módszerrel határoztuk meg, enzimhez kapcsolt reakcióval, amelyet az Amplex Red Cholesterol Assay kit (Molecular Probes) reagáltatott. Az izolálást követően a szigeteket két csoportra osztották a koleszterin- és inzulinvizsgálatokhoz. A koleszterinszint méréséhez minden 10 szigetet tartalmazó cső anyagát kloroform/metanol (2: 1; térfogat/térfogat) lipid-extrakciónak vetettük alá, vékony filmre szárítottuk és 60 μl 1x-es oldatban (Amplex Red Koleszterin assay készlet) 0,1% Triton X-100-mal kiegészítve. Ebből 50 μl-t használtak a koleszterin-meghatározáshoz, és 10 μl-t a protein-assay-hez (BCA Protein Assay; Pierce, Rockford, Il).

Glükóz-stimulált inzulin szekréció mérések.

A hasnyálmirigy-szigetek statikus inkubálását az inzulin szekréció mérésére a korábban leírtak szerint végeztük (19). Az inzulin radioimmun vizsgálatokat a Vanderbilt Egyetem Diabetes Kutató és Képző Központ Hormon Core Resource-ja végezte. Az egér szérum összes koleszterint, triglicerideket és szabad zsírsavakat a Vanderbilt Mouse Metabolikus Fenotipizáló Központ lipidmagjával mértük.

Koleszterin-manipuláció.

A metabolikus kimerülés érdekében a szigeteket 3 napig növesztettük metabolikus depletion táptalajban (RPMI-1640; hasonló a tenyészközeghez, de az FBS helyett 10% lipoproteinhiányos szérummal kiegészítve 200 μmol/l mevalonáttal [szükséges a sejtek életképességének fenntartásához] ] és 10 μmol/l mevastatin) a koleszterinszintézis blokkolásához és a koleszterinraktárak kimerüléséhez (20). A metil-β-ciklodextrin (MβCD) (Sigma) általi kimerülés céljából a szigeteket és a β-sejteket 10 mmol/l MβCD-vel inkubáltuk 37 ° C-on 1 órán át, amely eltávolította a koleszterint mind a plazmamembránból, mind az intracelluláris raktárakból, mert az intracelluláris koleszterin kiáramlik. hatékonyan a plazmamembránhoz, ahol az MβCD, mint akceptor gyorsan eltávolítja (9). A koleszterin túlterhelése érdekében a sejteket 10 mmol/l oldható koleszterinnel (Sigma; 1 g ~ 40 mg koleszterint tartalmaz) inkubáltuk 37 ° C-on 1 órán át.

Glükokináz aktivitás vizsgálata.

A GK enzimatikus aktivitását folyamatos spektrofotometrikus sebesség-meghatározási módszerrel (21) mértük 60 mmol/l Tris, 20 mmol/l MgCl, 2,5 mmol/l ditiotreitol, 100 mmol/l KCl, 4 mmol/l adenozin-5′-trifoszfát alkalmazásával., 0,9 mmol/l β-nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát és 10 egység glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz. A GK-aktivitás egy egységét 1 μmol d-glükóz foszforilációjaként definiáljuk percenként d-glükóz-6-foszfáttal pH = 9,0 mellett szobahőmérsékleten. A GK-aktivitást úgy határoztuk meg, hogy a 0,5 mmol/l glükóz koncentrációban mért aktivitást kivontuk a 100 mmol/l glükóz koncentrációjából, hogy a sejtlizátumok hexokináz aktivitását figyelembe vegyük.

Alacsony hőmérsékletű SDS-PAGE.

A sejteket hideg PBS-ben gyűjtöttük össze, és hideg lízispufferben szuszpendáltuk (20 mmol/l HEPES, 100 mmol/l NaCl, 1 mmol/l EDTA, 1% kolát, 1% Triton X-100 és 1x proteáz inhibitor koktél emlősöknek) sejtek [Sigma]). Hideg SDS töltőpuffert (0,05 mol/l Tris-HCl, pH 6,8, 2% SDS, 10% glicerin, 100 mmol/l ditiotreitol és 0,1% brómfenol kék) adtunk a sejtlizátumhoz, és 5 percig inkubáltuk 0 ° C-on. C. A mintákat 6% -os poliakrilamid-gélekre töltöttük, 0 ° C-on elektroforézisnek vetettük alá, és immunoblotolással tettük láthatóvá nNOS monoklonális antitesttel (BD Transduction Laboratories) és peroxidázzal konjugált szekunder antitesttel. A citoplazmatikus és a membránhoz kötött frakciók szétválasztására a digitalonin permeabilizálását a korábban leírtak szerint végeztük (22), azzal a különbséggel, hogy 10 μg/ml-t használtunk 20 μg/ml digitonin helyett.

Statisztikai analízis.

Mivel egérmodelljeinkben a plazma trigliceridszintek is megemelkedtek a megfelelő kontrollokhoz képest (1. táblázat), izolált szigeteket vizsgáltunk, amelyekben a koleszterin specifikusan manipulálható. Annak eldöntésére, hogy a közvetlen koleszterin-kimerülés javíthatja-e az izolált C57BL/6J-szigetek GSIS-jét, az MβCD-t 1 órán keresztül alkalmazták a sejtek koleszterinjének (9) és a mevastatinnak (egy koleszterin-bioszintézis gátló) akut kimerülésének, hogy a tenyészetben több nap alatt metabolikus kimerülést okozzanak ( 20.) Ezekkel a kezelésekkel a szigeti koleszterinszint 30–40% -kal csökkent (2A. Ábra), míg a teljes inzulin tartalom nem változott (2B. Ábra). Az izolált szigetek közvetlen koleszterinszint-csökkentése jelentősen fokozza az inzulin szekrécióját mind az alap, mind a magas glükózkoncentráció alatt (2C. Ábra). Az ob/ob; apoE -/- szigetek koleszterinszint-kimerülése MβCD-vel szintén részben helyreállítja a GSIS-t (1C. Ábra). A GSIS-t (20 mmol/l glükóz) a szigeti koleszterin függvényében mutatjuk be a genetikailag módosított egérmodelleknél (1D. Ábra) vagy az izolált, vad típusú, különböző koleszterinszinttel rendelkező szigeteknél (2D. Ábra). Bár sok tényező befolyásolja az inzulin szekréciót, ezekben az esetekben a szigeti koleszterinszint fordítottan korrelál a β-sejt GSIS-szel.

A glükóz metabolizmus részt vesz a koleszterin által szabályozott GSIS-ben a β-sejtekből.

A koleszterin részt vesz a GK nNOS-szabályozásában.

Korábbi bizonyítékok azt mutatják, hogy a glükóz által stimulált GK transzlokáció magában foglalja az nNOS S-nitrozilezését (29). Annak megállapítására, hogy az nNOS aktivitás befolyásolja-e a GK-t koleszterinhiányos sejtekben, megvizsgáltuk az nNOS aktivitást fluoreszcens NO indikátor, DAF-FM (4-amino-5-metilamino-2 ', 7′-difluor-fluoreszcein) felhasználásával. A 6A. Ábra azt mutatja, hogy az inzulinstimuláció előtti koleszterin kimerülés megakadályozza a kontroll sejtekben megfigyelt NO termelést. Az inzulint itt használták stimulánsként, mert gyorsabb változást okozott az nNOS aktivitásában, mint a glükóz (29). Az NO-termelés gátlása összhangban áll azzal a megfigyeléssel, hogy a lipid mikrodomének MβCD általi megzavarása csökkent NO-kibocsátást eredményez az inzulinszekretáló sejtekből (15). Az MβCD hozzáadása a βTC3 sejtekhez 2 mmol/l glükózban a DAF-FM fluoreszcencia csökkenéséhez vezet, ami azt jelzi, hogy a sejtek NO-tartalma csökken a koleszterinszint kimerülésével (6B. Ábra). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az nNOS aktivitását gátolja a koleszterin kimerülés.

Mivel az MβCD-t alkalmazó koleszterin moduláció 30 percen belül bekövetkezik (30), az nNOS és a GK aktivitására gyakorolt ​​hatása nem valószínű, hogy a gén transzkripciójának vagy a fehérje stabilitásának változásain keresztül hat. Annak megállapításához, hogy a koleszterin kimerülés miként csökkentheti az nNOS aktivitást és felszabadíthatja a GK-t az inzulin granulátumokból, megvizsgáltuk a koleszterinben gazdag membrán mikrodomének szerepét az nNOS tulajdonságainak meghatározásában. Az nNOS az inzulingranulátumokban lokalizálódik a hasnyálmirigy β-sejtjeiben lévő transzmembrán fehérjével, az insolinoma-asszociált 2-es fehérjével való kölcsönhatása révén (31). Az nNOS jellemzése azt mutatta, hogy a natív fehérje homodimer (32), és a dimerizáció feltétlenül szükséges az nNOS aktivitáshoz (33). Így feltételeztünk egy olyan modellt, ahol a koleszterin kimerülés megzavarja az nNOS dimereket, ami viszont gyengíti az nNOS és a GK közötti kapcsolatot, ezáltal felszabadítja a GK-t a citoplazmákba, ahol aktiválódik. A koleszterinfelesleg viszont stabilizálja az nNOS dimereket, és a GK-t megkötve tartja az inzulinszemcsékhez, ahol kevésbé aktív (6C. Ábra).

VITA

Eredményeink azt mutatják, hogy a sejtek koleszterin-feleslege közvetlen szerepet játszik a hasnyálmirigy-szigetek diszfunkciójában, és kulcsfontosságú tényező lehet a 2-es típusú cukorbetegség előrehaladásában. Különböző állatmodellek segítségével megmutatjuk, hogy az emelkedett szérum koleszterinszint koleszterinszint emelkedéshez vezet a hasnyálmirigy-szigeteken. Ennél is fontosabb, hogy a szigeti koleszterinszint közvetlenül és jelentősen befolyásolja a GSIS mértékét, függetlenül az FFA szintjétől. Ennek nagy következményei vannak, mert jelzi a hiperlipidémiát és a 2-es típusú cukorbetegség patogenezisét összekapcsoló új mechanizmus létezését, amely független az FFA-któl. Azt is sugallja, hogy a celluláris koleszterin szabályozása potenciális célpont lehet a hasnyálmirigy β-sejtjeiben a GSIS működésének megőrzését vagy javítását célzó terápiás beavatkozás során.

Kimutatták, hogy az apoE -/- egerekben a VLDL jelentősen megnőtt (36), és a VLDL expozíció az inzulin mRNS szintjének csökkenéséhez vezet a βTC3 sejtekben (37). Nem találtunk azonban szignifikáns különbséget a kontroll és az apoE -/- egerek között sem a plazma inzulinszintjeiben (1. táblázat), sem a teljes szigetecske inzulin tartalmában (1B. Ábra). Az eltérés oka lehet az alkalmazott sejtek különbsége (tenyésztett insulinoma sejtek és szigetek), a VLDL részecskék koleszterin/triglicerid aránya (trigliceridekben gazdag humán VLDL és triglicerid szegény apoE -/- VLDL), vagy az expozíciós idő hossza (rövid távú vagy krónikus). Az ApoE-hiány nagyobb inzulinérzékenységet vált ki (38). Ez magyarázhatja a viszonylag normális glükóz toleranciát az apoE -/- egerekben a vizsgálatunkban megfigyelt csökkent GSIS ellenére.

A koleszterin lipidszerveződésre és sejtfunkciókra gyakorolt ​​mély hatásai miatt a sejtek átfogó mechanizmusokat fogalmaztak meg a membrán koleszterinszintjének szűk tartományban tartására (39). Azon szignáltranszdukciós útvonalak között, amelyekben a koleszterin részt vehet a β-sejtekben, a koleszterinben gazdag membrándomének GSIS-ben betöltött szerepére és egy molekuláris mechanizmusra összpontosítottunk, különös tekintettel a GK nNOS-szabályozására. Adataink azt mutatják, hogy a koleszterin kimerülés az nNOS dimer-monomer arányának változását eredményezi, ami viszont a GK transzlokációját okozza az inzulingranulákból a citoplazmába, ahol aktiválódik. Ezzel szemben a koleszterinfelesleg megakadályozza a GK aktiválódását azáltal, hogy a GK-t az inzulinszemcsékhez köti. További vizsgálatok folynak annak érdekében, hogy további részleteket nyújtsanak az egyéb GSIS útvonalakról, amelyeket a koleszterin moduláció is befolyásolhat.